增加UHRF1的表达降低乳癌细胞的放射敏感性

为了了解基因UHRF1(ubiquitin-like,containing PHD and RING finger domains,1)基因对乳癌细胞的生长、增殖和辐射敏感性的影响,将全长UHRF1基因的cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3中,通过脂质体介导转染入乳癌细胞MDA-MB-231,筛选出UHRF1高表达的细胞株.借助生长曲线、集落形成实验,研究基因转染细胞的生长、增殖能力;通过γ射线辐照后的集落形成实验,观察基因转染对细胞辐射敏感性的影响.实验结果显示,与MDA-MB-231母细胞和转染了pcDNA3"空"质粒的MDA-MB-231/pcDNA3细胞相比,转染有UHRF1基因的MDA-MB-231/UHRF1细胞的生长率和克隆形成率都未有明显改变,但细胞的辐射敏感性明显降低,这些结果首次揭示人类UHRF1基因的表达水平并不影响乳癌细胞MDA-MB-231的生长和增殖能力,但可以调节其辐射敏感性,具体机制有待进一步深入研究.     

光化学法合成高基因转染效率的聚乙烯亚胺

基因转染载体主要分为病毒类载体和非病毒类载体两大类。聚阳离子型纳米凝胶属于非病毒类载体,与病毒类载体相比,其具有低毒、低免疫反应、无基因插入片断大小限制、制备方便、保存容易等优点;和脂质体等非病毒类载体相比,其价格较低,且粒径大小及表面电荷等可由化学反应控制。另外,其转染效率及体内转染的靶向性有可能更好。目前,开展该类载体合成方法的研究越来越多,     

Smac基因对γ射线照射诱导的宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响

将Smac基因全长cDNA转染HeLa细胞,以探讨Smac基因过表达对γ射线诱导的宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响及其可能机制.转染24小时后 Western Blot结果表明,转染Smac基因全长cDNA的HeLa/Smac细胞其Smac基因表达量与转染pcDNA3.1空载体的HeLa/pcDNA3.1细胞Smac基因表达量相比上调,而相反Smac基因的底物Survivin基因表达量下调.γ射线照射后HeLa/Smac细胞与HeLa/pcDNA3.1细胞相比凋亡率显著升高,Caspase-3活性上调,但HeLa/Smac细胞与HeLa/pcDNA3.1细胞相比DNA损伤及修复无显著变化,对细胞周期也无明显影响.     

辐射制备的M-PEIs基因转导载体细胞生物学研究

将辐射制备的M-PEIs纳米凝胶转导质粒短发夹状RNA(shRNA),研究了载体复合物的细胞毒性、shRNA转染效率及对靶基因的表达抑制.结果表明M-PEIs纳米凝胶的细胞毒性较低,可以较高基因转染效率将shRNA转移到细胞内,同时携带的质粒shRNA在靶细胞内具有较长的释放期,转染的shRNA能使肝癌细胞的靶基因失活,有效抑制了靶基因的表达,初步证明辐射制备的M-PEIs纳米凝胶是一种有效的基因治疗载体.     

抗增殖蛋白Tob1对人类宫颈癌细胞系HeLa放射敏感性影响的实验研究

为探讨抗增殖蛋白家族成员Tob1(transducer of ErbB2,1)对宫颈癌细胞系HeLa放射敏感性的影响,构建可表达Tob1基因全长的重组质粒pcDNA3.0-Tob1(pc3/Tob1),采用脂质体介导转染入HeLa细胞,经G418筛选出阳性耐抗克隆。通过集落形成实验研究Tob1对HeLa细胞放射敏感性的影响,借助流式细胞术和WesternBlot法检测相关分子机制。结果显示,较之HeLa母细胞和转染"空"质粒pcDNA3.0的HeLa/pc3细胞,转染pc3/Tob1后HeLa细胞放射敏感性明显增加;Tob1蛋白高表达增加了HeLa细胞中由辐射诱导的细胞凋亡,提高了由辐射引起的Bax蛋白的表达,降低了Bcl2蛋白表达。上述结果提示Tob1提高了HeLa细胞对电离辐射的敏感性,其机制可能与其上调Bax蛋白的表达、下调Bcl2蛋白的表达,从而增加由辐射诱导的细胞凋亡有关。     

靶向MDM2反义寡核苷酸增强肺癌细胞A549的辐射敏感性

放射治疗在肺癌的治疗中起着重要的作用。然而，提高肺癌的治愈率是一个重要的课题。MDM2基因在肿瘤的形成和增殖过程中起着重要的作用，可能是一个重要的靶基因。本研究自行设计了针对MDM2的反义核酸药物，通过RT-PCR和Western blotting检测其抑制效率，然后通过流式细胞仪观察转染细胞受5Gy照射后的细胞死亡情况，MTT观察细胞照射后的增殖能力。结果发现通过反义治疗的策略成功降低了MDM2在肺癌细胞中A549中的表达，这导致了A549细胞辐射敏感性的增加。表明MDM2参与了A549的辐射抗性的形成，靶向MDM2的反义寡核苷酸可以增强肺癌细胞A549的辐射敏感性。     

放射性工作人员外周血CDKN1A基因表达水平调查

采用荧光实时定量RT-PCR技术,对某厂放射性工作人员外周血CDKN1A基因mRNA水平进行调查。结果表明,与对照组相比,放射性工作人员CDKN1A基因mRNA水平差异不显著;外周血白细胞数及分类差异不显著;CDKN1A基因表达水平Ct值约是-βactin的1.6倍。     

辐射基因治疗黑色素瘤的实验研究

研究低剂量辐射结合腺病毒(AdCMV)载体介导的p53基因转导对人黑色素瘤A375细胞系基因转移效率和辐射敏感性的影响.用复制缺陷的重组腺病毒载体(AdCMV-p53)介导入p53基因转染1 Gy X-射线预辐照的A375细胞系,RT-PCR检测mRNA水平,流式细胞仪测定细胞周期阻滞及外源性P53蛋白表达情况,克隆形成率测定辐射后细胞存活率.用携带报道基因的复制缺陷重组腺病毒载体AdCMV-GFP作为对照.实验结果表明,1 Gy X-射线辐照可较高地增加AdCMV-p53对A375细胞的基因转导效率,转导的外源性野生型p53可在A375(wtp53)细胞中高效表达,并诱导细胞周期G1期阻滞;单纯转导p53对A375细胞无明显诱导凋亡和生长抑制效应;而转导p53后给予X-射线辐射,当剂量达到4 Gy及其以上时,48h后AdCMV-p53感染组细胞开始出现明显形态改变,克隆存活率明显低于AdCMV-GFP感染组和未感染组,显示存活曲线下移,4Gy时细胞存活率就减少了1个量级.小剂量辐射既可有效增加AdCMV-p53介导的p53转导,又不会对患者产生明显副作用;转导野生型p53的人黑色素瘤A375细胞系显示P53过表达;过表达的P53蛋白虽然对A375细胞无明显生长抑制及凋亡诱导作用,但可明显增加其辐射敏感性.这表明p53是基因治疗黑色素瘤较好的侯选基因,也为临床上放疗联合基因治疗黑色素瘤提供了实验室依据,即减轻临床上对于辐射敏感性差的肿瘤单纯大剂量照射或单纯基因疗法中rAd-p53制品用量过大而给病人造成的毒副作用.     

137Csγ射线慢性照射对CDKN1A基因表达的影响

采用荧光定量实时RT-PCR方法,137Csγ射线全身慢性照射sD大鼠,研究其血液中白细胞CDKN1A基因mRNA表达水平的变化;测定了转入慢性期的事故受照人员外周血白细胞CDKN1A基因表达水平。结果表明：与对照组相比,0．1、0．2和3．0Gy照射组大鼠CDKN1A基因mRNA表达水平降低,与事故急性受照人员转为慢性期后的结果一致;照射组大鼠白细胞数有降低的趋势,淋巴细胞百分比降低,中性粒和单核细胞百分比增加。结果提示,自细胞计数降低及分类发生变化可能是CDKN1A表达水平降低的原因之一,慢性照射和急性照射的基因表达模式可能不同。     

oSM基因转染结合局部照射对体内黑色素瘤的抑制作用:肿瘤的基因一放射治疗策略

探讨OSM对黑色素瘤体内生长的抑制作用及其在基因－放射治疗中的应用。将人OSM cDNA插入pCI-neo构成OSM表达质粒（pO);Egr-1基因调控序列（Egr-IR)连接于OSM cDNA上游构成辐射诱导性OSM表达质粒（pEO),pO和pEO转染小鼠B16黑色素瘤细胞,筛选出OSM表达细胞（pO-17和pEO-1)皮下接种C57小鼠,观察和比较相同生长期内瘤体重量及给予60Co γ射线局部照射后肿瘤抑制率的变化。结果表明;在未照射实验中,pO-17和pEO-1细胞接种20d后的瘤体较对照组明显降低;在照射实验中,pEO-1细胞照射后7d瘤体重量的下降最为显著,肿瘤抑制率较未照射时提高42．3％,说明转基因分泌的OSM可对瘤细胞的体内生长产生抑制。γ射线可通过Egr-1R增强OSM表达的途径,加剧对肿瘤的抑制,体现出基因－放射治疗的效果。     

Radio-resistance induced by nitric oxide to heavy ion irradiation in A172 human glioma cells

To investigate effects of nitric oxide on cellular radio-sensitivity, three human glioma cell lines, i.e. A172, A172 transfected green fluorescence protein (EGFP) gene (EA172) and A172 transfected inducible nitric oxide synthesis (iNOS) gene (iA172), were irradiated by 12C6 ions to 0, 1 or 2Gy. Productions of nitric oxide and glutathione (GSH) in A172, EA172 and iA172 were determined by chemical methods, cell cycle was analyzed by flow cytometry at the 24th hour after irradiation, and survival fraction of the cells was measured by colorimetric MTT assay at the 5th day after irradiation. The results showed that the concentrations of nitric oxide and GSH in iA172 were significantly higher than in A172 and EA172; the G2/M stage arrest induced by the 12C6 ion irradiation was observed in A172 and EA172 but not in iA172 at the 24th hour after exposure; and the survival fraction of iA172 was higher than that of EA172 and iA172. Data suggest that the radio-sensitivity of the A172 was reduced after the iNOS gene transfection. The increase of GSH production and the change of cellular signals such as the cell cycle control induced by nitric oxide may be involved in this radio-resistance.     

NOX 4对高糖代谢乳腺癌细胞侵袭转移能力的作用

利用2-氟［¹⁸F-2］脱氧葡萄糖（［¹⁸F］fluorodeoxyglucose,¹⁸F-FDG）乳腺癌细胞摄取实验筛选高糖酵解率的乳腺癌细胞;采用基因沉默技术,降低细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4 (NOX 4)表达;采用免疫印迹方法检测三组细胞（空白对照组、非特异性siRNA转染组和特异性NOX 4-siRNA转染组）的上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition, EMT）相关分子HIF-1α和TGF-β表达水平;通过细胞侵袭实验分析三组细胞的侵袭能力差异。结果显示,高侵袭力的MDA-MB-231较低侵袭力的MCF-7乳腺癌细胞系具有高糖酵解率（t=10.52,P<0.05）;抑制MDA-MB-231细胞的NOX 4表达,降低了细胞EMT相关因子HIF-1α、TGF-β表达（P均<0.01）与细胞侵袭能力（t=-8.0, P<0.01）。本研究初步证实NOX 4失活能够降低高糖代谢乳腺癌细胞的侵袭转移能力。     

干扰ATM基因表达增强胃癌细胞AGS的放射敏感性

为探讨RNA干扰共济失调毛细血管扩张性突变(Ataxia-telangiectasia mutated,ATM)基因表达后对胃癌细胞AGS放射敏感性的影响,通过构建ATM基因RNA干扰质粒转染AGS细胞,获得干扰效率高的克隆细胞AGS-Ri-ATM,并采用RT-PCR和Western blot分别检测m RNA和蛋白表达水平,平板克隆形成实验观察细胞经放射后对细胞生长的影响,流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况。检测结果显示其ATM基因表达被干扰下调。经X射线照射至不同吸收剂量,AGS-Ri-ATM平板克隆形成数量/率远低于AGS-Vector的平板克隆形成数量/率,差异显著(p0.05),具有统计学意义。流式细胞术检测显示当吸收剂量为4 Gy时,AGS-Ri-ATM被阻滞在G1期,同时在12 h后出现明显的凋亡想象。结果表明,ATM基因被干扰后可以诱导细胞周期的阻滞,以及凋亡的增加而增强AGS细胞的放射敏感性。     

放射敏感性启动子调控CD基因/5-FC自杀系统慢病毒载体的构建及125I诱导表达的研究

合成了含8个CArG元件的放射敏感性启动子E8,将其连接于胞嘧啶脱氨酶（Cytosine Deaminase, CD）基因及GFP报告基因上游,构建了重组慢病毒载体pGC-FU-E8-codA-GFP。与慢病毒包装系统共转染293T细胞包装重组慢病毒颗粒E8-codA-GFP LV,研究重组慢病毒感染EJ细胞在不同剂量¹²⁵I的电离辐射下绿色荧光表达情况及其将5-FC转化为5-FU的能力。结果显示：构建的含有E8启动子及CD基因的重组慢病毒载体,包装的重组慢病毒滴度为2×10⁸TU/mL;经¹²⁵I照射的重组慢病毒感染EJ细胞均可观察到绿色荧光,其细胞上清液均可检测到5-FC转化成的5-FU紫外峰,其中55.5 kBq及74.0 kBq ¹²⁵I照射的细胞组绿色荧光明显,148 kBq ¹²⁵I照射的细胞组,其5-FU紫外峰最为明显。以上结果表明：本工作所构建的放射敏感性启动子调控CD基因/5-FC自杀系统重组慢病毒载体具有电离辐射调控作用,可在¹²⁵I的电离辐射作用下诱导下游基因表达,为放射性核素¹²⁵I联合CD基因/5-FC自杀系统对肿瘤细胞的治疗作用研究提供了实验基础。     

耐辐射球菌PprI蛋白质表达及其纯化的实验研究

为了在大肠杆菌中高效表达耐辐射球菌PprI融合蛋白并进行纯化,本研究以PCMV-HA-pprI质粒为模板,PCR扩增pprI基因全序列,经NcoI和EcoRI双酶切后定向克隆到pET-28a表达载体中,构建重组原核表达质粒pET-28a-His-pprI,并转入E.coli BL21(DE3)RP.IPTG诱导融合蛋白...     

Microarray screening of differentially expressed genes in DCX transfected U87 cells before and after irradiation

Radiation therapy plays a critical role in the treatment of neurogliocytoma and it is known that doublecortin (DCX)-transfected U87 cells can inhibit tumor cell growth. Microarray analysis to screen for differentially expressed genes in DCX-transfected U87 cells before and after radiation uncovered DCX-related genes, the functions of DCX, and downstream genes in radiation therapy of neurogliocytoma. Stably transfected U87 cells were constructed (DCX-U87) and the differentially expressed genes were screened by microarray analysis to compare U87 cells with DCX-U87 cells in both non-irradiated and irradiated conditions. Cells were irradiated using 60Co γ-ray at a dose rate of 1.0 Gy/min. Mean values were subject to paired comparison analysis and genes with a p-value of less than 0.05 were analyzed. Differentially expressed genes can correlate with radiation sensitivity and DCX transfection. DCX and SPN proteins in DCX-U87 cells were detected by two groups of 0 and 10 Gy, but not the U87 cells, and their expression levels were higher in the 10 Gy group than in the 0 Gy group. The differential gene expression in DCX-U87 cells before and after radiation is helpful for future investigations into the mechanisms of radiation therapy in neurogliocytoma cells.     

盐诱导激酶2对电离辐射诱导的自噬与凋亡的影响

为探索盐诱导激酶2(salt-inducible kinase 2, SIK2)对电离辐射引起的自噬与凋亡的影响,以期为肿瘤的放射治疗提供新的思路,以慢病毒颗粒LV-GFP和LV-SIK2体外转染HeLa细胞,48 h后用荧光显微镜观察转染是否成功,RT-PCR和Western blot检测转染细胞SIK2的干扰效果。通过Western blot检测SIK2低表达对8 Gy ⁶⁰Co γ射线照射下细胞中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ 和P62表达的影响来观察自噬的变化;利用流式细胞术来检测SIK2低表达对8 Gy ⁶⁰Co γ射线照射下细胞凋亡的影响。结果表明,SIK2低表达的稳转细胞系被成功构建;8 Gy γ射线照射后,SIK2低表达细胞系LC3-Ⅱ表达下调,P62表达上调,表明自噬被减弱;流式细胞术检测发现SIK2低表达细胞系在照后12 h FITC⁺PI^-细胞比例就显著增加,表明SIK2低表达增加了细胞凋亡。因此,SIK2低表达会导致电离辐射引起的细胞自噬大大减弱,凋亡显著增加。     

信号转导和转录激活子5信号转导途径对受辐射KG-1细胞周期的调控作用

探讨信号转导和转录激活子５（ＳＴＡＴ５）信号转导途径在受辐射ＫＧ－１细胞中对细胞周期的调控作用。通过转染ＳＴＡＴ５基因的显性负突变体（ＤＮ－ＳＴＡＴ５）阻断ＪＡＫ／ＳＴＡＴ的信号传递后,瞬间转染ｃｙｃｌｉｎＤ１基因及ｃｙｃｌｉｎＢ１基因,观察ｃｙｃｌｉｎＤ１蛋白及ｃｙｃｌｉｎＢ１蛋白对受辐射细胞周期阻滞的影响作用。转染ＤＮ－ＳＴＳＡＴ５基因的受辐射ＫＧ－１细胞即使用粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）刺激亦不能跳出Ｇ１期阻滞;瞬间转染ｃｙｃｌｉｎＤ１基因及ｃｙｃｌｉｎＢ１基因分别能促进受辐射细胞跳出Ｇ１期和Ｇ２期阻滞。ＧＭ－ＣＳ所激活的ＪＡＫ／ＳＴＡＴ信号转导途径通过促进周期蛋白ｃｙｃｌｉｎＤ１及ｃｙｃｌｉｎＢ１的表达而对受辐射细胞周期进行调控。     

^125I—抗Tg—McAb与甲状腺癌细胞结合的体外实验研究

选用自制的１８Ａ１和１８Ａ１１两株ＭｃＡｂ进行体外活细胞结合实验,定量观察＾１２５Ｉ标记的１８Ａ１和１８Ａ１１与正常甲状腺组织细胞及某些肿瘤细胞膜结合的反应性。实验结果显示,＾１２５Ｉ－抗Ｔｇ－ＭｃＡｂ与高分化甲癌细胞的结合率均〉３０％;与髓样癌结合率为８％－１２％;与正常甲状腺和甲状腺良性瘤细胞结合率〈１０％;其他细胞均〈４％。碘标记ＭｃＡｂ与正常甲状腺和甲状腺良性瘤细胞的结合率显著低于高分化甲     

pEgr-ssEndostatin的构建及其在体外的辐射诱导表达

为探讨pEgr-ssEndostatin重组质粒转染B16细胞后接受不同辐射剂量以及接受同一剂量不同时程endostatin表达的规律。采用RT-PCR方法从鼠肝脏中扩增出Endostatin cDNA,连入信号肽,构建了pEgr-ssEndostatin重组质粒,用脂质体介导的转染法转染小鼠B16细胞,用ELISA方法检测B16细胞上清中endostatin的表达水平。结果表明的分泌型Endostatin序列与报道完全一致,Egr-1启动子和Endostatin cDNA正确插入表达载体pcDNA3．1;pEfr-ssEndostatin具有辐射诱导表达特性。提示小鼠Endostatin基因成功地被克隆和表达,Egr-1启动子具有辐射激活和诱导下游基因表达增强的功能。