Hedgehog信号通路与Snail在肝癌细胞系中的表达及意义

目的 探讨Hedgehog(Hh)信号通路在各种肝癌细胞系中的表达及其与Snail蛋白的关系.方法 用RT-PCR检测了Hh信号通路分子Shh、Ihh、Ptch-1、Smo、Gli-1、Gli-2、Gli-3 mRNA在4种肝癌细胞系HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh-7和永生化肝细胞系L02中的表达情况,应用Western blot检测了Snail蛋白在SMMC-7721和L02细胞中的表达差异.结果 RT-PCR结果显示Hedgehog信号通路分子mRNA在肝癌细胞株中呈高表达,并以Shh信号为主;Gli-2在SMMC-7721细胞中表达最显著,而在正常肝细胞株L02中表达最弱,两者差异显著(P<0.01).Snail蛋白在SMMC-7721细胞中的表达显著高于L02细胞(P<0.05),且与Gli-2的表达呈正相关(P<0.05).结论 Hh信号通路可能通过Gli-2上调Snail的表达,增强肝癌细胞增殖力和侵袭力,促进肝细胞癌的发生和发展.     

环巴胺对佐剂性关节炎大鼠关节软骨细胞增殖凋亡的影响及其抗凋亡机制

目的：研究Hedgehog( Hh)信号通路阻断剂环巴胺对佐剂性关节炎(AIA)大鼠关节软骨细胞增殖凋亡的影响及抗凋亡机制。方法弗氏完全佐剂诱导AIA大鼠模型,胰酶-胶原酶法分离培养关节软骨细胞,环巴胺体外给药处理AIA软骨细胞,MTT法检测细胞增殖,DNA电泳、Hoechst染色、Annexin V-FITC/PI 双染检测细胞凋亡, RT-PCR 检测Shh、Gli1、Ptch1、Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 mRNA 的表达。结果环巴胺(0.08、0.4、2、10、50μmol/L)剂量依赖性地提高AIA软骨细胞增殖。 AIA组可见凋亡细胞DNA梯状条带,环巴胺(0.4、2、10μmol/L)给药组的梯状条带明显减少;AIA组存在核碎裂与染色质固缩,环巴胺给药组均匀蓝色荧光的细胞数量增多;流式分析结果表明AIA软骨细胞凋亡率显著升高,环巴胺明显减少细胞凋亡率;与正常组相比, AIA组软骨细胞中Hh信号通路相关基因( Shh、Ptch1、Gli1) mRNA表达显著升高,抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达显著下降,而促凋亡基因Bax、Caspase-3 mRNA表达明显升高。环巴胺体外给药能抑制Hh信号通路过度活化,提高Bcl-2 mR-NA表达,并降低Bax、Caspase-3 mRNA表达。结论环巴胺体外给药能促进AIA软骨细胞的增殖,并抑制AIA软骨细胞的过度凋亡;该抗凋亡作用和调节Bcl-2、Bax和Caspase-3表达密切相关,提示干预软骨细胞Hh信号通路对保护类风湿关节炎关节软骨具有潜在的治疗意义。     

Gli-1 siRNA对PANC-1增殖及凋亡的影响

目的以Gli-1 siRNA转染胰腺癌细胞系PANC-1,研究其阻断Hh-Gli-1信号通路的作用效果,并观察其对靶细胞增殖及凋亡的影响。方法实验组以Gli-1 siRNA转染PANC-1细胞,转染后24h采用RT-PCR检测Gli-1表达水平的变化,MTT法测定细胞生长曲线观察细胞增殖的抑制情况,同时设立阴性对照组和空白对照组。结果相对于阴性对照组和空白对照组,Gli-1 siRNA可以明显减少Gli-1 mRNA的表达（P〈0.01）,抑制PANC-1细胞的增殖（P〈0.01）。结论实验初步证明Gli-1 siRNA通过阻断Gli-1 mRNA的转录,阻止下游基因的表达,从而抑制PANC-1的增殖并诱导细胞凋亡。     

纤毛中Hedgehog信号调控机制研究进展

纤毛是多种信号通路的重要调节者,对Hedgehog(Hh)信号通路也起着至关重要的调控作用.研究表明Hh信号通路与鞭毛内转运密切相关,遗传学与细胞生物学的相关研究也表明了Hh信号对初级纤毛有依赖性.Hh信号通路的核心元件都定位于纤毛上,并通过鞭毛内转运实现其对信号刺激的应答,最终影响Hh基因的转录,而精子鞭毛的结构与纤毛类似,纤毛疾病也会造成精子鞭毛运动功能障碍.纤毛不动综合征等纤毛结构与功能的异常都会影响Hh通路,其诸多调节因子如Foxjl等对纤毛形成机制有重要意义,也为治疗不育症及避孕等相关措施研究提供了新思路.文章对纤毛中Hh信号调控机制研究进展进行综述     

环巴胺对人食管癌EC109细胞转移的影响及作用机制

目的探讨环巴胺特异性阻断人食管癌EC109细胞Hedgehog（Hh）信号通路后对其转移能力的影响及其可能的机制。方
法环巴胺处理EC109细胞48h后,采用Transwell小室、血管生成实验观察细胞的迁移、侵袭及血管形成等转移能力,RT-PCR
检测Gli-1mRNA的表达,Western blot检测Gli-1、MMP-9、VEGF蛋白的表达。结果环巴胺阻断Hh信号通路能显著减弱EC109
细胞迁移、侵袭及血管形成能力（P<0.05）;Gli-1mRNA表达量降低,Gli-1、MMP-9、VEGF蛋白的表达量均降低,差异有统计学
意义（P均<0.05）。结论环巴胺能显著抑制EC109细胞的转移能力,其可能机制与抑制Gli-1进而使下游MMP-9、VEGF表达下
调有关。
     

瑞香素对TNF-α刺激的HaCaT角质形成细胞炎症因子表达的影响

目的观察瑞香素对TNF-α刺激的HaCaT角质形成细胞炎症因子表达的影响,并初步探讨其机制。方法细胞活力检测采用CCK-8检测试剂盒。实时荧光定量PCR检测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8和MCP-1 mRNA的水平。Western blotting检测p65和p-p65的蛋白水平变化。结果 20μM以下瑞香素处理HaCaT角质形成细胞24小时未表现出明显的细胞毒性。TNF-α刺激能显著促进HaCaT角质形成细胞IL-1β(P0.05)、IL-6(P0.001)、TNF-α(P0.05)、IL-8(P0.05)和MCP-1(P0.05)的表达;而瑞香素(20μM)联合处理能减弱TNF-α刺激所引起的炎症因子表达升高。TNF-α处理能够诱导p65磷酸化,而瑞香素(20μM)联合处理能够抑制p65的磷酸化。结论瑞香素对TNF-α诱导的HaCaT角质形成细胞炎症反应具有抑制作用,而这种抑制作用与NF-κB信号通路的抑制相关。     

紫草素对HaCaT细胞Notch-1信号通路的调节作用

目的研究紫草素对HaCaT细胞抑制增殖的作用及其作用机制。方法倒置显微镜下观察不同浓度紫草素（0、2、5、10、15滋mol/L）作用后HaCaT细胞的形态学改变;MTT法检测紫草素对HaCaT细胞抑制增殖的作用;流式细胞术检测细胞凋亡率变化;Westernblot法检测Notch-1、Jagged1和Hes5蛋白的表达情况。RT-PCR检测下游信号分子Hes1和Hes5的mRNA表达。结果10滋mol/L紫草素即可显著抑制HaCaT细胞的增殖,且随着浓度的增加,紫草素呈剂量依赖性地抑制HaCaT细胞的增殖（均P＜0.01）。流式细胞术检测结果显示10滋mol/L紫草素能够显著诱导HaCaT细胞凋亡（P＜0.01）。Westernbolt法检测结果显示,Notch-1、Jagged1和Hes5蛋白表达逐渐降低。RT-PCR法检测结果显示,Notch信号通路下游信号分子Hes1和Hes5的mRNA表达水平亦呈剂量依赖性降低。结论紫草素呈剂量依赖性地抑制HaCaT细胞的增殖,并诱导细胞凋亡,Notch-1信号通路在其中起了重要作用。     

调控Gpc1表达对神经胶质瘤细胞增殖的影响及其机制的初步研究

目的：探讨调控Glypican1（Gpc1）表达对神经胶质瘤细胞株增殖能力的影响以及Hedgehog（Hh）通路在其中的作用,为神经胶质瘤的研究提供基础实验数据。方法：在４株人脑神经胶质瘤细胞中,采用Western blot挑选出Hh信号通路活性及Gpc1表达相对较高的细胞株,采用RNAi技术沉默Gpc1表达后,检测Hh信号通路关键分子Shh、Gli1和靶基因CyclinD1表达的变化,MTT法检测Gpc1 RNAi稳定细胞株增殖活力的改变;另构建Gpc1过表达质粒,检测对Hh信号通路活性改变。结果：采用RNAi沉默Gpc1表达后,Hh信号通路活性受到抑制（F=8 407.34,P=0.000）,神经胶质瘤细胞株增殖活力下降（F=27.68,P=0.000）;上述结果可被Gpc1过表达所逆转。结论：Gpc1对神经胶质瘤细胞株的增殖能力有着明显的调节作用且该调节受Hh信号通路介导。     

PAMD对人胰腺癌Hh信号通路中Smo、Gli-1mRNA和蛋白表达的影响

目的:探讨蝙蝠葛酚性碱(PAMD)对人胰腺癌BxPC-3细胞的增殖抑制作用,以及通过观察PAMD对胰腺癌BxPC-3细胞Hedgehog信号传导通路中Smo、Gli-1mRNA和蛋白表达的影响,进一步讨论PAMD对胰腺癌Hh信号通路的作用机制及其作用靶点。方法:对人胰腺癌BxPC-3细胞进行体外培养,以终浓度为80、40μg/mL的PAMD培养液以及5-FU终浓度为50μg/mL进行干预,进行以下实验:(1)利用台盼蓝染色测定各组中BxPC-3细胞不同时间点的活细胞数;(2)运用MTT法检测各给药组对BxPC-3细胞增殖抑制情况;(3)利用RT-PCR、Western Blot技术检测各组BxPC-3细胞中Smo、Gli-1mRNA及蛋白的表达。结果:(1)与对照组相比,BxPC-3细胞生长缓慢;(2)PAMD高、低及5-FU组细胞的增殖抑制率分别为71.15%、43.44%、55.38%;(3)PAMD高、低剂量组及5-FU组BxPC-3细胞中的Smo、Gli-1mRNA及蛋白表达降低,差异具有统计学意义(P0.01)。结论:PAMD对人胰腺癌BxPC-3细胞有增殖抑制作用,对Hedgehog信号通路中相关蛋白的表达有抑制作用。因此我们推断,PAMD对胰腺癌的增殖抑制作用机制可能与Hedgehog信号通路有关。     

Akt1/p27kip1途径介导脂氧素A4抑制TNF-α所致的系膜细胞增殖

目的：研究脂氧素A4(LXA4)是否抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)所致的肾小球系膜细胞增殖，并探讨LXA4作用的信号转导机制。方法：用不同浓度的脂氧素A4预外理培养的大鼠肾小球系膜细胞，再加入TNF-α(10ng／m1)共同孵育；或单用TNF-α刺激肾小球系膜细胞。用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖；用RT-PCR法检测细胞周期素E与mRNA表达；用Westemblot检测308位苏氨酸(Thr308)磷酸化的蛋白激酶Aktl及细胞周期负调控蛋白P27^kipl表达量。结果：LXA4呈剂量依赖性地抑制TNF-α诱导的系膜细胞增殖。在系膜细胞增殖同时TNF-α引起的细胞周期素E的蛋白表达也被LXA4下调。LXA4减少TNF-α诱导的肾小球系膜细胞中308位苏氨酸磷酸化的Akt1蛋白。LXA4呈剂量依赖性地阻止TNF-α所致的P27^kipl表达下调。结论：LXA4能够抑制TNF-α所致的大鼠系膜细胞的增殖，其机制依赖于Akt1／P27^kipl信号转导途径。     

银杏叶提取物对枯否细胞表达肿瘤坏死因子-α的影响

目的:观察银杏叶提取物对枯否细胞(KC)分泌和表达肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响。方法:用脂多糖刺激大鼠肝脏来源的KC,与不同浓度的银杏叶提取物进行培养,采用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附测定(ELISA)方法分别检测枯否细胞TNF-αmRNA和蛋白质表达。结果:银杏叶提取物对大鼠肝脏来源的KC的TNF-α及其蛋白质表达呈浓度依赖性,随着银杏叶提取物的浓度的增加,TNF-α的mRNA及其蛋白质表达逐渐减少。结论:银杏叶提取物可以通过调节枯否细胞表达TNF-α发挥抗炎保护肝细胞的作用。     

SHH、Gli-1、MMP-2在胃癌组织中的表达及临床意义

目的：探讨胃癌组织中刺猬信号通路（Hedgehog signaling pathway,Hh）中的音猬因子（Sonic hedgehog,Shh）和胶质瘤相关癌基因同源物-1（Glioma-associated oncogene homolog -1,Gli-1）与金属基质蛋白酶-2（Matrix metalloproteinase-2,MMP-2）的表达和临床意义。方法采用免疫组织化学方法检测40例人胃癌组织、人胃息肉组织和40例正常胃黏膜组织中音猬因子、胶质瘤相关癌基因同源物-1、金属基质蛋白酶-2蛋白的表达。结果胃癌组织中音猬因子、胶质瘤相关癌基因同源物-1、金属基质蛋白酶-2的阳性表达率分别为62.5％、67.5％、72.5％,高于胃息肉组织（阳性表达率分别为27.5％、37.5％、32.5％）和正常胃黏膜组织（阳性表达率分别为22.5％、17.5％、12.5％）（P＜0.05）;以上三者的表达与患者性别、年龄、组织学类型无关（P＞0.05）;而与分化程度、浸润深度、淋巴结转移相关（P＜0.05）;音猬因子、胶质瘤相关癌基因同源物-1、金属基质蛋白酶-2表达呈正相关。结论刺猬信号通路可能通过某些机制可上调金属基质蛋白酶-2的表达,从而增强胃癌的侵袭性。联合检测胃癌组织中音猬因子、胶质瘤相关癌基因同源物-1、金属基质蛋白酶-2的表达水平在一定程度上可以作为胃癌预后的客观参考指标。     

IPI-926对人结肠癌HT-29细胞增殖的影响及其机制

目的 观察IPI-926对人结肠癌HT-29细胞增殖的影响,并探讨在人结肠癌HT-29细胞增殖过程中IPI-926对Hedgehog (刺猬,Hh)信号通路因子表达的影响。 方法 常规体外培养人结肠癌HT-29细胞,随机分为对照组(空白培养基)和不同浓度IPI-926(10 nM、20 nM、30 nM)的实验组,培养HT-29细胞72 h后倒置显微镜观察各组细胞形态变化;MTT法测定各组培养72 h后HT-29细胞抑制率;RT-PCR和Western blot分别检测各组培养72 h后HT-29细胞Shh、Ptch、Smo和Gli-1 mRNA及其相关蛋白的表达;采用独立样本t检验进行组间比较,P<0.05为差异有统计学意义。 结果 对照组细胞生长状态良好;而用不同浓度IPI-926(10 nM、20 nM、30 nM)处理的HT-29细胞细胞凋亡增加,并随着IPI-926浓度的增加,凋亡率明显升高;10 nM、20 nM、30 nM浓度的IPI-926对人结肠癌细胞HT-29抑制率分别为(17.23±1.32)%、(38.34±1.82)%和(75.81±3.43)%,随着浓度的增加而升高,抑制率呈量效关系。空白对照组和IPI-926浓度为10 nM时Shh、Ptch、Smo和Gli-1的mRNA及其蛋白表达差异均无统计学意义,但在IPI-926浓度为20 nM和30 nM时,Shh、Ptch、Smo和Gli-1的mRNA及其蛋白表达均比空白对照组明显下调,并且IPI-926浓度为30 nM时的Shh、Ptch、Smo和Gli-1的表达明显高于20 nM时的mRNA表达。 结论 小剂量IPI-926不能有效抑制HT-29细胞的增殖,但当超过20 nM时则可以有效抑制HT-29细胞的增殖;其抑制的机制可能与Hh通路相关成员Shh、Ptch、Smo和Gli-1的表达有关。      

大黄素治疗类风湿关节炎的作用机制：基于网络药理学方法

目的 基于网络药理学方法,运用在线数据库研究大黄素治疗类风湿关节炎的作用机制,并在成纤维样滑膜细胞细胞系中进行验证。方法 通过Targetnet、SwissTargetPrediction、Genecards、DisGeNET和OMIM数据库,分别获得大黄素作用靶点及类风湿关节炎相关基因,并构建靶点蛋白质相互作用网络（PPI）,对交集基因进行Gene Ontology与KEGG通路富集分析。运用AutoDock4.2.6软件模拟分子对接。将大黄素与经TNF-α诱导的MH7A细胞共同培养,培养分组情况：空白对照组、模型组（TNF-α组,10 ng/mL）、药物干预组（TNF-α 10 ng/mL+Emodin20、40、60、80、100 μmol/L）。采用CCK-8法、细胞划痕实验及流式细胞周期实验探究大黄素对MH7A细胞增殖的抑制作用。通过Western blot观察其NF-κB通路蛋白表达情况,通过Rt-PCR实验分析 CAPS3、PTGS2（COX2）、MAPK14 基因的表达。结果 获得大黄素和类风湿关节炎交集基因32个,其中心节点为CAPS3、ESR1、MAPK14等,主要涉及NF-κB信号通路等。分子对接提示大黄素与核心靶点能较好的结合。实验结果显示,大黄素能明显抑制MH7A细胞过度增殖（P<0.05）。Western blot结果显示,TNF-α诱导的MH7A细胞NF-κB 蛋白表达水平升高（P<0.01）,而予以大黄素80 μmol/L干预后IκBα、p-NF-κB表达水平均有所降低（P<0.01）。Rt-PCR结果显示,TNF-a组COX2、 P38MAPK（MAPK14）核心基因的表达量明显上调,而大黄素（80 μmol/L）处理后各组COX2、P38MAPK14的mRNA表达下降mRNA的表达下降（P<0.01）,凋亡相关基因CASP3上调。结论 大黄素通过调控细胞增殖凋亡,调节NF-κB等信号通路等发挥治疗类风湿关节炎作用。     

TNF-α诱导的circMAN1A2促进宫颈癌细胞的迁移、侵袭和增殖

目的:探讨肿瘤坏死因子（TNF）-α诱导的circMAN1A2对宫颈癌细胞恶性行为的影响。方法:RNA高通量测序检测TNF-α处理后人宫颈癌HeLa细胞中circRNA的表达差异性。RT-qPCR方法验证TNF-α对circMAN1A2的影响。RNase R耐受性实验验证circMAN1A2是否耐受RNase R消化。核质RNA分离实验研究circMAN1A2在HeLa细胞的定位;Transwell迁移侵袭实验、MTT实验、集落形成实验研究circMAN1A2对宫颈癌细胞恶性行为的影响。结果:RNA高通量测序检测到98种表达上调和63种表达下调的circRNA。TNF-α处理后circMAN1A2表达上调,其能够耐受RNase R消化,主要定位于HeLa细胞胞核中。细胞功能实验表明circMAN1A2能够促进宫颈癌细胞的迁移、侵袭和增殖。结论:TNF-α诱导的circMAN1A2促进宫颈癌细胞的迁移、侵袭和增殖。     

坎地沙坦在炎症过程中抑制氧化应激反应机制的研究

目的探讨坎地沙坦（Cande sartan,CAN）是否具有不依赖血管紧张素1型受体（anti-inflammation via independent,AT1R）的抗炎作用及其可能的机制。方法以人肾小管上皮细胞为研究对象，观察CAN对肿瘤坏死因子（TNF-α）诱导炎症趋化因子的影响及CAN对TNF-α所诱导ROS的作用。采用RT-PCR方法测定相关分子mRNA表达，Western blotting和ELISA方法测定相关分子蛋白含量。结果CAN能有效抑制TNF-α诱导炎症趋化因子MCP-1、RANTES mRNA和蛋白表达，且能抑制TNF-α诱导的NF-κB磷酸化。CAN具有类是抗氧化应激物N乙酰半胱氨酸（NCA）的作用．抑制TNF-α诱导的ROS产生。结论CAN能抑制TNF-α诱导肾小管上皮细胞发生炎症反应，其机制与CAN的直接抗氧化作用有关。