酿酒酵母乙酰辅酶A精细调控合成萜类化合物研究进展

酿酒酵母作为细胞工厂被用来生产多种萜类化合物。乙酰辅酶A为合成萜类化合物的基本前体,细胞质乙酰辅酶A供应不足会导致目标产物产量较低,调控乙酰辅酶A合成是构建目标萜类化合物高产合成途径的重要手段。本文介绍了酿酒酵母乙酰辅酶A作为重要中心碳代谢分子,主要在细胞核组蛋白乙酰化、细胞质丙酮酸脱氢酶支路、线粒体三羧酸循环和过氧化物酶体乙醛酸循环中参与的代谢过程。总结了通过强化酿酒酵母内源丙酮酸脱氢酶支路,引入低三磷酸腺苷（ATP）消耗的异源乙酰辅酶A合成途径,增加辅酶A合成和利用线粒体乙酰辅酶A含量高且对其不渗透的特性进行区域化合成以提高乙酰辅酶A含量的代谢工程策略,旨在为酿酒酵母萜类化合物的高效合成提供借鉴。     

酿酒酵母高效合成萜类化合物的组合调控策略

萜类化合物具有广泛的生理活性与重要的经济价值,利用酿酒酵母进行萜类合成具有低价、高效等优势。然而部分植物源合成萜类的关键酶在酿酒酵母中难表达、产量低,难以工业应用,因此有效的调控策略显得至关重要。本文从萜类化合物在酿酒酵母中的合成途径入手,介绍了关键酶、代谢途径、CRISPR基因编辑系统和人工合成染色体技术4个方面的调控策略在酿酒酵母合成萜类化合物中的应用。阐述了关键酶的筛选、改造,理性与非理性设计,MVA途径、乙酰辅酶A合成途径与亚细胞结构的代谢途径改造的优势。指出了多重调控策略组合调控的方式是实现酿酒酵母高效合成萜类化合物的有效方法。此外,CRISPR基因编辑系统与人工合成染色体技术的快速发展将为酿酒酵母细胞工厂的深入开发与利用提供有力工具。     

二萜类化合物微生物转化研究进展

二萜类化合物是一类重要的天然产物,研究发现微生物能对该类化合物进行多种类型的结构修饰。本文根据十年来二萜类化合物生物转化研究的报道,对二萜类化合物的生物转化菌种及催化反应类型进行综述,以期为二萜类化合物生物转化研究与应用提供参考。     

单萜类硝基化合物的合成研究

以单萜类化合物6-甲基-5-庚烯-2-酮①、3,7-二甲基-6-辛烯醛②、3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛③、3,7-二甲基-2,6-辛二烯醇④等为原料,探索了一条合成单萜类硝基化合物的简便方法。     

烯丙基酯合成方法在萜类化合物中的应用研究进展

作为重要聚合物单体或反应性中间体使用的烯丙基酯类化合物,其合成方法丰要包括醇酸脱水直接酯化法、酰氯化醇解酯化法、酯(盐)酯交换酯化法、羧酸盐烯丙基卤化物交换酯化法(无机碱催化和有机胺/季铵盐相转移催化)等.以马来松香烯丙醇酯、松香烯丙醇酯、脱氢枞酸烯丙醇酯、蒎酸二烯丙基酯等的合成作为应用实例,综述了烯丙基酯合成方法在萜类化合物中的研究及应用进展.指出相转移催化法是合成萜类烯丙蕈酯化合物的有效办法之一.     

萜类香料生物合成的研究进展

萜类化合物在自然界存在广泛,许多已被用于香料工业,萜类香料也是芳香产业关注的热点之一。生物合成可以利用廉价和可再生资源合成萜类化合物,提供一种独立于天然来源的可持续获取所需产品的替代方法,与植物提取和化学合成相比是一种更有前途的香料生产途径。随着香精香料市场的不断增长,合成生物学指导下的萜类化合物生产在推动未来市场前景方面显示出巨大的潜力。综述了合成生物学在萜类香料生产的应用、萜类化合物的微生物细胞工厂构建及工程菌株技术平台等,同时展望了生物合成萜类香料的应用前景。     

异源转氢酶NNT对酿酒酵母木糖代谢的影响

表达有毕赤酵母木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)的重组酿酒酵母,能代谢木糖.但是XR和XDH分别偏好辅酶NADPH和NAD⁺,造成辅酶的不平衡和副产物的积累,所以重组酿酒酵母利用木糖产生乙醇的效率很低.转氢酶可以催化辅酶NADPH和NADH之间的相互转化,因此本实验将黑曲霉的转氢酶基因NNT转入到重组酿酒酵母中,通过实验确定了NNT基因的表达蛋白在酵母细胞内定位于线粒体中,NNT基因分别用pPGK1、pCCW12和pHXT7启动子进行表达,在微好氧的木糖发酵条件下,NNT基因的导入使酿酒酵母甘油产量下降,乙醇产率提高,在由pCCW12和pHXT7表达NNT基因的重组酿酒酵母中,木糖醇产率分别下降86.3%和49.3%,乙醇产率提高16.7%和12.7%,说明转氢酶NNT的存在改善了木糖代谢的辅酶不平衡,提高了乙醇的转化率.     

麻疯树中萜类物质的性质及研究进展

麻疯树属Jatropha L.为大戟科Euphorbiaceae植物.该属约有200余种植物,主要分布于热带和亚热带地区,在我国广东、广西、云南、贵州、福建等地区,有栽培和野生的该属植物,本文仅就近年来从该属植物中分离、鉴定的萜类化合物性质、研究进展等进行综述.     

纯化鸡蛋花中萜类化合物的方法研究

本文对比了水蒸气蒸馏法、超声提取法、微波提取法和索氏提取法四种方法提取鸡蛋花中萜类化合物,实验证明水蒸气蒸馏法是较适合提取鸡蛋花中萜类物质的方法。同时本文优化了鸡蛋花提取物的柱层析法,结果表明,以乙醇为洗脱剂、氧化铝为固定相的分离方法所用时间少,分离效果较佳。     

产蒎烯人工酵母细胞的构建

蒎烯可衍生为高能量密度燃料,但在酿酒酵母中的全生物合成却未见报道。酿酒酵母由于拥有强大的蛋白表达和翻译后修饰系统以及完整的内膜系统,相比于大肠杆菌等原核生物更适于P450等蛋白的表达,因此将酿酒酵母作为宿主细胞,对于蒎烯或者其他物质实现如“疯狂碳环”的高能量化是至关重要的。本研究在酿酒酵母底盘中表达内源焦磷酸香叶酯合成酶（ERG20）的突变体ERG20^ww和火炬松来源的蒎烯合酶（PtPS）构建了蒎烯的合成路径。通过截短PtPS N端2～51位氨基酸残基（tPtPS）,蒎烯产量较初始产量（0.329 mg·L^-1）提高了2.23倍。在过表达异戊二烯焦磷酸异构酶（IDI1）和RNA聚合酶Ш负调控因子（MAF1）的基础上,表达ERG20^ww和tPtPS的融合蛋白,蒎烯产量进一步提高了5.16倍。通过将内源基因ERG20启动子原位替换为弱启动子HXT1,下调ERG20的转录,蒎烯的产量提高了26.0%。最终通过调节发酵过程中的培养基pH使蒎烯产量达11.7 mg·L^-1,较初始产量提高了34.5倍。本研究在酿酒酵母中实现蒎烯的从头合成,并获得已知蒎烯摇瓶水平的最高产量。     

酿酒酵母钙通道膜蛋白单克隆抗体制备及鉴定

以酿酒酵母电压门控钙通道膜蛋白（Cch1p）、牵张敏感性钙通道膜蛋白（Mid1p）和瞬时受体电位钙通道膜蛋白（Yvc1p）为研究材料,制备其单克隆抗体。采用生物信息学方法确定3种膜蛋白抗原表位,根据分析结果克隆抗原基因,并进行原核表达和表达产物分析鉴定,通过Ni²⁺-NTA树脂亲和层析技术获得重组抗原蛋白,免疫小鼠后细胞融合技术制备单克隆抗体,酶联免疫吸附测定（ELISA）检测抗体效价,免疫印迹技术检测单克隆抗体对重组纯化抗原和天然酿酒酵母钙通道膜蛋白的反应性和特异性。生物信息学分析结果表明,Cch1p、Mid1p和Yvc1p抗原表位可能分别位于1~300位氨基酸残基、359~548位氨基酸残基、1~236位氨基酸残基;克隆目的基因条带大小分别为926bp、570bp和708bp,与预期结果一致;原核表达抗原蛋白分子量分别为60000、25000和30000,Western blot检测条带正确;重组纯化抗原免疫BALB/c小鼠,细胞融合技术制备单克隆抗体,ELISA检测显示单克隆抗体效价分别高达1∶256000、1∶128000和1∶64000,Western blot检测到3种重组纯化抗原和天然酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p。这些结果说明本文制备的单克隆抗体可以成功用于检测酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p表达的相关研究。     

重组酿酒酵母生物合成菜油甾醇

菜油甾醇作为甾体药物（孕酮、雄烯二酮、氢化可的松等）的重要合成前体已受到国内外研究学者的广泛关注。首先通过生物信息学分析,筛选了10种不同来源的7-脱氢胆固醇还原酶DHCR7,并采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）内源的ERG5基因替换成不同来源的DHCR7基因,构建了菜油甾醇合成菌株。结果发现整合来源于Pangasianodon hypophthalmus DHCR7的菌株Zw507表现出最高的菜油甾醇的产量216.93 mg/L。进一步筛选了10种酵母内源启动强度较强的启动子来与PhDHCR7基因进行组合,结果显示以TEF1p为启动子时菜油甾醇的产量最高可达253.35 mg/L。为了进一步提高菜油甾醇产量,增加了DHCR7表达盒在酵母基因组上的拷贝数。当拷贝数为3个时,菜油甾醇的产量达到最高302.27 mg/L。最终,通过5 L发酵罐进行补料分批发酵,实现了916.88 mg/L菜油甾醇产量。该菌株可作为后续甾体药物生物合成的优良底盘细胞。     

Mitochondrial Carriers and Substrates Transport Network: A Lesson from Saccharomyces cerevisiae

The yeast Saccharomyces cerevisiae is one of the most widely used model organisms for investigating various aspects of basic cellular functions that are conserved in human cells. This organism, as well as human cells, can modulate its metabolism in response to specific growth conditions, different environmental changes, and nutrient depletion. This adaptation results in a metabolic reprogramming of specific metabolic pathways. Mitochondrial carriers play a fundamental role in cellular metabolism, connecting mitochondrial with cytosolic reactions. By transporting substrates across the inner membrane of mitochondria, they contribute to many processes that are central to cellular function. The genome of Saccharomyces cerevisiae encodes 35 members of the mitochondrial carrier family, most of which have been functionally characterized. The aim of this review is to describe the role of the so far identified yeast mitochondrial carriers in cell metabolism, attempting to show the functional connections between substrates transport and specific metabolic pathways, such as oxidative phosphorylation, lipid metabolism, gluconeogenesis, and amino acids synthesis. Analysis of the literature reveals that these proteins transport substrates involved in the same metabolic pathway with a high degree of flexibility and coordination. The understanding of the role of mitochondrial carriers in yeast biology and metabolism could be useful for clarifying unexplored aspects related to the mitochondrial carrier network. Such knowledge will hopefully help in obtaining more insight into the molecular basis of human diseases.     

不同非氧化磷酸戊糖途径基因的过表达对酿酒酵母木糖发酵性能的影响

以双拷贝过表达木糖代谢上游途径关键酶(木糖还原酶XR、木糖醇脱氢酶XDH和木酮糖激酶XKS)的酿酒酵母菌株为背景,在过表达非氧化磷酸戊糖(PP)途径中转醛酶基因TAL1的基础上,对途径中其他基因TKL1(转酮酶)、RPE1(核酮糖-5-磷酸差向异构酶)和RKI1(核酮糖-5-磷酸异构酶)进行了不同程度的过表达,以研究PP途径基因过表达对酿酒酵母木糖代谢的影响。在不同培养基条件下对重组菌株木糖代谢进行研究,结果显示,在过表达TAL1的基础上不同组合过表达PP途径其他基因不同程度改善了酿酒酵母木糖发酵性能,重组菌株能在36~48 h耗完质量分数(下同)为5%的木糖。其中,过表达PP途径全部基因比其他过表达基因组合表现出明显的优势,在8%木糖发酵条件下其乙醇产量达到了每1 g木糖0.337 g,较对照菌株提高了7.86%。这说明同步过表达PP途径基因更有利于酿酒酵母木糖发酵。     

Factors affecting silver biosorption by an industrial strain of Saccharomyces cerevisiae

Factors affecting silver biosorption by Saccharomyces cerevisiae biomass, obtained as a waste product from industry, were examined. Maximum removal of silver from solution was achieved within 5 min. Increasing the concentration of biomass in experimental flasks from 1 to 8 mg cm⁻³ decreased both silver accumulation, from 224·7 to 89·5 μmol Ag g⁻¹ dry wt, and associated H⁺ ion release, from 109·4 to 31·7 μmol H⁺ g⁻¹ dry wt. The presence of 1·0 mol dm⁻³ cadmium or methionine decreased silver biosorption by 40% and 93% respectively. Boiling in 100 mmol dm⁻³ NaOH or 10 mmol dm⁻³ sodium dodecyl sulphate decreased silver biosorption by 54% and 25% respectively. A temperature increase from 4°C to 55°C decreased silver biosorption by 9%. The metabolic state of the yeast had no effect on silver biosorption. Decreasing the pH of the silver solution caused a reduction in metal removal by the biomass.     

A modular engineering strategy for high-level production of protopanaxadiol from ethanol by Saccharomyces cerevisiae

Ethanol is a more reduced substrate than sugars. Here, ¹³C-metabolic flux analysis (MFA) revealed that ethanol catabolism could supply sufficient acetyl-CoA and reducing equivalent for PPD biosynthesis. Then, we described modular engineering strategy to optimize a multigene pathway for protopanaxadiol (PPD) production from ethanol in Saccharomyces cerevisiae. PPD biosynthesis was divided into four modules: mevalonate (MVA) pathway module, triterpene biosynthesis module, sterol biosynthesis module, and acetyl-CoA formation module. Combinatorially overexpressing every gene in MVA pathway and optimizing metabolic balance in triterpene biosynthesis module led to significantly enhanced PPD production (42.34 mg/L/OD600). In sterol biosynthesis module, fine-tuning lanosterol synthase gene (ERG7) expression using TetR–TetO gene regulation system enabled further production improvement (51.26 mg/L/OD600). Furthermore, increasing cytoplasmic acetyl-CoA supply by overexpressing a Salmonella ACS (acetyl-CoA synthetase gene) mutant ACS_seL641P improved PPD production to 66.55 mg/L/OD600. In 5 L bioreactor, PPD production of the best-performing strain WLT-MVA5 reached 8.09 g/L, which has been the highest titer of plant triterpene produced in yeast. © 2018 American Institute of Chemical Engineers AIChE J, 65: 866–874, 2019