双功能基因APE1/Ref-1:肿瘤治疗的新靶点

脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子(apurinic/aprimidinic endonuclease/redox factor-1,APE1/Ref-1)是一个生物大分子功能复合体的范例,它不仅是DNA碱基切除修复(base excision repair,BER)途径的主要限速酶,而且是一种重要的氧化还原因子,通过调控多种转录因子氧化还原状态而改变其转录活性.APE1/Ref-1参与多种重要的细胞生物学过程,是DNA损伤修复、氧化应激和转录因子调控基因表达的重要枢纽分子,对细胞凋亡、增殖和分化有重要的影响[1].     

APE/Ref-1的临床应用研究进展

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1(APE/Ref-1)是一种多功能的蛋白质,在氧化或烷化物所导致的DNA损伤修复,以及在氧化还原反应的调控等多个生物学过程中都发挥着重要作用。本文综合近几年国内外的众多文献,从APE/Ref-1的结构与功能入手,对其与肿瘤和心脑血管疾病、中枢神经系统疾病等之间关系的临床研究进展进行分析,提示APE/Ref-1作为新标记物,在临床的应用有着良好的发展前景。     

APE1／Ref—1在肿瘤治疗中的应用前景

脱嘌呤／脱嘧啶核酸内切酶1／氧化还原因子-1（apurinic／apyrimidinic endonuclease／redox factor-1,APE1／Ref-1）是生物体中一种重要酶类,是一个多功能蛋白。APE1在DNA碱基切除修复途径（BER）中作为人类中最主要的AP（脱嘌呤脱嘌啶）内切酶,占到AP内切酶活性总体的95％,是保护细胞免除多种DNA损伤药物毒性作用的必须酶。     

APE1/Ref-1表达在小鼠放射性肺损伤形成中的变化特点

目的 观察小鼠放射性肺损伤过程中DNA损伤修复关键酶脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子(apurinic/aprimidinic endonuclease/redox factor-1,APE1/Ref-1)表达的动态变化,初步探讨APE1/Ref-1在放射性肺损伤发生、发展中的作用.方法 雌性昆明小鼠30只,随机分为照射组18只和对照组12只.照射组用8MV直线加速器给予小鼠全胸20Gy单次照射,对照组佯装照射.在照射后1、3、7、14、28、56d共6个时相点,分批活杀小鼠(照射组3只,对照组2只),观察其全肺大体形态改变,取右肺组织,光镜下观察组织形态学变化,免疫组化SP法检测APE1/Ref-1;取左肺组织,Western blot方法检测APE1/Ref-1蛋白表达.结果 正常小鼠肺组织上皮细胞和内皮细胞中APE1/Ref-1呈胞核表达为主,而在小鼠放射性肺损伤不同阶段肺组织上皮细胞和内皮细胞中APE1/Ref-1表达特征有所改变,呈核浆共同表达和胞浆表达为主;并且APE1/Ref-1表达呈现先增高后降低的趋势,照射后1d开始升高,3d达高峰,且明显高于对照组,此后随着小鼠放射性肺损伤发展逐渐降低,28d降至对照组水平,56d明显低于对照组.结论 电离辐射可以刺激APE1/Ref-1蛋白的表达并使其表达发生由核内转向浆内和先增高后降低的特征改变,表明APE1/Ref-1可能在放射性肺损伤修复过程中起着重要作用.     

人APE1/Ref-1基因真核表达质粒的构建和鉴定

目的 构建含人APE1/Ref-1基因全长cDNA片段的真核表达质粒pcDNA3.1 APE1,以期进一步研究该基因对细胞DNA损伤的保护作用.方法 采用RT-PCR法定向克隆人APE1/Ref-1基因全长cDNA片段,构建pGM-T Easy/APE1质粒,测序鉴定APE1/Ref-1基因cDNA序列正确后,将目的片断亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1 上,构成pcDNA3.1 APE1表达质粒,并用Western blotting法检测转染人脐静脉内皮细胞APE1/Ref-1蛋白的表达水平.结果 经酶切及测序证实APE1/Ref-1基因真核表达质粒pcDNA3.1 APE1构建成功,Western blotting法检测到转染pcDNA3.1 APE1后,细胞内APE1/Ref-1蛋白表达明显增加.结论 成功构建含人APE1/Ref-1基因全长cDNA片段的真核表达质粒,为探讨APE1/Ref-1对细胞电离辐射损伤的保护作用奠定了基础.     

APE/Ref-1与妇科肿瘤的研究

无嘌呤无嘧啶核酸内切酶(APE)又名氧化还原因子1(Ref-1),是一种多功能蛋白,除了修复AP位点外,还保持很多转录因子的活性还原状态,对维持DNA的稳定和调节细胞因子的表达具有重要作用。目前国内外研究发现APE/Ref-1蛋白在细胞中的表达部位与妇科肿瘤的发生、发展及预后有关,而APE/Ref-1蛋白表达水平的改变与妇科肿瘤放疗的敏感性有关。     

APE1/Ref-1基因单核苷酸多态性与肝细胞肝癌的研究进展

人类脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶1(apurinic/apyrim id inic endonuclase,APE1)又名氧化还原因子1(redoxfactor-1,Ref-1),是DNA碱基切除修复途径(base excision repair,BER)中的重要基因,在修复内、外环境致癌因子(包括离子化放射、氧化应激等)所致的小的DNA损伤中发挥重要作用。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)作为第三代遗传标记,充分反映了个体间的遗传差异,决定了个体对疾病的易感性。近年来对APE1/Ref-1单核苷酸多态性的研究正成为热点,探讨其SNPs与肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的关系将有助于HCC的预防与治疗。1 HCC流行病学HCC是我国高发的恶性肿瘤之一。肝癌的死亡率占常见恶性肿瘤死亡率第二位,在部分农村占第一位,死亡率为20.4/10万[1]。近几十年来全世界肝癌发病率、死亡率仍呈上升趋势。肝癌恶性程度高,起病隐匿,病程短,侵袭性很强,多病灶,易转移,恶性程度高,预后差,死亡率高,严重威胁人们的健康及生命。目前肝癌已经成为我...     

大肠癌Ref-1/APE的表达特点及其意义

目的探讨大肠癌氧化还原因子-1(redox factor-1,Ref-1),又称脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(apurinic/apyrimidinic endonuclease,APE),在大肠癌的表达特点及其与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血管密度的关系.方法应用免疫组化S-P法检测110例大肠癌和40例非癌区大肠组织中Ref-1/APE和VEGF的表达,采用血管内皮特异标记物CD31标记并计数肿瘤微血管密度(microvessel density,MVD),最后分析Ref-1/APE与VEGF和MVD的关系.结果所有大肠癌和非癌区大肠组织都有Ref-1/APE表达,但是其在细胞内的定位有所不同.40例非癌区大肠组织细胞核都有Ref-1/APE表达,仅5例有胞质表达(5/40,12.5%);而110例大肠癌中有79例(79/110,71.81%)细胞质有Ref-1/APE表达,比例显著高于非癌区大肠组织(P＜0.01).而且细胞质Ref-1/APE阳性表达的大肠癌较无细胞质表达者VEGF阳性率显著增加(P＜0.05),MVD也显著增高(P＜0.05).结论大肠癌Ref-1/APE移位于细胞质的异常表达可能涉及大肠癌的发生,并且可能与VEGF表达和肿瘤血管生成有关.     

大鼠脑缺血后APE/Ref-1蛋白表达对神经元凋亡的影响

目的 探讨脑缺血后无嘌呤／无嘧啶核酸内切酶／氧化还原因子1（APE／Ref－1）蛋白表达变化与神经元凋亡之间的关系。方法 采用双侧颈总动脉阻断＋全身低血压法建立大鼠脑缺血模型。动物分假手术组、手术后存活1，2，3d组。用免疫组织化学方法分析各组APE／Ref-1蛋白的表达；用TUNEL染色观察脑缺血后海马CA1区神经元凋亡的情况。结果 免疫组织化学显示假手术组神经元广泛表达APE／Ref-1蛋白。在脑缺血10min后第1天海马CA1区APE／Ref-1阳性细胞开始减少，第2天明显减少。该区TUNEL阳性细胞在缺血第2天出现，第3天表现明显。APE／Ref-1和TUNEL双重染色提示丧失了APE／Ref-1免疫活性的细胞转变为TUNEL阳性细胞。结论 短暂性脑缺血后海马CA1区神经元表达APE／Ref-1蛋白减少，这种变化早于神经元凋亡，提示APE／Ref-1蛋白减少和DNA修复功能下降可能与短暂性脑缺血后发生神经元凋亡有关。     

APE1/Ref-1线粒体定位机制的研究

APE1/Ref-1是一种重要的多功能蛋白,主要功能是DNA修复和转录因子的氧化还原调控.目前认为,核编码基因的线粒体主动转运主要依靠线粒体外膜和内膜上一系列转运酶复合体,称为外膜转运酶(translocase of outer membrane,TOM)和内膜转运酶(translocase of inner membrane,TIM).     

人类脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1在乳腺癌中的研究进展

在细胞内外各种生物因素的作用下,生物体基因组DNA出现累积损伤,一旦修复机制出现缺陷就可能引发癌症.在细胞修复DNA损伤后形成脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点时,人类脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)发挥关键作用,本文对于APE1基因与癌症的关系及其在乳腺癌中的研究现况做一综述.     

亚低温对大鼠短暂性脑缺血后APE／Ref-1表达、神经元凋亡的影响

目的　 (1 )探讨短暂性脑缺血后无嘌呤 /无嘧啶核酸内切酶 /氧化还原因子 - 1 (APE/ Ref- 1 )在海马 CA1区的变化过程。 (2 )探讨短暂性脑缺血后海马 CA1区发生的神经元凋亡情况。 (3)探讨 APE/ Ref- 1在海马 CA1区的变化及其与该区神经元凋亡的内在联系。 (4 )探讨采取亚低温干预措施后APE/ Ref- 1与神经元凋亡在短暂性脑缺血后海马 CA1区的变化。 (5 )探讨亚低温干预后 APE/ Ref- 1的变化在亚低温脑保护中的作用。　方法　采用大鼠短暂性脑缺血模型及亚低温方法 ,通过神经元尼氏体染色、TU NEL 染色、APE/ Ref- 1蛋白免疫组织化学染色、APE/ Ref- 1蛋白免疫组织化学与TU NEL双重染色等方法 ,观察短暂性脑缺血后海马 CA1区神经元存活、凋亡、APE/ Ref- 1蛋白表达情况及亚低温的影响。　结果　 (1 )与假手术组相比 ,常温缺血组脑海马CA1区神经元缺失远较亚低温缺血组多 (P<0 .0 1 )。 (2 )常温缺血组及亚低温缺血组脑海马 CA1区均存在神经元凋亡。亚低温缺血组神经元凋亡出现的时间比常温缺血组迟 ,且凋亡数较常温组少 (P<0 .0 1 )。 (3)假手术组海马 CA1区神经元广泛表达 APE/ Ref- 1蛋白 ,常温缺血组及亚低温缺血组缺血后 APE/ Ref- 1蛋白表达均有下降 ,亚低温缺血组APE/ Ref- 1蛋白表达下降程度较常     

APE1/Ref-1 siRNA抑制多发性骨髓瘤骨髓基质细胞IL-6及IL-8分泌的体外研究

目的 体外通过APE1/Ref-1 siRNA敲低多发性骨髓瘤骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)APE1/Ref-1的表达,观察BMSCs的增殖及分泌细胞因子IL-6、IL-8的变化,初步探讨BMSCs APE1/Ref-1表达的功能特点.方法 通过免疫细胞化学染色法定量榆测35例初治、11例复发/难治多发性骨髓瘤患者及10例正常人BMSCsAPE1/Ref-1的表达特点及其差异,经Adv5-APE1/Ref-1 siRNA感染BMSCs后,流式细胞仪检测BMSCs细胞周期的变化;ELISA法检测BMSCs分泌IL-6、IL-8的水平变化情况.结果 多发性骨髓瘤BMSCs的APE1/Ref-1蛋白阳性表达率显著高于正常BMSCs APE1/Ref-1蛋白阳性表达率(P<0.05),且多发性骨髓瘤BMSCs的APE1/Ref-1呈细胞核及核浆共间表达方式.Adv5-APE1/Ref-1 siRNA感染敲低多发性骨髓瘤及正常BMSCs APE1/Ref-1的表达量呈进行性减少(P<0.01),同时发现APE1/Ref-1 siRNA对多发性骨髓瘤BMSCs抑制作用更明显.Adv5-APE1/Ref-1 siRNA感染BMSCs后对正常人及骨髓瘤患者BMSCs分泌细胞因子IL-6、IL-8的量有显著的抑制作用,特别是感染72 h后,骨髓瘤患者及正常人的BMSCs分泌IL-6[初治患者(246.29±46.51)pg/ml,复发/难治患者(365.09±75.25)pg/ml]、IL-8[初治患者(118.77±18.08)pg/ml,复发/难治患者(188.71±33.76)pg/ml]的量最低,与其他时段比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 多发性骨髓瘤BMscs APE1/Ref-1的表达特点不同于正常BMSCs,可能导致其功能差异;APE1/Ref-1 siRNA敲低了MM BMSCsAPE1/Ref-1的表达,同时明显抑制了其IL-6、IL-8的分泌,减少了对骨髓瘤细胞的促增殖和凋亡作用.     

基于ChIP-seq技术的肺癌细胞DNA碱基损伤热点全基因组分析

目的 建立可用于在全基因组水平分析DNA碱基损伤位点分布的方法,利用该方法分析非小细胞肺癌A549细胞株中DNA碱基损伤热点区域的分布规律.方法 利用染色质免疫沉淀偶联测序(chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)技术对A549细胞中与脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶 1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1,APE1)和8-氧鸟嘌呤 DNA 糖化酶 1(8-oxoguanine DNA glycosylase 1,OGG1)蛋白特异结合DNA片段进行序列鉴定,通过生物信息学的方法分析全基因组DNA碱基损伤热点分布规律.结果 APE1和OGG1结合峰主要分布在基因启动子区,比例分别为41.70％和49.26％,APE1和OGG1结合峰于TSS上游2 000 bp区域内分别占比38.80％和39.80％,APE 1与OGG1结合峰具有显著相关性(r=0.636 3,P＜0.01).APE1和OGG1共同结合峰相关基因数有25 038个,其中与肿瘤发生直接相关的有641个.结论 建立在全基因组水平分析DNA碱基损伤位点分布的方法;在非小细胞肺癌细胞中,DNA碱基损伤并非随机分布而主要分布于基因调控功能区,碱基损伤修复蛋白结合相关热点区域与肿瘤发生及肿瘤炎症微环境密切相关.     

APE/Ref-1基因重组腺病毒的构建表达和鉴定

目的 构建表达氧化还原因子-1（APE／Ref-1）基因的复制缺陷型重组腺病毒，为进一步研究APE／Ref-1在耳蜗螺旋神经节氧化损伤病理过程中的作用机制提供实验基础。方法 应用RT-PCR技术从大鼠脑组织总RNA克隆出APE／Ref-1基因，将APE／Ref-1基因定向克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上，经与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠埃希菌BJ5183内同源重组后，转染293细胞进行包装，并反复感染293细胞进行扩增。对其进行安全性、滴度以及活性等检测。采用Western blot对APE／Ref-1蛋白表达进行检测和鉴定。结果 克隆出大鼠APE／Ref-1基因，经测序证实结果正确：得到高滴度的重组腺病毒，提取病毒DNA证实含目的基因。结论 成功构建了表达APE／Ref-1的复制缺陷型重组腺病毒。为进一步研究APE／Ref-1在耳蜗螺旋神经节的氧化损伤过程中作用机制奠定了实验基础。     

采用组织芯片技术研究APE/Ref-1在胃癌中的表达及其意义

目的 检测APE/Ref-1在胃癌中的表达及意义.方法 收集60例胃癌和27例癌旁5 cm胃黏膜,用组织芯片(tissue micro-array)和免疫组织化学法检测APE/Ref-1基因的表达,并分析APE/Ref-1与胃癌临床病理指标之间的关系.结果 APE/Ref-1在胃癌和正常胃黏膜组织中呈胞核、胞质或核质共表达.在胃癌组织中,胞核阳性率为91.7%,胞质阳性率为21.7%,核质阳性率为20%;在胃正常黏膜组织中,胞核阳性率为92.6%,胞质阳性率为78%,核质阳性率为63%.胃癌和胃正常黏膜组织相比,胞核阳性率变化不明显(P>0.05),但胞质阳性率和核质阳性率均有显著性差异(P<0.05).结论 APE/Ref-1在胃黏膜组织中普遍表达,以胞核表达为主.APE/Ref-1在胃癌胞质表达水平的降低可能在胃癌的发生、发展中起重要作用.     

电离辐射诱导骨肉瘤细胞DNA损伤修复蛋白APE1线粒体定位研究

目的 探讨电离辐射诱导骨肉瘤细胞脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(apurinic/aprimidinic endonuclease 1,APE1)线粒体定位表达情况,为进一步研究线粒体DNA修复在骨肉瘤放射治疗抵抗中的作用提供依据.方法 应用激光共聚焦显微术和Western blot观察正常对照组和12 Gy X线照射后不同时相点骨肉瘤细胞株HOS细胞中APE1线粒体定位情况.结果 对照组、12 Gy X射线处理后1、2、3 h APE1和线粒体有共定位现象,APE1细细胞质/细胞核荧光强度比值分别为:(0.78±0.04)、(1.04±0.03)、(1.14±0.05)、(1.80±0.38).Western blot亦证实线粒体内APE1蛋白表达增高.结论 放射后早期APE1向细胞质线粒体移位,从1～3 h逐渐增高,提示APE1可能在电离辐射后骨肉瘤细胞线粒体DNA损伤修复中发挥重要作用.     

亚低温对大鼠短暂性全脑缺血后APE/Ref-1表达、神经元凋亡的影响

[目的]通过大鼠短暂全脑缺血模型来探讨亚低温对大鼠脑缺血后APE/Ref-1(apurinic/apyrimidimic endo-nuclase/redox factor 1,无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1)蛋白表达及缺血性神经元凋亡的影响,揭示亚低温的部分神经保护机制。[方法]采用"双侧颈总动脉夹闭+低血压法"建立大鼠短暂性全脑缺血模型。实验动物分假手术组、手术后常温存活1 d、2 d、3 d组及手术后亚低温存活1 d、2 d、3 d组。用免疫组化方法检测各组APE/Ref-1蛋白的表达;用TUNEL染色观察全脑缺血后海马CA1区神经元凋亡的情况。[结果]免疫组化显示假手术组神经元广泛表达APE/Ref-1蛋白。在10 min全脑缺血后的1 d时,海马CA1区APE/Ref-1阳性细胞开始减少,2 d时明显减少。该区TUNEL阳性细胞在缺血后2 d时出现,3 d时表现明显。亚低温缺血组APE/Ref-1蛋白表达下降程度较常温缺血组明显减轻(P<0.01)且时间推迟;神经元凋亡出现的时间亦比常温缺血组迟,且凋亡数较常温组少(P<0.01)。APE/Ref-1和TUNEL双重染色提示丧失了APE/Ref-1免疫活性的细胞转变为TUNEL阳性细胞。[结论]亚低温对缺血后神经元具有保护作用,其机制可能为抑制缺血后APE/Ref-1下降,及减少神经元凋亡。     

APE/Ref1在H2O2诱导耳蜗螺旋神经节细胞氧化损伤过程中的表达

目的 研究氧化还原因子-1(apurinic/apyrimidimic endonuclase/redox factor 1, APE/Ref-1)在过氧化氢(H2O2 )诱导耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells, SGCs)氧化损伤过程中的表达.方法 原代培养离体大鼠SGCs,采用免疫荧光和Western blot方法检测APE/Ref-1在H2O2诱导SGCs 氧化损伤过程中的表达.台盼蓝染色法计算SGCs氧化损伤过程中的死亡率. 结果 APE/Ref-1在体外正常培养SGCs细胞质和细胞核均有表达,细胞核较强.H2O2浓度≥60 μmol/L 时, SGCs死亡率显著升高,APE/Ref-1在细胞核表达明显减弱,与对照组相比差异具有统计学意义(P＜ 0.05). 结论 APE/Ref-1在氧化环境下SGCs细胞核表达减少,细胞死亡率升高,提示氧化环境下细胞活性降低可能与APE/Ref-1表达减少有关.     

无嘌呤无嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子1的研究进展

无嘌呤无嘧啶核酸内切酶／氧化还原因子1（APE／Ref-1）具有修复DNA损伤、影响氧化还原反应及调节转录因子DNA结合活性等功能，对细胞的生存有重要作用。近年来有关APE／Ref-1的研究在其基因、功能、分布以及与某些疾病尤其是神经系统疾病和肿瘤之间的关系等方面都取得了长足的进展，本文对此进行了综述。