不同重楼变种间内生真菌群落多样性差异及生物标记物初探

目的通过对不同变种重楼内生真菌群落多样性研究及生物标记物分析,为中药材重楼多基源质量等同性及鉴别溯源技术的开发研究奠定基础。方法采用Illmina Hiseq高通量测序技术对3个变种的重楼内生真菌群落基因进行扩增子序列测定,同时对菌群多样性、真菌群落差异进行生物信息学分析。结果对不同变种重楼内生真菌进行多样性分析结果显示,七叶一枝花Paris polyphylla Smith var. chinensis (Franch.) Hara、长药隔重楼Paris polyphylla Sm. var. thibetica (Franch.) Hara、具柄重楼Paris fargesii Franch. var. petiolate (Baker ex C. H. Wright) Wang et Tang三者的内生真菌的α多样性存在差异,但β多样性无显著性差异,具柄重楼中特有的OTU仅为0.27%。真菌群落注释结果表明,3个变种分别注释到6个相同的门,但组成比率不同。另外,通过LEfSe分析,初步探索了3个变种的生物标记物差异,七叶一枝花中Rhizophagus irregularis与其他2变种有显著性差异。结论 3个变种重楼内生真菌群落β多样性变化不显著,但组成比率有很大的差异性。该研究结果中药材重楼多基源质量等同性及鉴别溯源技术的开发研究提供研究基础。     

青海上北山林场野生桃儿七根部内生真菌群落组成及多样性研究

该研究通过应用第二代测序技术(NGS),即高通量测序方法测序青海野生桃儿七根内真菌宏基因组ITS 1区,并依据RDP中设置的分类阈值对处理后的序列进行物种分类,鉴定内生真菌的群落组成。研究结果显示,测序结果经过质量控制共获得有效条带22 565条,依据97%的序列相似性做聚类相似性分析,获得全部样品的可分类操作单元(OTUs)共517个,RDP分类依据0.8的分类阈值鉴定出的全部真菌可归类为13纲、35目、44科、55属。3个样品LD1,LD2,LD3中共同的优势属真菌为Tetracladium属(所占比例分别为35.49%,68.55%,12.96%),样品的香浓多样性指数和辛普森多样性指数分别在1.75~2.92,0.11~0.32。研究结果表明,青海上北山林场野生桃儿七根内内生真菌具有较高的多样性和较复杂的群落组成,蕴含着丰富的内生真菌资源,且高通量测序技术对于研究植物内生真菌群落组成及多样性具有显著的优势。     

基于ITS序列的丹参连作根际土壤真菌群落组成及多样性分析

目的:该文研究了丹参连作根际土壤真菌群落组成及多样性变化,有利于阐述丹参-土壤-真菌根际微环境的变化,为揭示连作障碍形成的原因提供理论基础。方法:基于高通量测序技术,分别对未种植丹参(CK),连作1年(Y1)及连作两年(Y2)的根际土壤进行转录间隔区(ITS)测序,3种处理中分别得到14 153,19 024及7 622条有效序列,注释为1 027,1 095及712种真菌可操作分类单元(OTU)。结果:随着连作年限的增加,真菌群落多样性呈现出先下降后上升的变化趋势。在纲分类水平上,优势菌群分别为伞菌纲(Agaricomycetes),锤舌菌纲(Leotiomycetes)及银耳纲(Tremellomycetes),在3种处理中所占比例大小分别为Y1CKY2,Y2Y1CK,CKY2Y1;在属分类水平上,CK中优势菌属为耐冷酵母(Guehomyces),Y1及Y2较CK相比分别下降96.13%和90.21%,异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces)在Y2中所占比例增幅明显(6.64%),较CK及Y1相比分别增加290.59%及564.00%。结论:CK及Y1样品中根际土壤真菌在属水平上群落结构上具有更高的相似性,Y2样品群落结构分布热图显示炭疽菌属(Cryptosporiopsis)等致病真菌成为优势菌属,推测与连作丹参病害率高有一定相关性。研究结果为阐述丹参连作障碍形成、发展绿色种植提供理论支撑。     

滇重楼内生真菌分离与多样性研究

通过研究滇重楼内生真菌菌群的多样性,为探讨内生真菌作为生物活性物质的价值提供科学依据。该文通过对云南省嵩明县、鹤庆县、保山市野生滇重楼植株的采集,从其根、块茎、叶中分离内生真菌,并基于ITS序列分析和形态学方法进行分类鉴定。试验分离得到内生真菌749株,分别归属于41个属,其中3个属仅在根部出现,12个属仅在块茎出现,8个属仅在叶部出现。各个样地分离出的内生真菌表现出一定的差异,其中鹤庆样地块茎部位分离的内生真菌多样性最高,各样地间,各部位间的内生真菌组成相似性系数低。研究认为,不同样地、不同部位的滇重楼内生真菌的差异性可能与生境以及各部位结构、成分等因素有关。     

不同栽培模式重楼内生真菌、根际真菌多样性与环境因子关联性研究

目的：探究不同栽培模式下重楼内生真菌、根际真菌多样性,并了解真菌群落与环境因子的关联性。方法：以不同栽培模式下重楼根际土壤、块茎、根部组织为材料,通过高通量测序和生物信息学分析真菌群落多样性、网络关系、功能预测,并结合土壤环境因子进行相关性分析。结果：物种组成和菌群α、β多样性分析表明,不同栽培模式下的重楼块茎和根部内生真菌、根际土真菌在物种组成与丰度上各不相同,但相同栽培模式下重楼不同组织部位菌群距离近,不同栽培模式但同一重楼部位的菌群关联性高;菌群Network网络分析揭示同一栽培模式下菌群之间关联性更高且偏正相关性,对植物有益的共生菌和促进物质能量循环的腐生菌与植物病原菌呈负相关;FUNGuild结合物种组成分析表明,采自织金(ZJ)样品的病原菌占比少、腐生菌占比高,而采自赫章(HZ)、百里杜鹃(BL)样品的病原菌占比多、共生菌占比高;菌群与环境因子热图表明,部分菌属之间与环境因子的关联性表现出相反的规律,同一栽培模式下的菌群与环境因子关联性相似。结论：重楼内生真菌、根际土真菌群落结构具有地域特征,环境因子影响重楼真菌菌群组成和丰度,可人为有目的性地调节菌群结构,以利于重楼高产栽...     

基于高通量测序研究番红花不同生长期根际土壤中真菌群落结构及多样性

目的 以新疆番红花Crocus sativus L.不同生长期的根际土壤为材料,研究土壤真菌群落结构与多样性。方法 提取番红花不同生长期的根际土壤总DNA,应用Illumina NovaSeq 6000高通量测序平台进行测序分析。结果 对番红花3个生长期[生长初期（S1）、生长中期（S2）、生长后期（S3）]的3组样本进行高通量测序,共获得4252个操作分类单元（OTUs）,包含9个真菌门,并对检测到的真菌属中相对丰度前20的真菌属进行了分析。结果发现,不同生长期番红花优势真菌群落共有门属分别是子囊菌门（Ascomycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）、链格孢属（Alternaria）、球腔菌属（Mycosphaerella）和爪甲白癣菌属（Arthrographis）。3个生长期的真菌组成有所不同,S1和S2生长期特有的属分别是平脐蠕孢属（Bipolaris）和谷菌根菌属（Archaeorhizomyces）,S3有2个特有的属和1个特有的门,分别是棘壳孢属（Setophoma）、枝孢属（Cladosporium）和油壶菌门（Olpidiomycota）。Alpha和Beta多样性分析结果表明,不同生长期番红花根际土壤真菌群落赵氏指数（Chao1）、香农指数（Shannon）和观察到的种类数（Sobs）差异有统计学意义,样本中真菌物种组成存在一定差异。结论 利用高通量测序技术可快速、全面地获得土壤真菌组成信息。番红花不同生长时期根际土壤中真菌群落结构与多样性存在差异,菌群多样性随番红花的生长呈现不断上升的趋势;在番红花不同的生长期尤其是S1土壤样本中均检测到相对丰度较高的有害菌链格孢菌属和被孢霉门。为进一步揭示新疆番红花S1易发生种球腐烂病害,以及根际真菌的多样性与番红花球茎内生真菌、病原菌相互作用机制研究提供新思路。     

基于高通量测序研究甘松根际细菌及药用部位内生细菌群落结构及多样性

目的 探析并比较野生甘松Nardostachys jatamansi与仿野生栽培甘松的根际细菌与内生细菌的种群组成、丰富度、多样性及差异性.方法 以野生甘松和仿野生栽培甘松的根际土壤、根及根茎为研究样本,基于Illumina MiSeq第二代高通量测序技术对根际土壤细菌、根及根茎内生细菌的16S rDNA V4-V5区...     

人参根际真菌群落多样性及组成的变化

连作障碍导致人参减产减收,影响人参产业的可持续发展。土壤真菌群落参与关键生态过程,其多样性及组成的变化与连作障碍相关。该研究采用高通量测序技术,分析人参根际土壤真菌群落多样性及组成的变化,阐述人参栽培模式对根际微生态的影响,为克服连作障碍提供策略。与森林土壤相比,人参根际土壤微生物多样性增加,且随着种植年限的增加,多样性增加趋势下降;真菌群落Sordariomycetes,Alatospora,Eurotiomycetes,Leotiomycetes,Saccharomycetes,Mucorales,Pezizomycetes的丰度增加。皮尔森相关分析表明,土壤理化指标影响人参根际真菌群落的丰度,pH与Dothideomycetes和Alatospora的丰度显著相关,有效钾含量与Dothideomycetes,Alatospora,Mucorales的丰度显著相关,土壤总氮含量与Sordariomycetes,Mucorales的丰度显著相关。结果表明,施肥是影响人参根际微生态的关键因素之一,优化施肥体系是克服人参连作障碍的有效途径之一。     

基于高通量测序和组织分离法的虎耳草内生真菌多样性分析及其抗氧化活性研究

目的 结合高通量测序技术和传统可培养技术对虎耳草Saxifraga stolonifera内生真菌类群及多样性进行系统分析,并对其抗氧化活性进行初筛,为虎耳草内生真菌资源的开发与利用奠定基础,也为天然抗氧剂的筛选提供了菌种资源。方法 虎耳草内生真菌多样性的分析采用Illumina Miseq高通量测序技术和组织分离法,利用化学法检测虎耳草内生真菌对1,1-二苯基-2-苦基肼自由基（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical,DPPH）、羟基自由基（hydroxyl radical,OH）和2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABT]等自由基的清除率,进而筛选出具有抗氧化活性的菌株。结果 高通量测序分析发现虎耳草内生真菌隶属于347属,其中Dactylonectria(15.68%)为根部优势菌属,茎部的优势菌属为Humicola(9.57%),而叶部优势菌属为炭疽菌属Colletotrichum(5.33%)。利用组织分离法从虎耳草...     

川贝母基源植物的鳞茎内生真菌多样性及群落分布

目的 对川贝母基源植物的鳞茎内生真菌进行分离培养和鉴定,揭示不同物种、不同分布地、不同生长年限-生理时期及野生与栽培川贝母基源植物的鳞茎内生真菌多样性和群落分布。方法 采用组织分离法分离培养川贝母基源植物的鳞茎内生真菌;用形态学观察和ITS rDNA序列比对方法对菌株进行初步鉴定;统计分析不同物种、不同分布地、不同生长年限-生理时期及野生与栽培川贝母基源植物的鳞茎内生真菌多样性和群落组成。结果 共分离培养获得隶属于9纲、20目、37科、57属、218种的348株内生真菌菌株,其中粪壳菌纲(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、丛赤壳科(Nectriaceae)、镰刀菌属(Fusarium)及Irpex lacteus 02和Thielavia terrestris 02为分离频率较高的优势内生真菌类群。梭砂贝母、维西县和苍山川贝母、四年生川贝母及栽培川贝母植物的鳞茎内生真菌多样性相对较高,不同物种、不同分布地、不同生长年限-生理时期及野生与栽培川贝母基源植物间的鳞茎内生真菌群落组成均具有显著差异。结论 本研究进一步探明了川贝母基源植物的鳞茎内生真菌多样性...     

基于16 S rRNA序列研究华重楼植株可培养内生细菌的多样性

目的分析华重楼Paris polyphylla健株和茎腐病感病植株内生可培养内生细菌的多样性。方法用牛肉膏蛋白胨培养基分离华重楼茎腐病及健康植株根茎、茎、叶等不同部位的细菌,采用16 S rRNA通用引物27F/1492R进行PCR扩增结合DNA测序技术,对分离自华重楼健株及茎腐病植株不同部位的细菌进行初步鉴定。结果从华重楼的健康植株和感病植株中分离到11属23种细菌。从健株分离到4属11种内生细菌,其中根茎、茎、叶分别分离到9、10和5种内生细菌。从病株分离得到10属14种内生细菌,其中根茎、茎、叶分别分离到11、8和3种内生细菌。华重楼健株的根茎部内生细菌量最高,达2.999×105 cfu/g,叶部内生细菌量较低,为7.32×104 cfu/g,华重楼健株根茎、茎、叶中的芽孢杆菌量最高,比例分别为73.3%、67.1%和81.8%。华重楼病株的茎部内生细菌量最高,达2.817×105 cfu/g,叶部内生细菌量较低,为2.76×104 cfu/g,华重楼病株的根茎、茎、叶部的假单胞菌量最高,比例分别为35.6%、50.3%和60.5%。华重楼健株不同部位的多样性指数和均匀度指数均高于病株。结论华重楼健康植株以芽孢杆菌为优势细菌类群,华重楼茎腐病植株以假单胞菌为优势细菌类群。华重楼健株相比病株具有更为丰富的内生细菌群落多样性。     

不同遮阴处理对七叶一枝花生长 光合特性及品质的影响

目的 七叶一枝花是典型的阴生植物,研究不同遮阴条件对七叶一枝花叶片光合作用、生长和代谢产物含量的影响。方法 在85%和95%遮阴条件下,采用紫外-可见分光光度法测定七叶一枝花叶片的光合色素含量,运用便携式光合作用测定仪测定叶片净光合速率（P_n）、胞间二氧化碳浓度（C_i）、蒸腾速率（T_r）、气孔导度（G_s）并拟合光响应曲线,测定植株的生长指标并利用超高效液相色谱-紫外法（UPLC-UV）与高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD）测定不同部位皂苷类及糖类成分含量。结果 95%遮阴条件下叶绿素含量与植株生长指标均优于85%遮阴;95%遮阴条件下叶片的日光合速率低于85%遮阴,但C_i、T_r和G_s的光响应差异无统计学意义;不同遮阴条件对重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷H、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷含量有极显著影响,且往年生根茎和须根中重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ总量在2种遮阴条件下差异有统计学意义（P<0.01）,85%遮阴较高;不同遮阴条件对根部的蔗糖含量影响较大,95%遮阴处理蔗糖含量较高。七叶一枝花移栽到北京后极喜阴,在95%遮阴下植株农艺性状得到改善。结论 研究结果为开展优化遮阴度和遮阴时间以平衡植物生长、增加活性代谢产物的积累研究提供参考。     

华重楼植株的快速繁殖研究

目的以华重楼Paris polyphylla var.chinensis根茎为外植体,建立华重楼植物的快速繁殖技术。方法以MS为基本培养基,通过研究激素6-BA、2,4-D、NAA、IBA、KT、IAA和头孢曲松钠、活性炭等对愈伤组织诱导、不定芽分化和不定根产生的影响,找出组培苗诱导培养的最佳培养基配方。结果华重楼最佳愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.5mg/L+2,4-D 3.0 mg/L;最佳不定芽分化培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L+IAA 0.3 mg/L+KT 1.0 mg/L+头孢曲松钠300 mg/L;最佳生根培养基为1/2 MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性炭0.5%。当组培苗长出第1片叶且不定根长出4条以上时将组培苗取出,先放在无菌水中栽培5 d,再移栽至松软土壤中,组培苗生长健壮,成活率为100%。结论在获得愈伤组织的基础上,进一步完成对不定芽的诱导与无根苗生根培养,筛选出了培育华重楼组培苗的最佳条件。     

七叶一枝花繁育技术研究进展

七叶一枝花作为《中国药典》重楼药材的重要来源,具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效,临床用于抗肿瘤、抗菌、止血、镇痛等。而七叶一枝花为多年生草本植物,繁殖率低,耗时长,从种子萌发到药用需7年以上时间,资源再生慢。由于近几年的过度采挖,七叶一枝花消耗量远超其野生资源生长量,导致市场售价随之飙升,严重威胁药材资源的正常生存和可持续利用。为解决这种资源匮乏和临床需求矛盾,发展人工繁育技术,培育七叶一枝花人工繁育品,已成为保护野生资源、满足临床需要的最佳途径。通过检索七叶一枝花繁育技术相关文献,对其内容进行归纳总结,并从繁殖采种及种苗培育两方面对其进行综述,为人工繁育技术提供理论指导,同时结合种苗生长过程中相关性影响的化学成分,探讨其繁育品的种植质量。七叶一枝花人工繁育技术作为培养优质繁育品的第一步至关重要,但其后续品质的检测同等关键,本文展望未来以多学科、多角度对中药七叶一枝花人工繁育品及野生品建立品质评价体系研究,以保障中药材品质质量,为近一步开发利用七叶一枝花资源提供参考。     

基于SSR分子标记的滇重楼遗传多样性研究

目的研究滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis自然居群的遗传多样性,为滇重楼资源的保护和合理利用提供数据。方法采用SSR分子标记对滇重楼5个不同居群共115份样品进行遗传多样性分析。结果筛选出8对可用SSR引物,多态位点百分率(PPB)为100%,多态信息量(PIC)为0.745 6。在居群水平和物种水平上,观测等位基因数(N_a)分别为8.425 0和17.750 0,有效等位基因数(N_e)分别为4.960 9和7.500 7,观测杂合度(H_o)分别为0.295 5和0.294 8,期望杂合度(H_e)分别为0.654 8和0.774 4,Shannon’s信息指数(I)分别为1.520 1和2.038 6。遗传分化系数(F_(st))为0.172 8,基因流(N_m)为1.196 6。利用UPGMA聚类分析,将5个居群分为2类。结论滇重楼遗传多样性水平较高,居群内和居群间具有一定的遗传分化。对保护和发展滇重楼资源提出若干措施,为滇重楼的保护和科学可持续利用提供参考。     

七叶一枝花种子萌发不同阶段生理生化变化研究

目的探讨七叶一枝花Paris polyphylla var.chinensis种子萌发不同阶段的酶和内源激素调控机制,为其种子解除休眠、萌发不同阶段采取有效处理措施,提高出苗率提供科学依据。方法通过观察和测定变温层积处理后七叶一枝花种子萌发不同阶段形态差异,采用常规的生理生化方法测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、苹果酸脱氧酶(MDH)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PDH)5种酶活性,采用质谱定量方法测定吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、反玉米素(TZ)、茉莉酸(JA)量;研究种子萌发过程中胚率与酶活性和内源激素量变化之间的相关性。结果七叶一枝花种子从未萌动、上胚轴休眠到即将出苗阶段,种子质量和胚率逐步上升;SOD和POD活性逐步升高;CAT和MDH活性逐步减弱,G-6-PDH活性出现双峰,未萌动阶段和萌动后上胚轴未伸长阶段显著高于其他阶段;IAA、GA3、ABA、JA的量逐步升高,IAA和JA量在即将出苗阶段显著高于其他阶段(P0.01);TZ和SA的量先升高后降低,TZ的量在子叶分化形成期和胚乳成熟期显著高于其他阶段(P0.01),SA出苗前期量最高,已萌动胚根刚突破种皮阶段和胚乳形成阶段量次之;CAT酶活性变化与胚率呈显著负相关,IAA和JA的量变化与胚率呈显著正相关。结论CAT对种胚的生长有抑制作用,IAA与JA对种胚的生长有正向促进作用。     

华重楼皂苷类化学成分与生态因子的相关性

目的:明确华重楼皂苷类成分与生态因子的相关性。方法:利用HPLC测定了不同华重楼样品中重楼皂苷的含量;利用数字高程模型和Arc GIS软件提取生态因子数据(年平均气温,海拔,相对湿度,年日照时数,年降水量,7月最高气温,7月平均气温,1月最低气温和1月平均气温);应用主成分分析方法确定了偏诺皂苷-3-O-β-D-glu(1→3)[α-L-rha(1→2)]-β-D-glu(PGGR),重楼皂苷Ⅶ,H,Ⅰ和Ⅴ是华重楼的主要有效成分;采用回归分析法分析了这些生态因子与重楼药材皂苷类化学成分之间的相关性和变量投影重要性,应用SPSS 22.0偏最小二乘回归方法建立了回归方程。结果:青川、洪雅、巴中的重楼皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ,Ⅶ的总量达到了2015年版《中国药典》重楼项下0.6%的最低限量标准,认为这几个产地华重楼品质较优;生态因子中日照时数,7月最高气温,7月平均温度与重楼皂苷Ⅶ和PGGR呈负相关关系,1月最低气温和1月平均气温与重楼皂苷Ⅶ和PGGR呈正相关关系。日照时数,7月最高气温,7月平均气温与重楼皂苷H,I和V呈正相关关系,海拔高度,相对湿度,年均降水量,1月平均气温与重楼皂苷H,I和V呈负相关关系。结论:明确了华重楼化学成分与气象因子之间的相关性,为培育质优、高产的华重楼提供理论基础,同时为华重楼的规范化生产提供理论支持。     

滇重楼内生真菌米曲霉中1个新的聚酮类化合物

目的研究滇重楼内生真菌米曲霉Aspergillus oryzae次生代谢产物的化学成分,以期发现新的化合物。方法采用液体发酵方式发酵,萃取后运用硅胶及大孔吸附树脂等多种色谱技术进行分离纯化,并根据理化性质和波谱数据鉴定化合物的结构。结果从滇重楼内生真菌米曲霉发酵产物中分离鉴定了3个化合物,分别鉴定为3-氨基-4,5-二羟基-4,6-二甲基-2-(2-甲基丁酰)环己-2-烯酮(1)、12-N-甲基-环-(L-色氨酰-L-苯丙氨酰)(2)和二聚色氨酸素(3)。结论化合物1为新的聚酮类化合物,命名为米曲霉聚酮A。     

丛枝菌根真菌对滇重楼内源激素的影响

目的初步探索接种不同外源性丛枝菌根(AM)真菌对滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis幼苗内源激素水平变化规律。方法以灭菌土壤为生长基质,于室温盆栽条件下对滇重楼新鲜种子与28种AM真菌共培养后采样,采用HPLC测定和比较分析各处理组滇重楼根茎和须根内源激素玉米素核苷(ZR)、赤霉素(GA)、吲哚乙酸(IAA)和脱落酸(ABA)的量。结果接种外源性AM真菌能提高滇重楼幼苗菌根侵染率和成苗率,AM真菌对滇重楼幼苗根茎和须根中ZR、GA、IAA、ABA 4种激素量的变化表现出不同的规律,但具有偏好性。与对照组相比,整体上接种AM真菌处理组根茎中ZR、GA量呈现增长的趋势,IAA量变化规律不明显,而ABA量呈现减少的趋势,接种AM真菌处理组根茎中ABA/ZR、ABA/GA、ABA/IAA值呈现减少的趋势,但须根与根茎的变化趋势相反。结论 AM真菌能促进滇重楼幼苗的存活率,且不同AM真菌菌株影响滇重楼内源激素量。