海水工厂化养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)和褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)腹水病病原菌的分离与鉴定

从患腹水病大菱鲆和褐牙鲆成鱼体内分离到两株致病作用强的病原菌FS1和FS2,经人工感染实验表明菌株FS1和菌株FS2为腹水症的致病菌。采用常规的生理生化鉴定方法及梅里埃全自动微生物分析系统(VITEK32),结合分子生物学方法进行病原菌的鉴定。结果表明,菌株FS1和菌株FS2分别为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)和溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)。菌株FS116SrRNA基因序列与迟缓爱德华氏菌的同源性达99%;菌株FS2的16SrRNA基因序列与溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌等的同源性均达99%。为最终确定菌株FS2的分类地位,测定了其HSP60基因序列,进行网上同源性比对。分析结果表明,菌株FS2与溶藻弧菌的同源性达99%,而与其他弧菌HSP60基因的同源性均低于91%。这两种致病菌混合感染或分别感染均可造成养殖鲆鱼腹水病。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus)秦皇岛弧菌感染症及其病原细菌研究

采用病原分离与鉴定、人工感染试验等方法,在对养殖牙鲆病例进行发病情况、病理变化特征检验的基础上,进行病原学检验。结果表明,此病例属于由弧菌属(VibrioPacini1854)细菌引起的败血感染症。经对12株纯培养菌(HQ010712-1—HQ010712-12)进行形态特征、理化特性等表观分类学指征的检验,选择代表菌株(HQ010712-1株)进行16S rRNA基因的测定与系统发育学分析等,判定为弧菌属的一个新种。将HQ010712-1株送中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行了复核鉴定与分类定名,依据分离地定名为秦皇岛弧菌(Vibrioqinhuangdaorasp.nov.);参考菌株为HQ010712-1。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus)细菌败血感染症及病原检验与分析

采用调查统计、剖检病变、病原分离鉴定与人工感染健康鱼致病作用试验的方法，对自然发生的养殖牙鲆细菌败血感染症病例，进行了发病情况、临床表现及病理变化等方面的检验，同时取病(死)牙鲆的肝、腹水、腐烂肌肉组织为材料进行细菌分离，对分离于10尾鱼20株纯培养菌的形态特征、理化特性等进行鉴定。结果表明，分离出来的两种细菌，一种是弧菌属(Vibrio Pacini 1854)细菌的一个新种(sp．nov．)并定名为牙鲆弧菌(Vibrio olivaceus sp．nov．)；另一种是气单胞菌属(Aeromonas Kluyver and van Niel 1936)的嗜水气单胞菌(A．hydrophila)。通过人工感染试验等表明该两种分离菌为相应感染症的致病菌。     

牙鲆工厂化养殖技术

牙鲆是荣成市工厂化养殖的重要鱼类品种。邱家渔业公司在多年牙鲆养殖的基础上,总结出了一套有益的经验,他们从3厘米～5厘米大小的牙鲆鱼苗养成至20厘米以上的牙鲆鱼,只用7个月的时间,并且鱼的养殖成活率达60％,基本上达到了国内较先进水平。现将他们的主要做法介绍如下:     

牙鲆网箱养殖试验

牙鲆的养殖在日本已有成功的经验。１９７８～１９８０年，日本曾大力发展海上牙鲆网箱养殖。虽然后来因夏季高温以及擦伤造成死亡较多，发展受到一些限制。但因它仍有有利的方面，在条件适宜的海域仍是值得使用的一种养殖方式。牙鲆是适合于我国北方海域养殖的种类，为弄清楚山东省沿海地区发展牙鲆网箱养殖的可行性和经济效益，我们在荣成市寻山艾伦湾进行了网箱养殖试验。由于国内市场没有牙鲆鱼种供应，在自然海域也捕不到足够数量鱼种供养成使用，我们的养殖试验从育苗开始，２ａ内完成一个养殖周期，实际养殖时间为１７个月。早期育苗…     

环境因子及药物对牙鲆盾纤类纤毛虫病病原纤毛虫的影响

报道了牙鲆寄生盾纤类纤毛虫病病原形态，温度，盐度、ｐＨ值对病原纤毛虫的影响，药物筛选，试验结果表明，该纤毛虫适宜生长的温度为１５￣２０℃、盐度３０￣３５‰，ｐＨ值４－６。外用药如：福尔马林，高锰酸钾，卤素类消毒剂以及淡水支该纤毛虫有较好的杀灭作用。     

一种牙鲆新病原弧菌的主要生物学特性研究

从一起呈败血症感染病例的养殖牙鲆 ( Paralichthys olivaceus L.Temminck et Schlegel ) 肝、腹水及腐烂组织中检出了一种相应的病原菌,取 10 株该病原菌的纯培养菌做形态特征、培养特性、理化特性及代表菌株 16S rRNA 基因序列测定等,表明为弧菌属 ( Vibrio Pacini 1854 ) 细菌的一个新种 ( sp. nov. ) 并定名为牙鲆弧菌 ( Vibrio olivaceus sp.nov. ).同时,对该菌进行了人工感染的致病作用及对抗菌类药物的敏感性等方面的检验,结果显示对牙鲆具有较强的致病作用,对供试的 37 种抗菌类药物在不同菌株间的敏感及耐药无明显差异.     

台湾海峡牙鲆养殖技术研究

报道了台湾海峡牙鲆(Paralichthysolivaceus)的养殖技术。经过在室内水泥池189d的饲养,共获得平均全长32.20cm,平均体质量402.10g规格的牙鲆11.5万尾,养殖成活率达96%。养殖结果表明,台湾海峡牙鲆的生长速度快于黄、渤海牙鲆;水温与牙鲆的生长关系密切,台湾海峡牙鲆适宜的温度范围为18～27℃左右;饲料中添加适量中草药对提高牙鲆的成活率有较明显作用。     

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)幼体新暴发病病原阴沟肠杆菌的分离鉴定

2010 年, 浙江湖州部分罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)育苗场在幼体培育阶段, 暴发 了幼体大规模发病死亡的新病害。从2 个育苗场6 个发病育苗池的发病幼体匀浆液中分离得到6 株 优势生长菌株(编号为NTH01、NTH02、NTH03、316D、316X、316C), 菌落形态较为一致。取代表 菌株NTH01, 以浸泡方式进行人工回感, 结果菌株NTH01 能够导致幼体发病死亡, 且症状与生产表 现一致。经形态学观察、生理生化鉴定、16S rRNA 与gyr B 基因序列系统发育关系构建, 鉴定菌株 NTH01 为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae).以阴沟肠杆菌omp A 基因片段为靶序列, 建立了PCR 检测方法, 对另外5 株优势菌进行检测, 结果该5 株菌都是阴沟肠杆菌。2011 年, 对4 个发病育苗场 幼体与亲虾进行检测, 结果发病幼体中分离的优势菌检测呈阳性, 亲虾肝胰腺与肠道组织检测到该 菌存在, 但亲虾不表现病症。对30 种抗生素的药敏试验结果表明, 菌株NTH01 对恩诺沙星、氧氟 沙星、庆大霉素等6 种抗生素敏感, 对发病幼体进行针对性用药, 效果明显。本试验结果表明, 阴沟 肠杆菌是导致罗氏沼虾育苗期间幼体大规模发病死亡的致病菌。     

牙鲆的疾病

综述当前国内外报道的养殖牙鲆危害严重的主要疾病及其防治方法。按牙鲆的病毒病、细菌病、寄生原虫病、吸虫病等顺序分别叙述了各主要病害，尤其对危害严重的病害种类如：牙鲆弹状病毒病、肠道白浊病、鳗弧菌病、腹胀病、腹水病、牙鲆出血性败血病等进行了较为详细的记述，以期对牙鲆疾病的研究提供参考材料     

牙鲆(Paralichthys olivaceus)红细胞单克隆抗体与五种养殖鱼类血细胞的交叉反应

以牙鲆血细胞为抗原免疫Balb／c小鼠，选用聚乙二醇(PEG)作为细胞融合剂，将免疫的小鼠脾细胞与P3 X63 Ag8U1骨髓瘤细胞融合，筛选、克隆出3株生产抗牙鲆红细胞单克隆抗体(Mabs)的杂交瘤细胞(1C7、286、3A1)。应用免疫荧光抗体法(IFAT)研究3株单抗与5种常见养殖鱼类(大菱鲆、花鲈、真鲷、许氏平鲉、鲫鱼)红细胞的交叉反应，结果显示，3株单抗与5种鱼类红细胞有不同程度的阳性反应；应用Western blotting法分析单抗识别的蛋白分子量，结果显示，单抗1C7与大菱鲆血细胞结合的蛋白分子量为52kD、47kD、45kD、32kD、29kD、27kD，与花鲈、许氏平 结合的蛋白分子量是52kD、29kD，与真鲷结合的为29kD，与鲫鱼结合的为44kD、29kD、28kD；单抗286与大菱鲆、花鲈血细胞结合的蛋白带分子量是30kD、28kD，与真鲷结合的为30kD，与许氏平 结合的为29kD、28kD；单抗3A1没有Western blotting反应。结果表明，这6种鱼红细胞存在相同或相似的抗原决定簇，蛋白成分具有相似性。     

山东省威海市牙鲆增殖放流试验研究

根据１９９９年在山东省威海市进行的牙鲆增殖放流试验,探讨了在该地区增殖放流的可行性及剪景,并且对比了网箱养殖、池塘养殖和放流增殖三种方式的经济效益,认为该地区适宜放流增殖并有明显的经济效益,应予以推广。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus)β诺达病毒衣壳蛋白重组表达及复性条件优化 组表达及复性条件优化

β诺达病毒利用其缺乏校正功能的聚合酶进行基因组复制, 易导致突变, 因而具有广泛的宿主感染性, 而且可引发致死率极高的病毒性神经坏死症, 需要有针对性地研究检测及防御方法。本研究以感染牙鲆(Paralichthys olivaceus)的β诺达病毒为对象, 利用引物设计, 将His标签编码序列连接到完整病毒衣壳蛋白C端, 构建原核表达载体; 采用SDS-PAGE及质谱对表达产物进行分离和鉴定; 重组衣壳蛋白经镍离子亲和柱纯化后进行复性条件的正交优化。结果表明4个肽段经质谱鉴 定与预期一致; 纯化产物产量可达36mg/L; 4°C条件下, 复性缓冲液中尿素和PBS的最适浓度为0.8mol/L和0.05mol/L。本研究建立的制备方案可为研制相关疫苗以及开发针对该病毒的快速检测产品等提供有价值的参考。     

养殖牙鲆卵巢发育及其调控的组织学研究

采用石蜡切片技术、H．E染色和免疫组织化学方法，对工厂化养殖雌性牙鲆的性腺发育进行了深入的研究。实验鱼体长范围为28～38cm，卵巢发育较迟缓，均处于Ⅱ期；实验中给予外源激素进行调控，结果发现单独注射LHRH—A2（25μg／kg体重）、hCG（1000IU／kg体重）和这两种激素的联合注射（LHRH—A2：12．5μg／kg体重，hCG：500IU／kg体重），均未能有效促进牙鲆性腺的进一步发育。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus)与大菱鲆(Scophthalmus maximus)受精前期微管骨架的免疫荧光观察

利用免疫荧光显微技术研究观察了牙鲆和大菱鲆正常二倍体受精卵从胚盘形成到4-细胞期微管骨架的动态变化过程,获得了一系列中心体、纺锤体及核的变化图像。牙鲆和大菱鲆正常发育的受精卵中微管骨架结构-纺锤体和中心体的动态变化过程基本相似,纺锤体及微管的形态结构也基本相似,大部分受精卵的微管骨架结构随卵裂呈现明显的周期性变化。在相同培育温度下,大菱鲆受精卵的胚盘形成时间要比牙鲆受精卵的胚盘形成时间晚10min左右,这与解剖镜下现场观察的结果相一致。首次利用免疫荧光显微技术从分子细胞生物学角度对牙鲆和大菱鲆进行细胞学观察,为进一步对其进行染色体操作提供分子细胞学依据。     

养殖牙鲆鳗弧菌疫苗的研究

以牙鲆病原性鳗弧菌M3为抗原,制备了细胞（CV）、细胞－胞外产物（CEV）、脂多糖（LPS）三种疫苗,通过浸泡和注射两种途径对牙鲆进行两次免疫,检测疫苗的免疫保护效果。免疫后4周可检测到免疫组牙鲆具有明显的凝集抗体效价,其中注射组效价显著高于浸泡组,而对照组变化不明显。与对照组相比,免疫组牙鲆获得良好的免疫保护力,其中注射免疫组高于浸泡组。在注射免疫途径中,以CEV的免疫保护效果最好;在浸泡免疫途径中,以CEV和LPS的免疫保护效果最好。结果表明鳗弧菌M3的细胞－胞外产物苗有显著的免疫保护作用。     

牙鲆嗅上皮超微结构研究

扫描电镜和透射电镜研究显示：牙鲆Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓｏｌｉｖａｃｅｕｓ嗅上皮的边缘为非感觉区，内侧为连续的感觉区，属嗅觉鱼类。非感觉区由表皮细胞、粘液细胞及基底细胞等组成，表皮细胞在游离面相互连接形成似指纹状的嵴的结构。感觉区由纤毛感觉细胞、微绒毛感觉细胞、纤毛非感觉细胞、支持细胞及基底细胞等组成。     

大菱鲆与牙鲆育苗异同的研究

本文结合多年生产实践,比较了大菱鲆与牙鲆人工育苗的异同,在人工繁殖、发育特征、苗种培育、营养与饲料、疾病预防等方面进行了研究,从而为大力发展大菱鲆与牙鲆的人工育苗、提高苗种数量和质量提供技术参考。     

假雄牙鲆消化器官中碱性磷酸酶比活性的研究

碱性磷酸酶(alkaline phosphatases)是一种内源性酶，几乎存在于所有动物的细胞膜(plasma membrane)中，它在许多代谢活动中，如动物的生长、蛋自质的合成、营养成分的转运、类固醇的生成等方面都发挥着重要的作用(Ram et al.，1985)。因此，对于碱性磷酸酶的研究，有利于了解鱼类的消化生理，并有助于更深刻地理解鱼类体内营养成分的吸收和转运机制。假雄牙鲆是在雌性牙鲆的一定生长发育阶段，用人工诱导的方法使之性转化所获得的。对于假雄牙鲆的生理、生化特性的研究，至今还未见正式报道。本实验以一年龄假雄牙鲆为研究对象，研究了不同消化器官中碱性磷酸酶的比活性，并初步探讨了在不同发育时期碱性磷酸酶比活性的变化，从而能够更深刻地理解假雄牙鲆体内营养成分消化与吸收的过程和机制，并有助于牙鮃的人工培育。