His-tag 不影响 RSV 重组蛋白GIF/M2 的免疫原性

目的:观察 His-tag 是否影响 RSV 重组蛋白 GIF/M2 的免疫原性.方法:PCR 扩增 G1 和 F/M2 基因片段,插入表达载体 pET-His 和 pET-DsbA-His 中,转化E.coli BL21(DE3),IPrG 诱导表达,采用 Ni+螯合亲和层析法纯化得 His-GlF/M2 和 DsbA-His-GIF/M2,将后者用凝血酶消化,再经Ni+螯合亲和层析法纯化得 GIF/M2,将 His-GIF/M2 和 GIF/M2 免疫 BALB/c 小鼠,用 ELISSA 测定抗体滴度,MTT 法测定细胞毒性 T 细胞活性(CTL).结果:两种蛋白在BALB/ c 小鼠中诱导的 RSV 特异性抗体和 CTL 活性无显著差异.结论:His-tag 不影响 RSV 重组蛋白GIF/M2 的免疫原性.     

RSV CTL表位与G蛋白片段的融合表达对G蛋白片段诱导的免疫应答的调节作用

目的：观察呼吸道合胞病毒（RSV）的CTL表位F/M2与G蛋白抗原活性片段G1融合表达后，对G1诱导的免疫应答的调节作用。方法：将重组表达质粒pET-DsbA-G1和pET-DsbA-G1F/M2分别转化E.coli BL21（DE3），诱导表达融合蛋白DsbA-G1和DsbA-G1F/M2，亲和层析纯化。取上述蛋白，腹腔注射免疫BALB/c小鼠，定期采集血清和脾细胞，用MTT法测定CTL杀伤活性，ELISA测定IgG及其亚类IgG1和IgG2a抗体滴度，空斑抑制实验检测血清中和抗体。结果：经表达和纯化获得了纯度达90%以上的融合蛋白；DsbA-G1F/M2诱导了显著的RSV特异性CTL杀伤活性，而无CTL表位的DsbA-G1则不能诱导产生CTL反应；DsbA-G1F/M2和DsbA-G1均刺激产生了强烈的IgG抗体应答，但DsbA-G1所产生的IgG亚类仅为IgG1，而DsbA-G1F/M2同时诱导了高滴度的IgG1和IgG2a，显著下调了IgG1与IgG2a的比例；二者均诱导了高滴度的中和抗体，但与DsbA-G1相比，DsbA-G1F/M2所诱导的中和抗体滴度有所减弱。结论：CTL表位F/M2与G蛋白片段G1的融合表达产物DsbA-G1F/M2，能够同时诱导细胞免疫和体液免疫应答，CTL的激活下调了IgG1与IgG2a的比例，使得免疫应答更平衡，有利于改善该候选疫苗的安全性。     

IL-23、IL-27对RSV重组蛋白疫苗免疫原性的影响

目的:以编码IL-23和IL-27的真核表达质粒pcDNA3.1-IL-23(以下简称IL-23)和pcDNA3.1-IL-27(以下简称IL-27)为佐剂,与呼吸道合胞病毒(RSV)重组蛋白疫苗G1F/M2共免疫小鼠,观察IL-23和IL-27对疫苗的免疫原性的影响。方法:以IL-23、IL-27质粒和Al(OH)3为免疫佐剂,与G1F/M2共免疫BALB/c小鼠,末次免疫后10天杀死小鼠,用ELISA检测特异性IgG、IgG1和IgG2a水平;流式细胞术检测小鼠脾细胞CD4+、CD8+细胞的变化;用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测特异性小鼠脾细胞杀伤活性。结果:G1F/M2+Al(OH)3+IL-23和G1F/M2+Al(OH)3+IL-27可诱导高效价的IgG、IgG1、IgG2a抗体,且显著高于这三种佐剂单独使用诱导的抗体效价;流式细胞检测结果显示G1F/M2+IL-23和G1F/M2+Al(OH)3+IL-23刺激的CD4+T细胞和CD8+T细胞水平显著高于其他组;单独的IL-23或IL-27对G1F/M2诱导的脾细胞杀伤活性没有增强作用,而Al(OH)3+IL-23和Al(OH)3+IL-27佐剂组的杀伤率显著高于单独的IL-23、IL-27或Al(OH)3组。结论:这些结果表明:IL-23或IL-27质粒与传统铝盐佐剂Al(OH)3联合使用能显著增强RSV重组疫苗G1F/M2的免疫原性。     

呼吸道合胞病毒G和F蛋白诱导细胞因子免疫反应的研究进展

呼吸道合胞病毒是引起儿童急性肺炎、支气管炎、哮喘等疾病的主要病原体。目前国内外仍没有安全有效的预防性疫苗。呼吸道合胞病毒感染引起相关细胞因子异常表达可能是导致呼吸道病理性损伤的主要原因,G黏附蛋白和F糖蛋白是疫苗研究的常用抗原,在诱导细胞因子分泌、调节宿主免疫应答、促使病毒逃逸免疫系统等免疫机理方面有重要作用。本文对RSV G和F蛋白诱导产生细胞因子及相关免疫应答调节机理研究进展做一简要综述。     

呼吸道合胞病毒融合蛋白F在重组杆状病毒表达系统中的表达及抗原性研究

目的 利用杆状病毒表达系统对RSV A型Long株F基因进行表达研究,为RSV重组亚单位疫苗的研制奠定基础.方法 用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增F基因,将其克隆到pFastBacHT A载体中,阳性重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,PER鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得含F基因的重组杆状病毒质粒,重组病毒感染Sf9细胞72 h后,进行SDS-PAGE电泳、间接免疫荧光和Western-blot试验.免疫Balb/c小鼠,用ELISA测定抗体滴度,MTT试验检测T淋巴细胞增殖.结果 目的 蛋白F在昆虫细胞中有特异性表达,能被F蛋白单克隆抗体所识别,该蛋白诱导了高滴度的RSV特异性抗体.结论成功克隆RSV F基因,并在Sf9昆虫细胞中获得表达,该蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究开发RSV重组亚单位疫苗奠定了基础.     

北京地区正常人群血清中呼吸道合胞病毒F和G蛋白…

以表达呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）Ｆ和Ｇ蛋白的重组痘苗病毒作为抗原，用间接免疫荧光法检测北京地区不同年龄组正常儿童及成人血清中ＲＳＶ Ｆ和Ｇ蛋白特异性ＩｇＧ抗体。其结果表明：成人及产妇静脉血中有中等滴度的ＲＳＶ抗体及较低水平的Ｆ和Ｇ蛋白特异性ＩｇＧ抗体。初生婴儿脐带血中的ＲＳＶ Ｆ和Ｇ蛋白ＩｇＧ抗体水平同母亲静脉血中的一致，表明属母传抗体。婴幼儿ＲＳＶ抗体水平在生后６个月内迅速降低，６个月以后抗体的滴     

呼吸道合胞病毒G蛋白基因重组质粒诱导小鼠免疫保护性及机制研究

目的 构建编码呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白基因的重组质粒,观察其对RSV感染小鼠的保护性及特异性免疫效应,为研制安全有效的RSV新疫苗提供线索和实验依据.方法 利用基因重组方法构建含RSV G蛋白编码基因的重组质粒,测序和酶切鉴定,Western blot检测目的 基因经体外表达后的免疫原性.重组质粒免疫小鼠后以RSV感染,病毒滴定法检测肺组织标本中RSV滴度,HE染色法检查肺组织病理改变,ELISA检测血清抗体水平,双抗体夹心ELISA测定肺泡灌洗液(BALF)内Th1/Th2细胞因子表达量,流式细胞术检测BALF中T淋巴细胞亚群数量及活化状态.结果 成功构建了编码RSV G蛋白基因的重组质粒pcDNA3.1~G.Western blot证实目的 蛋白在体外具有免疫原性.被免疫小鼠感染RSV后肺组织病毒滴度降低,肺组织中未见明显的炎性细胞浸润.小鼠血清中产生较高滴度的抗RSV-G IgG.小鼠BALF细胞中CD4~+CD25~+T淋巴细胞比例显著增加,并且IFN-γ(Th1)、IL-4(Th2)两类细胞因子表达显示平衡.结论 编码RSV G蛋白基因的重组质粒pcDNA3.1~G能诱导产生CD4~+ CD25~+T细胞亚群,对小鼠具有明显的保护作用.     

中国呼吸道合胞病毒地方株G蛋白在重组痘苗病毒中的表达

目的　构建表达中国呼吸道合胞病毒 (RSV)地方株G蛋白基因的重组痘苗病毒 ,以用于RSV感染防治的研究。方法　用基因克隆技术将中国RSV地方株G蛋白基因插入到痘苗病毒载体中 ,与痘苗病毒共感染获得重组病毒。用免疫印迹、ELISA、蚀斑减少试验等方法检测表达产物的免疫原性及生物活性。结果　RSV地方株G蛋白在痘苗病毒中获得较好的表达 ,表达产物的糖基化程度较高 ,且该重组病毒免疫家兔可诱发特异性抗体产生。蚀斑减少试验证明 ,用该表达产物制备的抗血清具有中和病毒的活性。结论　重组病毒表达的中国RSV地方株G蛋白具有较好的抗原性、免疫原性等生物活性     

呼吸道合胞病毒F蛋白研究进展

人呼吸道合胞病毒（RSV）融合蛋白（F蛋白）为病毒表面结构蛋白,可以刺激机体产生保护性抗体和细胞免疫反应。因此对F蛋白的深入研究将有助于了解病毒感染的机理,从而为研究RSV的免疫机理、研制特定部位的亚单位或多肽疫苗提供帮助。     

北京地区正常人群血清中呼吸道合胞病毒F和G蛋白特异性IgG抗体水平的观察

以表达呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）Ｆ和Ｇ蛋白的重组痘苗病毒作为抗原，用间接免疫荧光法检测北京地区不同年龄组正常儿童及成人血清中ＲＳＶＦ和Ｇ蛋白特异性ＩｇＧ抗体。其结果表明：成人及产妇静脉血中有中等滴度的ＲＳＶ抗体及较低水平的Ｆ和Ｇ蛋白特异性ＩｇＧ抗体。初生婴儿脐带血中的ＲＳＶＦ和Ｇ蛋白ＩｇＧ抗体水平同母亲静脉血中的一致，表明属母传抗体。婴幼儿ＲＳＶ抗体水平在生后６个月内迅速降低，６个月以后抗体的滴度随年龄消长，７－１４岁时水平最高。Ｆ和Ｇ蛋白特异性ＩｇＧ抗体滴度在生后６个月内无明显降低，但低于大年龄组儿童。６个月后Ｆ和Ｇ蛋白抗体滴度显著升高并随年龄波动，Ｆ较Ｇ蛋白更为显著，分别在３～７岁（Ｆ蛋白）和７－１４岁（Ｇ蛋白）组中达是高滴度。从ＲＳＶ，Ｆ和Ｇ蛋白三种特异性ＩｇＧ抗体间的相关性来看：ＲＳＶ分别同Ｆ和Ｇ蛋白抗体呈现明显的相关性，但Ｆ和Ｇ蛋白特异性ＩｇＧ抗体间无明显相关性。     

人呼吸道合胞病毒融合糖蛋白非复制型重组腺病毒的构建和表达

目的 构建含有A亚型人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus,RSV)融合糖蛋白(Fusion glycoprotein,F)基因的非复制型第一代重组腺病毒(First generation odenovirns vector,FGAd),并研究F基因在重组腺病毒中的表达.方法 利用限制性内切酶Xho Ⅰ和HindⅢ从质粒pGEM3zf-F中切下目的 基因F,克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV,再与pAdeaRy-1在大肠埃希菌BJ5183中进行同源重组,鉴定正确后,用脂质体法转染293细胞,Western Blot鉴定目的 基因表达.结果 获得了表达RSV F基因的非复制型重组腺病毒FGAd/F,Western Blot检测到F基因的表达.结论 获得一株可表达A亚型BSV F的非复制型重组腺病毒FGAd/F,可用于体内研究观察其免疫效果及免疫保护作用.     

5株呼吸道合胞病毒地方株F蛋白基因序列分析

目的呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）Ｆ蛋白是ＲＳＶ感染免疫中最重要的病毒蛋白，为了解我国ＲＳＶ地方株Ｆ蛋白的基因状况和变异特征，随机选取北京、广州、长春和河北四个地区具有不同流行特征的ＲＳＶ地方株（Ａ亚型）５株，进行ＲＳＶＦ蛋白全基因的核苷酸序列分析。方法以提取的病毒ｍＲＮＡ为模板进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增、目的基因的克隆及序列测定，对地方株及原型株的序列进行比较分析。结果地方株Ｆ蛋白基因与原型株Ａ２株有很高的同源性，核苷酸全序列的同源性为９５．１％～９６．１％，氨基酸同源性为９６．７％～９７．４％。核苷酸有义突变率为２２．６％～２５．９％。３非编码区的核苷酸序列比蛋白编码区变异显著。河北地方株（Ｅ７３株）在３非编码区有６个核苷酸的插入。Ｆ２亚单位的氨基酸变异高于Ｆ１亚单位。在北京地方株（ＺＨＳ１３株）Ｆ１亚单位内，由具有中和能力单克隆抗体所识别的抗原表位区中存在一个氨基酸的变异。结论我国ＲＳＶ地方株与原型株之间的Ｆ蛋白基因尽管存在一定的变异，但仍有很高的同源性。地方株间Ｆ蛋白的核苷酸、氨基酸变异的位置及形式很相似，提示我国ＲＳＶ的不同流行特征可能并非由于Ｆ蛋白的基因变异所致。     

Molecular diversity of the aminoterminal region of the G protein gene of human respiratory syncytial virus subgroup B

Two major antigenic subgroups (designated A and B) have been described for human respiratory syncytial virus (HRSV). Between and within the two main subgroups, there is antigenic variation in the attachment protein G. The variability of the G protein is known to be located in two hypervariable regions of the ectodomain. Most investigators have studied the gene segment coding the C-terminal end of the protein, and little is known about the N-terminal variable region. In the present study, the genetic variability of HRSV subgroup B was evaluated by nucleotide sequencing of the N-terminal region of the G gene of 52 Tunisian isolates. Tunisian subgroup B isolates clustered into two main lineages designated arbitrarily as Tu-GB1 and Tu-GB2. Three distinct subtypes were identified within genotype Tu-GB2. The inter- and intragenotype nucleotide variability ranged from 4 to 8% and from 0 to 4%, respectively. Overall divergence values of the G sequences were inferior or equal to 15% at the aminoacid level. Comparison of sequences among Tunisian HRSV strains and viruses isolated in other geographical areas during different epidemics demonstrated close similarity to strains from Kenya, Belgium, the UK, Qatar, Canada and South Korea.     

HSPs对呼吸道合胞病毒重组蛋白抗原免疫应答的调节作用

目的考察热休克蛋白HSP70对呼吸道合胞病毒(RSV)重组蛋白抗原G1F/M2免疫应答的调节作用。方法构建并表达了Javelin-G1F/M2重组蛋白,在G1F/M2的N端引入Javelin序列,通过该序列可以实现重组蛋白与HSP70蛋白高亲和力结合。以HSP70:Javelin-G1F/M2复合物等免疫Balb/c小鼠,用乳酸脱氢酶释放法测定CTL活性,ELISA法测定IgG及其亚型IgG1和IgG2a抗体滴度,空斑抑制实验测定血清中和抗体。结果经表达和纯化获得了纯度达90%以上的融合蛋白;皮下免疫HSP70:Javelin-G1F/M2复合物可诱导高滴度的IgG抗体和强的CTL应答,其抗体滴度和CTL应答强度均优于Javelin-G1F/M2加铝佐剂腹腔免疫和单独Javelin-G1F/M2皮下免疫。HSP70:Javelin-G1F/M2复合物在诱导中和抗体方面与Javelin-G1F/M2加铝佐剂腹腔免疫基本相当。HSP70:Javelin-G1F/M2复合物可以诱导更强的IgG2a应答,IgG的亚型IgG1/IgG2a的比值明显低于Javelin-G1F/M2加铝佐剂腹腔免疫组和单独Javelin-G1F/M2皮下免疫组。结论 HSP70可能通过增强CTL应答进一步纠正Th2型优势应答,使得Th1/Th2应答更加平衡。     

TH1细胞在呼吸道合胞病毒毛细支气管炎发病机制中的作用

目的：探讨呼吸道合胞病毒（RSV）毛细支气管炎（毛支）发病中是否存在THl细胞免疫反应。方法：用ELISA法检测58例RSV毛支患儿急性期血浆IL-2含量。根据临床评分标准、供氧和住院时间长短的标准，进行严重程度分组并比较。结果：RSV毛支急性期血浆IL-2含量变化很大（0～4175ng／ml），中位数96ng／ml（4．0～530．1）。各组间比较，IL-2水平差异无显著性（均P〉0.05）；且IL-2水平与各严重因素无明显相关性（P〉0．05）。结论：TH1细胞可能不参与RSV毛支的发病机制，IL-2的改变可能系其他原因所致。