猪圆环病毒2型套式PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank登录的猪圆环病毒2型(PCV2)的全基因组序列，设计了2对引物．建立了检测PCV2的套式PCR方法。对该方法用序列分析、酶切等方法进行了鉴定。同时用该套式PCR方法对华南地区287个猪场的1560份样品进行了检测，结果，983份为PCV2阳性，阳性率为63％。     

鸭圆环病毒巢式PCR检测方法的建立及应用

鸭圆环病毒病给养鸭业造成严重的经济损失,鉴于此,本研究根据GenBank登录的鸭圆环病毒(duck circovirus,DuCV)保守区基因组序列(登录号:NC_005053.1),设计合成内、外2对引物,通过PCR反应条件的优化,建立了检测DuCV的巢式PCR检测方法。该方法对鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭细小病毒、新城疫病毒的扩增结果均为阴性;第1轮扩增的灵敏度为10 pg,第2轮扩增的灵敏度为0.1 pg,通过巢式PCR,敏感性提高了100倍。本研究建立的巢式PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点,可以准确快速的用于鸭圆环病毒的病原检测。     

鸭细小病毒套式PCR检测方法的建立与应用

鸭细小病毒是新近发生的引起樱桃谷肉鸭短喙、长舌、发育迟缓的1种新型水禽细小病毒,目前尚无可靠的快速诊断方法。本研究根据鸭细小病毒的VP3基因设计了2对特异性引物,建立了套式PCR检测方法。该方法对鸭细小病毒DNA的最低检出量为100copies,不能扩增鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭肠炎病毒等。采用该方法对采自山东、江苏、安徽等地的30份疑似鸭细小病毒感染病料进行检测,结果显示阳性率为27/30(90%),与病毒分离结果符合率为90%;而普通PCR的阳性检出率为8/30(26.7%)。上述结果表明,建立的套式PCR方法具有较高的敏感性和特异性,可用于鸭细小病毒的临床诊断和分子流行病学调查。     

鸭新城疫病毒和鸭圆环病毒二重PCR检测方法的建立

本研究根据GenBank中鸭新城疫病毒(NDV)的F基因和鸭圆环病毒(DuCV)的V1/rep基因的保守序列,各设计一对特异性引物,并对二重PCR的扩增条件进行优化,建立了鸭NDV和DuCV的二重PCR检测方法。对混合样品进行扩增,得到2条大小为493bp(鸭NDV)和218bp(DuCV)的特异性条带,与预扩增片段相符。而对番鸭细小病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭源小鹅瘟病毒、鸭H9亚型流感病毒、鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、禽多杀性巴氏杆菌等病原检测,结果为阴性。该方法的敏感性试验表明,鸭NDV的核酸最小量为40fg,DuCV为20fg。     

应用套式PCR方法检测猪圆环病毒2型

根据Genbank中发表的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因序列,设计2对PCV2特异性引物,建立套式PCR检测方法。外测引物p1、p2扩增片段长度为647bp(92-738),内测引物p3、p4扩增长度为219bp(319-537)。其中用外部引物可扩增DNA含量到10-5mg/mL,而套式PCR则比普通PCR灵敏性还要提高103倍。用该方法对山东、安徽和河北10省的899份临床发病猪的肺脏和淋巴结样品进行检测,结果有329份样品检测出阳性,平均阳性检测率达36.6%。由此可见,PCV2感染在全国范围内的发病猪群中普遍存在。     

鸭圆环病毒PCR检测方法的建立与应用

鸭圆环病毒病是由鸭圆环病毒(duck circovirus,DuCV)引起的一种重要免疫抑制病,影响着我国养鸭业的发展。为建立针对DuCV的PCR快速检测方法,对GenBank中登录的DuCV全基因组序列进行遗传进化分析,通过对两种基因型的DuCV全基因组序列进行比对,在共同保守区筛选出1对引物,建立了可以同时检测DuCV两种基因型的PCR快速检测方法,并对该方法的敏感性和特异性进行评价。结果显示,该方法具有良好的敏感性,检测下限达1.0 fg;特异性良好,对其他常见鸭病毒核酸检测均为阴性;利用该方法对20份临床发病鸭样品进行检测,发现有6份呈DuCV阳性,序列分析表明均属于DuCV-1。该PCR检测方法的建立为鸭圆环病毒病的快速诊断和防控提供了重要手段。     

检测2种基因型鸭圆环病毒双重PCR方法的建立与应用

为了研究2种基因型鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)在我国鸭群中的混合感染情况,根据鸭圆环Cap蛋白基因序列设计了4条特异性引物,建立了可以同时检测2种基因型DuCV的双重PCR检测方法。结果显示,该方法特异性强,灵敏度高,最低可检测到1拷贝的DuCV核酸。使用建立的双重PCR方法对收集的山东省6个鸭群150只病死雏鸭的组织DNA进行检测,结果显示有50.0%(3/6)的鸭群检出DuCV-1和DuCV-2的混合感染,33.33%(2/6)的鸭群检出DuCV-2的单独感染。19只雏鸭被检出感染DuCV,其中2.67%(4/150)的雏鸭检出DuCV-1和DuCV-2的混合感染,10.0%(15/150)的雏鸭只感染DuCV-1或DuCV-2。结果表明,山东省鸭群中存在较为严重的DuCV-1和DuCV-2混合感染的现象。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒逆转录套式PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的Ⅰ型鸭肝炎病毒（DHV—Ⅰ）A66株的RNA聚合酶基因序列,设计合成了2对引物,建立了适合DHV-I快速检测的逆转录套式PCR方法（RT-nested-PCR）,采用该方法对DHV-Ⅰ A66弱毒株和R85952强毒株进行了检测。结果显示,均能扩增到304bp的条带,而正常鸭胚、健康鸭肝组织、鸭瘟病毒、鹅细小病毒、禽流感病毒（H9亚型）、新城疫病毒、传染性腔上囊病病毒、减蛋综合征病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌和鸭源多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100Pg,第2次扩增的敏感性是1fg,第2次比第1次扩增的敏感性高10^6倍。表明,所建立的逆转录套式PCR方法可用于鸭病毒性肝炎（DVH）的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查等。     

鸭圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中鸭圆环病毒(DuCV)基因序列,在保守区设计了1对引物,建立了SYBER GreenⅠ荧光定量PCR检测鸭圆环病毒的方法。结果:该方法可检测到每个反应相当于1×102个拷贝的标准品DNA。与H9亚型禽流感、小鹅瘟、鸭瘟、鸭肝炎病毒等不发生交叉反应,且具有良好的重复性。表明建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上DuCV感染的检测。     

鸭源新城疫病毒、鸭瘟病毒和鸭圆环病毒三重PCR检测方法的建立

为了建立能同时检测鸭源新城疫病毒(DuNDV)、鸭瘟病毒(DPV)和鸭圆环病毒(DuCV)的方法,根据DuNDV、DPV和DuCV基因的保守序列设计了3对特异性引物,预特异扩增DuNDV片段大小为823 bp,DPV为576 bp和DuCV为338 bp.经过反应条件的优化,建立了DuNDV、DPV和DuCV的三重PCR检测方法.该方法特异性好,对鸭的其他病原检测结果为阴性;敏感性高,DuNDV、DPV和DuCV的核酸最低检出限分别为2.59×103、1.12×103、4.67×102拷贝/μL.对180份病料进行检测,结果DuCV阳性10份,阳性率为5.6％;DuNDV阳性1份,阳性率为0.56％.结果表明,建立的多重PCR方法可以应用于DuNDV、DPV和DuCV的临床检测和流行病学调查.     

鸭副黏病毒和鸭圆环病毒二重荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸭副黏病毒(DPMV)和鸭圆环病毒(DuCV)保守基因序列,设计了2对针对鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的特异性引物和2条不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的二重荧光定量PCR检测方法。该方法敏感性好,对鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的检测敏感性分别达到160和140个拷贝数;该方法特异性强,对鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、鸭瘟病毒和H9型禽流感病毒等病原体的检测全为阴性;应用该方法对118份临床病料进行检测,结果检出鸭副黏病毒和鸭圆环病毒阳性感染率分别为0.85%和8.47%,无混合感染。本试验建立的二重荧光定量PCR具有快速、特异、敏感和重复性好等优点,适用于鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的快速诊断和监测。     

鸭圆环病毒LAMP可视化检测方法的建立

根据GenBank中DuCV基因序列,在保守区设计了6条特异性引物,并对反应条件进行优化,建立了一种适用于鸭圆环病毒（DuCV）的环介导等温扩增快速检测方法（LAMP）。该方法对H9亚型禽流感、小鹅瘟、鸭瘟、鸭肝炎、鸭副黏病毒均无扩增反应;且扩增反应只需在常规水浴锅中进行,1小时内即可完成反应;对DuCV模版DNA的最小检测限为10龟,灵敏度是一步法PCR的1000倍。本研究建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,适合在基层进行DuCV的快速检测。     

李斯特菌套式PCR快速检测方法的建立及初步应用

根据GenBank数据库的单核细胞增生李斯特菌iap基因设计2对引物,建立了套式PCR快速检测单增李斯特菌的方法。两对引物分别扩增出约1 500 bp和500 bp片段,与预期大小一致。套式PCR方法灵敏性实验检测极限为10 cfu/mL;人工污染猪肉检测极限为103cfu/mL;整个检测过程可在7 h内完成。采用该法对南海口岸进口的冻肉进行检测,检测出9份阳性,与传统的细菌分离方法完全一致,说明套式PCR方法具有很好的特异性。     

番鸭细小病毒与鸭圆环病毒二重PCR方法的建立

根据基因库中鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的基因序列,分别设计了两对特异性引物,通过对二重PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时鉴别检测鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的二重PCR方法。用该方法对同一样品中鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的模板进行PCR扩增,结果均得到了与实验设计相符的351bp（鸭圆环病毒）和474bp（番鸭细小病毒）的扩增条带,而对鸭Ⅰ型肝炎病毒、鹅细小病毒、鸭副黏病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等病原体的检测全为阴性。敏感性测定结果表明：该二重PCR技术最低能检出100fg的鸭圆环病毒和番鸭细小病毒DNA模板。研究建立的鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的二重PCR方法,具有快速、敏感、特异、定量和重复性好等优点,可用于临床上鸭圆环病毒和番鸭细小病毒感染的检测。     

J亚群禽白血病病毒套式PCR检测方法的建立

本试验根据GenBank中登录的禽白血病病毒(ALV)基因组序列,设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为478 bp,内部引物的扩增片段大小为314 bp,建立了适合ALV快速检测的套式PCR方法(nested-PCR)。采用该方法对ALV毒株进行了检测,试验结果表明,能扩增到314 bp的条带,禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒、禽网状内皮增生病病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100 pg,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高10⁵倍。所建立的套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于禽白血病病毒(ALV)的临床诊断和分子流行病学调查等。     

鸭新城疫病毒与番鸭细小病毒二重PCR方法的建立

根据GenBank中新城疫病毒(NDV)L基因和番鸭细小病毒(MDPV)Vp3基因的保守序列,采用Primer Premier 5.0软件设计并合成了2对引物。通过优化反应条件及特异性、敏感性评价,建立了能同时检测鸭源NDV和MDPV的二重PCR方法。该方法对鸭源NDV和MDPV的检测敏感性分别为30和16 fg。同时使用该方法对鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭圆环病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭黄病毒、沙门氏菌、大肠杆菌和禽多杀性巴氏杆菌进行检测,结果显示全为阴性。本研究建立的鸭源NDV和MDPV的二重PCR检测方法,具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于鸭源NDV和MDPV感染的快速鉴别检测。     

广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查

为了解广西鸭圆环病毒(duck circovirus,DuCV)感染情况,根据已发表的鸭圆环病毒序列合成了1对PCR引物,利用该引物对采集于百色、柳州和桂林3个市的321份鸭组织样品进行了检测。结果表明,58份样品能扩增出228 bp的特异条带,总阳性率为18.07%;且3个市均能检出阳性样品,阳性率分别为18%（54/300）、5.6％（1/18）和100％（3/3）。结果证实,广西百色、柳州、桂林地区的鸭群中不同程度地存在鸭圆环病毒感染现象。     

2019年我国部分地区鸭圆环病毒基因序列测定与分析研究

为了解近年鸭圆环病毒流行毒株的基因遗传特点和变异情况,通过采用PCR的方法对我国部分地区的30份鸭圆环病毒阳性样品进行全基因组扩增与克隆、序列测定及遗传进化分析。结果显示:30株DuCV流行毒株之间的全基因序列同源性为85.8%~99.9%,其中26株DuCV的全基因序列长为1993~1995 bp,与德国代表株处于同一进化分支,属于基因1型,4株DuCV的全基因序列仅有1988 bp,与中国台湾代表株属于同一进化分支,属于基因2型;Cap蛋白和Rep蛋白的氨基酸序列的变异分析表明Cap蛋白的变异程度要显著高于Rep蛋白。