集缩素NCAPG对非小细胞肺癌增殖和凋亡的影响及其可能机制

目的 探讨非小细胞肺癌细胞中集缩素NCAPG表达对A549与H1299细胞增殖、凋亡的影响及其机制.方法 构建shRNA-NCAPG慢病毒载体转染A549及NCI-H1299细胞,实时定量PCR法(qRT-PCR)及免疫印迹法(Western blot)验证两种细胞中NCAPG表达情况.应用CCK-8方法检测对照组及下调组的细胞增殖差异,明确NCAPG表达对细胞增殖的抑制作用.Annexin V/PI双染法流式细胞术检测两组细胞中早期凋亡及晚期凋亡细胞比例.Western blot法比较两组细胞中Caspase-3、Bax及Bcl-2的表达水平.结果 shRNA-NCAPG转染组细胞的NCAPG表达量低于对照组.下调NCAPG表达抑制A549及NCI-H1299细胞增殖,增加早期凋亡及晚期细胞凋亡比例,增加肺癌细胞促凋亡相关蛋白Caspase-3及Bax的表达、抑制Bcl-2蛋白表达.结论 下调NCAPG表达诱导非小细胞肺癌A549及H1299细胞增殖,通过线粒体通路抑制其细胞凋亡.     

肺腺癌表达TRPM8蛋白的意义

目的:探讨肺腺癌表达瞬时受体电位阳离子通道M亚家族成员8(TRPM8)蛋白的意义。方法:收集112例肺腺癌患者的肿瘤组织标本,对其进行4～5年临床随访。免疫组织化学染色检测肿瘤组织中TRPM8蛋白的表达,分析TRPM8蛋白表达与肺腺癌患者临床特征及预后的关系。培养A549肺腺癌细胞,通过感染慢病毒上调细胞中TRPM8蛋白的表达,CCK-8法及集落形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期及凋亡,划痕实验及Transwell实验观察细胞迁移和侵袭。培养H1299肺腺癌细胞,通过感染慢病毒上调细胞中TRPM8表达后,分别在免疫缺陷小鼠左右臀部皮下注射对应空载体细胞及上调TRPM8的细胞,分析TRPM8对移植瘤生长的影响。结果:肺腺癌组织存在TRPM8表达。TRPM8蛋白高表达的肺腺癌患者,其4～5年累积生存率高于TRPM8蛋白低表达的患者(P=0.017),且其肿瘤最大径小于低表达的患者(P=0.028)。上调A549细胞中TRPM8的表达后,细胞活力较空载体组和亲本细胞组显著减弱,形成的集落数显著减少,处于S期的细胞比例显著升高,迁移和侵袭能力显著下降(P0.01)。与空载体对照细胞株比较,上调H1299细胞中TRPM8的表达后,其在免疫缺陷小鼠皮下的移植瘤生长速率显著下降,肿瘤重量显著降低(P0.01)。结论:TPRM8在肺腺癌中具有抑癌作用,低表达TRPM8蛋白的肺腺癌患者预后不良。     

miR-520c-3p靶向MEX3A调控肺癌细胞增殖、凋亡的分子机制

为研究miR-520c-3p对肺癌细胞增殖和凋亡的影响及其潜在的作用机制,用实时定量RT-PCR检测肺癌细胞H1299、NCI-H460、A549和正常肺上皮细胞BEAS-2B中miR-520c-3p和MEX3同源物A(MEX3 homolog A,MEX3A)的表达水平。将miR-NC、miR-520c-3p、si-NC、si-MEX3A、anti-miR-NC、anti-miR-520c-3p转染至H1299细胞后,用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blotting检测蛋白表达,双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞的荧光活性。结果显示,与正常肺上皮细胞BEAS-2B比较,肺癌细胞H1299、NCI-H460、A549中miR-520c-3p的表达水平均显著降低(P0.05),MEX3A mRNA和蛋白的表达水平显著升高(P0.05)。miR-520c-3p过表达、MEX3A抑制表达均可抑制H1299细胞的增殖活力,促进细胞凋亡;miR-520c-3p过表达抑制CyclinD1、Bcl-2蛋白的表达,促进p21、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白的表达;MEX3A抑制表达抑制CyclinD1、Bcl-2蛋白的表达,促进p21、Bax蛋白的表达。miR-520c-3p可靶向调控MEX3A的表达;MEX3A过表达逆转了miR-520c-3p过表达对肺癌细胞H1299的增殖抑制和凋亡促进作用。提示miR-520c-3p可抑制肺癌细胞H1299的增殖,促进其凋亡,其机制可能与靶向MEX3A有关,这将为肺癌的预防和治疗提供新靶点。     

过表达ODC抑制氧化应激诱导大鼠心肌细胞凋亡的研究

目的构建过表达鸟氨酸脱羧酶（ODC）基因慢病毒载体,并研究其对氧化应激诱导大鼠H9C2心肌细胞凋亡的影响。方法构建大鼠ODC基因pHIV-ODC过表达质粒,与包装质粒psPAX2、pMD2G共转染293FT细胞,检测其侵染效率;包装慢病毒并侵染H9C2心肌细胞;72 h后观察其侵染效率,RT-PCR法检测细胞ODC mRNA的表达,利用CCK-8、Hochest33258染色检测ODC对H2O2诱导H9C2心肌细胞凋亡的影响。结果酶切及测序鉴定ODC序列正确插入慢病毒过表达载体。侵染H9C2细胞72 h后ODC mRNA水平较阴性慢病毒感染组显著升高。过表达ODC能抑制H2O2诱导的细胞活力下降,减轻H2O2诱导的心肌细胞凋亡,与H2O2组比较差异均有统计学意义（P〈0.001）。结论成功构建的过表达ODC慢病毒,上调H9C2细胞中ODC的表达,过表达ODC能显著抑制氧化应激诱导的H9C2心肌细胞凋亡。     

microRNA-25在脑缺血/再灌注损伤诱导的细胞凋亡过程中的作用

目的 在体外培养的SH-SY5Y细胞和IMR-32细胞中,观察microRNA-25（miR-25）对缺血/再灌注（I/R）损伤诱导的细胞凋亡的作用及其可能机制。方法 在体外培养的人SH-SY5Y细胞和IMR-32细胞中,用氧葡萄糖剥夺/再恢复（OGDR）模拟脑缺血/再灌注损伤。合成miR-25过表达片段,并构建慢病毒载体质粒,用脂质体将载体质粒转导入细胞中。MTT法检测细胞活力、TUNEL法检测凋亡、RT-PCR、Real-time PCR和Western blotting分别检测目的基因mRNA和蛋白的表达情况。 结果 与正常培养组相比,OGDR组中细胞内miR-25表达下调,细胞活力明显下降,凋亡明显增多,同时Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表达上调,Bcl-2 mRNA和蛋白表达下调（n=3,P<0.05）;而与OGDR组相比,过表达miR-25组内细胞活力明显升高,凋亡明显减少,同时Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表达下降Bcl-2 mRNA和蛋白表达升高（n=3,P<0.05）。结论 I/R损伤后miR-25表达上调可能通过Bax/Bcl-2-Caspase-3途径进而抑制I/R损伤诱导的凋亡,为I/R损伤的临床治疗提供潜在的治疗靶点。     

过表达水通道蛋白1(AQP1)促进A549人肺腺癌细胞的增殖并抑制β联蛋白(β-catenin)磷酸化

目的探讨水通道蛋白1(AQP1)基因的过表达对A549人肺腺癌细胞增殖的影响及可能机制。方法构建和包装AQP1慢病毒过表达载体,感染A549细胞,实时荧光定量PCR检测AQP1 mRNA水平, Western blot法检测AQP1蛋白水平。在A549细胞过表达AQP1后,噻唑蓝(MTT)实验检测细胞增殖,细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,并以Western blot法检测细胞β联蛋白(β-catenin)磷酸化水平。结果成功构建AQP1过表达慢病毒载体,病毒滴度为(2.87±0.54)×10~8 IU/mL;慢病毒载体感染A549细胞后,细胞AQP1 mRNA和蛋白水平显著增加;细胞增殖能力显著提高,细胞克隆形成数显著上升;β-catenin总蛋白水平增加,但β-catenin磷酸化显著降低。结论过表达AQP1促进A549细胞增殖并抑制β-catenin的磷酸化。     

甘草素调控WIG-1 基因对肺癌细胞增殖、细胞凋亡以及放疗敏感性影响的研究

目的:探讨甘草素(LQ)对肺癌细胞增殖、凋亡及放疗敏感性的影响及其作用机制。方法:体外培养肺癌细胞株H1299,采用MTT细胞实验检测不同浓度LQ对H1299细胞增殖活性的影响,流式细胞术检测H1299细胞凋亡率变化情况。Western blot检测各组H1299细胞中WIG-1蛋白表达情况,克隆形成实验检测不同剂量照射的H1299细胞存活分数。结果:不同浓度LQ处理后可抑制H1299细胞增殖并诱导细胞凋亡;LQ作用H1299细胞后经X线照射可降低H1299细胞存活分数并促进细胞凋亡;LQ可抑制H1299细胞中WIG-1蛋白表达;沉默WIG-1后经X线照射H1299细胞存活分数明显降低并可诱导细胞凋亡;WIG-1过表达可逆转LQ对H1299细胞凋亡及放疗敏感性的作用。结论:LQ通过调控WIG-1基因表达进而抑制肺癌细胞增殖、促进细胞凋亡及增强放疗敏感性。     

SARI基因促进急性髓性白血病细胞凋亡机制的探讨

目的：通过慢病毒载体过表达SARI（Suppressor of AP-1,regulated by IFN）基因,探讨SARI基因促进急性髓性白血病（Acute myeloid leukemia,AML）细胞凋亡的分子机制。方法：构建SARI基因过表达的慢病毒载体,感染AML细胞HL-60和NB4,应用实时荧光定量PCR和Western blot对感染后细胞进行过表达的鉴定。两株AML细胞均设空白对照组（CON组）、空载体对照组（NC组）及SARI组,应用Western blot检测SARI过表达后两株AML细胞组凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-xl、Bax和凋亡途径相关蛋白CytoC、Caspase8、Caspase9、Caspase3、Actived-Caspase3、PARP的表达变化。结果：SARI组细胞的SARI mRNA和蛋白表达水平均显著高于CON组和NC组（P＜0.05）,表明SARI过表达成功。SARI过表达的HL-60和NB4细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl表达均下调,促凋亡蛋白Bax表达上调。CytoC表达增加,Caspase8、Caspase9、Caspase3剪切激活,Actived-Caspase3上调,PARP下调,PARP剪切体上调。结论：SARI基因促进AML细胞凋亡可能是通过激活外源性凋亡途径及与外源性凋亡途径交叉的内源性凋亡途径。     

RNA干扰MEX3A基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨通过慢病毒介导的RNA干扰技术抑制MEX3A基因表达对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响。 方法 应用GV115载体构建针对MEX3A基因的shRNA慢病毒载体,转染包装细胞293T产生慢病毒颗粒,收集并滴度测定后转染5637膀胱癌细胞,实验组转染MEX3A-shRNA慢病毒,对照组转染阴性对照慢病毒;实时定量PCR（Real-time PCR）检测MEX3A基因敲减效率;慢病毒转染3 d后,使用Celigo连续细胞计数5d检测细胞生长;慢病毒转染5d后,进行膜联蛋白V（Annexin V）染色并用流式细胞术检测细胞凋亡。 结果 成功构建MEX3A-shRNA慢病毒载体以及稳定抑制MEX3A表达的细胞株,MEX3A基因敲减效率达到74%;Celigo细胞计数检测显示,与对照组相比,实验组5637细胞的增殖速率受到显著抑制;流式细胞术检测显示,实验组发生凋亡的5637细胞显著增加。 结论 MEX3A基因促进膀胱癌细胞的增殖,抑制膀胱癌细胞的凋亡。     

金黄色葡萄球菌肠毒素C3 过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建金黄色葡萄球菌肠毒素C3(SEC3)过表达慢病毒载体并体外检测其表达目的基因。方法:聚合酶链反应(PCR)扩增SEC3 基因片段;用AgeI 酶切线性化GV365 慢病毒载体,通过连接反应构建GV365-SEC3 载体,运用PCR方法鉴定阳性克隆载体;转染293T 细胞包装慢病毒,观察细胞荧光及Western blot 检测慢病毒载体表达,HIV-1 p24 ELISA 法测定慢病毒载体滴度。结果:获得目的基因,并成功构建GV365-SEC3 慢病毒载体,通过PCR 及DNA 测序鉴定,证明GV365-SEC3 质粒构建正确;转染293T 细胞后可观察到大量荧光细胞,经蛋白电泳得到29 kD 大小的蛋白条带,与目的基因蛋白相符合,ELISA 检测病毒载体滴度为5 108 TU/ ml。结论:成功构建GV365鄄SEC3 过表达慢病毒载体,为后期研究其体内外对抗肿瘤的作用与机制奠定基础。     

小泛素样修饰蛋白1假基因3通过蛋白激酶B信号通路影响非小细胞肺癌细胞系H1299增殖和凋亡

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)小泛素样修饰蛋白1假基因3(SUMO1P3)对非小细胞肺癌细胞增殖和凋亡的影响.方法 用Real-time PCR方法测定非小细胞肺癌细胞系H1299中SUMO1P3表达变化.在H1299细胞中转染SUMO1P3小干扰RNA(siRNA),Real-time PCR方法测定下调...     

RNA干扰介导的端锚聚合酶1表达下调诱导人神经母细胞瘤细胞的凋亡

目的探讨RNA干扰(RNAi)介导的端锚聚合酶1(TNKS1)的表达下调对人神经母细胞瘤(NB)细胞SH-SY5Y体外增殖能力和凋亡的影响及机制,为开发治疗NB的新靶点提供一定的实验基础。方法根据TNKS1基因序列,设计合成3个TNKS1基因的特异性短发夹环(shRNA)干扰片段,利用慢病毒作为载体,构建目的基因的RNAi序列。慢病毒感染SH-SY5Y细胞,实时定量PCR(Real-time PCR)法检测TNKS1基因的表达,筛选出最佳干扰序列进行后续实验。然后进行克隆形成实验,检测RNAi-TNKS1后细胞增殖能力的改变。并进一步用Western blotting法检测抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Caspase-3、Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路的关键蛋白β-catenin及其下游靶蛋白Cyclin D1和c-Myc的表达,最后用透射电镜观察凋亡形态的改变,探讨RNAi-TNKS1对细胞凋亡的影响及其作用机制。结果慢病毒载体构建成功,病毒滴度为5×1011TU/L。Real-time PCR检测结果显示,#3 shRNA为最佳的有效靶点。克隆形成实验的结果显示,RNAi-TNKS1后SH-SY5Y细胞的克隆形成率较对照组明显下降。Western blotting结果显示,RNAi-TNKS1可显著抑制Bcl-2蛋白的表达,促进Caspase-3蛋白的表达。此外,Wnt/β-catenin通路的关键蛋白β-catenin及其下游靶蛋白Cyclin D1和c-Myc的表达也降低。透射电镜结果显示,RNAi-TNKS1后细胞呈现明显的凋亡结构和形态。结论 RNAi介导的TNKS1的表达下调可降低SH-SY5Y细胞的体外增殖能力,诱导其凋亡,可能部分是通过抑制Wnt/β-catenin通路发挥作用。     

MADD在肺腺癌组织中的表达及对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨MADD在肺正常组织及肺腺癌组织中的表达及其对肺腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:收集肺临床病理组织标本,免疫组化法检测肺正常组织和肺癌组织MADD表达;培养人肺腺癌A549细胞,逆转录PCR检测其IG20基因表达;用携带MADD基因的质粒和能够沉默MADD表达的慢病毒载体分别转染A549细胞,Western blot、MTT分析和流式细胞术检测其MADD表达、增殖及凋亡。结果:肺腺癌组织MADD表达水平明显高于肺正常组织和肺鳞癌组织;A549细胞能够表达MADD;高表达MADD能抑制A549细胞凋亡,提高其增殖活力,而沉默MADD表达则能促进A549细胞凋亡,降低其增殖活力。结论:肺腺癌组织MADD表达明显增高;MADD可通过抑制凋亡来促进肺腺癌细胞生存。     

Effects of lentiviral-mediated Foxp1 and Foxq1 RNAi on the hepatocarcinoma cell

Foxp1 and Foxq1 are two multifunctional molecules of “forkhead box (Fox)” family. The objective of this paper was to construct the lentiviral vectors expressing RNA interference (RNAi) against Foxp1 or Foxq1 genes, and the effects of both vectors with two RNAis on the proliferation, migration and apoptosis of 7721 hepatocarcinoma cell line were evaluated. Six target sequences against human Foxp1/Foxq1 mRNA were designed respectively and six pairs of their corresponding double-strand DNA oligo (siRNA) were synthesized prior to being transfected into 7721 cells with lipo2000, then a most efficient siRNA were selected to be subcloned into pLL3.7-GFP/Lenti plasmids. These plasmids were transfected into 293T cells to package lentiviral particles for subsequent transfection into 7721 cells after their sequences were confirmed. The expression of Foxp1and Foxq1 genes in the transfected cells were identified by real-time PCR. The migration, infiltration, viability and apoptosis of the transfected cells were assessed by wound healing assay, Transwell assay, CCK-8 assay and flow cytometry. Sequencing results showed that lentiviral vectors contained Foxp1 or Foxq1 gene. After being transfected into 7721 cells, Foxp1 and Foxq1 expression were significantly down-regulated by siRNA-823 and siRNA-834. The migration and infiltration ability, and the viability of 7721 cells transfected with two siRNAs were significantly suppressed; flow cytometry assay exhibited the apoptosis rate of transfected 7721 cells with the lentivirus RNAi vector of Foxp1 or Foxq1 was increased. All the results showed that the lentivirus RNAi vectors of Foxp1 and Foxq1 were able to inhibit the expression of Foxp1 and Foxq1 in 7721 cells efficiently, and the down-regulation of either Foxp1 or Foxq1 resulted in suppression of migration, infiltration and viability of 7721 cells and an increase in cell apoptosis. Our data indicated that both Foxp1 and Foxq1 genes played an oncogenic role in hepatocarcinoma cells, which proposed the two genes as new therapeutic targets for the cancer.     

MicroRNA-26a的表达对急性髓系白血病细胞增殖的影响

目的观察构建has-miR-26a重组慢病毒的表达载体对急性髓系白血病细胞增殖能力的影响。方法构建人MicroRNA-26a慢病毒表达载体(LV-miR-26a-GFP)并感染人急性髓系白血病细胞系NB4;分为未感染组、感染组(感染LV-miR-26a-GFP)以及阴性对照组(感染LV-GFP);用real-time RT-PCR检测miR-26a在NB4细胞内的表达水平,Western blot检测PTEN的表达;用CCK-8法绘制细胞的生长曲线和软琼脂克隆形成实验检测细胞的增殖。结果成功构建miR-26a重组慢病毒的表达载体,感染白血病细胞NB4后,能够成功过表达miR-26a。生长曲线的结果显示与感染LV-GFP阴性对照组和未感染组相比,LV-miR-26a-GFP感染组细胞的增殖速度显著增加(P<0.01),软琼脂克隆形成实验证实了感染LV-miR-26a-GFP的NB4细胞的克隆形成能力(GFP+克隆数为75+10)与阴性对照组(感染LV-GFP)相比(GFP+克隆数为26+5)显著增强(P<0.05)。在NB4细胞中过表达miR-26a后,其靶基因PTEN的表达明显被抑制。结论 MicroRNA-26a的表达可增强急性髓系白血病细胞的增殖能力,促进白血病细胞的增殖。     

慢病毒介导的caspase-3沉默对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和凋亡的影响

 目的：探讨沉默caspase-3对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）增殖、细胞周期和凋亡的影响。方法：构建靶向caspase-3的shRNA重组慢病毒并转染MSCs,通过real-time PCR和Western blotting 在mRNA及蛋白水平鉴定转染结果。采用MTS法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期。Real-time PCR检测bcl-2和bax mRNA的表达。Hoechst荧光染色法检测细胞的凋亡情况。结果：Real-time PCR和Western blotting结果均表明成功建立稳定转染shRNA-caspase-3的大鼠MSCs细胞株。沉默caspase-3使MSCs的增殖率明显提高（P＜0.05）,且S期细胞百分比明显增多,为（52.66±0.30）%。沉默caspase-3后bcl-2 mRNA表达上调,bax mRNA表达下调,bcl-2/bax比值升高（P＜0.05）。转染组的细胞凋亡率为（15.01±1.73）%,低于空载体组的（25.67±3.05）%和空白对照组的（23.67±1.16）%（P＜0.05）。结论: 沉默caspase-3能调控MSCs的细胞周期,促进细胞增殖,减少细胞凋亡。     

FRMD8抑制肺癌细胞的增殖与迁移

目的 探讨FERM domain-containing protein 8（FRMD8）在肺癌发生发展中的作用。 方法 用Western blotting检测肺癌组织及相应癌旁正常组织中FRMD8的表达情况;敲低FRMD8后平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,MTT法检测细胞增殖情况;过表达FRMD8后流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blotting检测过表达FRMD8后某些细凋亡相关蛋白表达变化;过表达及敲低FRMD8后Transwell细胞迁移实验检测对A549细胞迁移能力的影响。 结果 1. 与正常组织相比,肺癌组织中FRMD8表达下调（P＜0.05）; 2. FRMD8敲低,细胞克隆形成能力及增殖速度提高; 3. FRMD8可诱导细胞凋亡,并影响细胞凋亡相关基因的表达或活化： FRMD8过表达可下调Caspase-3、8和bax表达,而p53、激活型Caspase-3、8以及bcl-2 的表达上调; 4. FRMD8过表达抑制细胞迁移能力（P＜0.01）,而敲低FRMD8则促进细胞迁移（P＜0.001）。 结论 FRMD8可抑制肺癌的发生发展,并具有肿瘤抑制子的功能。