弓形虫分泌蛋白ROP2的原核重组表达与免疫反应性鉴定

本研究在大肠杆菌工程菌中重组表达弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）,并初步评价其免疫反应性。主要步骤为体外细胞培养速殖子,提取总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增ROP2基因全长,与pET-41 Ek／LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌Rosetta^TM（DE3）pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白GST-6×His—ROP2,最后以重组蛋白与人源弓形虫抗血清的Western blotting反应评价rROP2免疫反应性。本研究获得了ROP2全长重组蛋白,初步证明其良好的免疫反应性,为进一步改进弓形虫免疫学诊断方法,研究分泌蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础。     

霍乱毒素佐剂联合弓形虫ESA鼻内免疫小鼠抗弓形虫感染作用

目的 观察霍乱毒素（cholera toxin,CT）佐剂和弓形虫排泄-分泌抗原（ESA）鼻内免疫小鼠诱导的抗弓形虫感染作用。方法 6周龄BALB/c小鼠60只,随机分为3组,每组20只。分别用PBS 20μl、ESA 20μg或CT 1.0μg＋ESA 20μg每只滴鼻免疫2次,间隔2周。末次免疫后14 d,用4×104个弓形虫速殖子每只灌胃攻击所有小鼠,观察小鼠健康及死亡情况。速殖子攻击后30 d,计数肝、脑组织内弓形虫速殖子。结果 CT作为佐剂联合弓形虫ESA滴鼻免疫小鼠的健康状况明显好于PBS组和ESA组,存活率（95%）也显著高于PBS组（55%）。与PBS组相比,CT＋ESA组肝和脑组织内速殖子数分别减少了80.19%（P〈0.001）和78.24%（P〈0.005）。CT作为佐剂联合ESA滴鼻免疫小鼠诱导了高水平的黏膜免疫应答和系统免疫应答。结论 CT作为佐剂联合弓形虫ESA滴鼻免疫小鼠诱导的免疫应答可有效抵抗弓形虫速殖子攻击。     

STAg和霍乱毒素不同程序滴鼻免疫小鼠诱导抗弓形虫作用

目的观察弓形虫可溶性速殖子抗原（soluble tachyzoite antigen，STAg）和霍乱毒素（cholera toxin，CT）佐剂不同程序滴鼻免疫小鼠诱导的抗弓形虫感染能力，确定STAg和CT滴鼻免疫的最佳程序。方法BALB／c小鼠随机分为3组：1次、2次和3次免疫组，用20μgSTAg＋1μgCT／只分别滴鼻免疫1次，2次或3次，前2次间隔2周，末次间隔1周。末次免疫后第14天，用4×10^4个速殖子／只灌胃攻击所有小鼠，观察小鼠健康及死亡情况，攻击后第30天处死，ELISA法检测血清IgG和粪便IgA，计数肝、脑组织内弓形虫速殖子，分离并计数派伊尔结（Peyer＇s patches，PP）和脾淋巴细胞数。结果2次和3次免疫组小鼠存活率明显高于1次免疫组（P〈0．05），肝、脑组织内虫荷显著低于1次免疫组（P〈0．001），血清IgG和粪便IgA高于1次免疫组，PP和脾淋巴细胞数无显著性变化。结论STAg和CT佐剂滴鼻免疫2次或3次能有效诱导小鼠抗弓形虫感染。     

不同佐剂的复合黏膜疫苗鼻内免疫小鼠抗弓形虫感染的保护作用

目的比较IFN-γ和蜂胶作为佐剂鼻内免疫小鼠抗弓形虫攻击的能力,探索两种佐剂联合应用的效果。方法将5-6周龄雌性BALB／c小鼠60只随机分为4个组,每组15只,分别用20雌可溶性速殖子抗原（STAg）、20μg STAg＋40μg蜂胶、20μgSTAg＋1000U IFN-γ或20μgSTAg＋40μg蜂胶＋1000UIFN-γ鼻内免疫小鼠2次．间隔14d。末次免疫后第10天,用RH株弓形虫速殖子4×10^4个／只灌胃攻击,逐日观察小鼠存活情况。攻击后第43天处死全部存活小鼠,计算胸腺、脾指数,计数脑、肝组织速殖子。结果STAg＋IFN-γ组、STAg＋蜂胶＋IFN-γ组胸腺、脾指数显著高于STAg组（P〈0．05）;组织内速殖子虫荷显著降低（P〈0．01）,STAg＋IFN-γ组小鼠脑、肝组织减虫率分别为57．00％和79．06％;STAg＋蜂胶＋IFN-γ组小鼠脑、肝减虫率分别为68．30％和79．06％。STAg＋蜂胶组小鼠胸腺、脾指数有升高趋势,组织内速殖子虫荷降低,但与STAg组比较差异无统计学意义。结论在抗弓形虫感染中,IFN-γ、蜂胶＋IFN-γ的佐剂效果优于蜂胶,IFN-γ、蜂胶＋IFN-γ辅助STAg显著提高小鼠胸腺、脾比重,增强机体免疫能力,有效抵抗弓形虫的感染攻击,脑、肝组织速殖子虫荷显著减少。     

弓形虫SAG2和GRA2基因疫苗的免疫保护研究

DNA疫苗是将编码抗原的基因插入载体质粒中构成重组体,直接接种机体,在接种部位摄取表达并达到抗感染目的的一种疫苗。pCMV—Taq2B载体具有人巨细胞病毒（Humancytomcgalovirus,CMV）高效启动子／增强子序列,可使目的基因在真核细胞中高水平稳定表达成为DNA疫苗载体。构建pCMV-Taq2B—Surfaceantigen2（表面膜抗原2）（pSAG2）、pCMV—Taq2B—Densegranuleprotein2（致密颗粒蛋白2）（pGRA2）及pCMV．Taq2B—SAG2．GRA2（pSAG2-GRA2）DNA疫苗并研究其免疫保护效果。将pSAG2、pGRA2、pSAG2-GRA2DNA疫苗（实验组）、磷酸盐缓冲液（Phosphatebufferedsaline,PBS）、pCMV—Taq2B空质粒（对照组）分别肌肉注射BALB／c小鼠,ELISA法检测血清IgG抗体水平。末次免疫后第28d,各组每只小鼠经腹腔注射弓形虫速殖子1000个,观察小鼠的生存时间。结果显示单基因疫苗pSAG2、pGRA2和双基因疫苗pSAG2一GRA2免疫组均能诱导产生特异性IgG抗体,且于末次免疫后第28d达到最高值,此时单基因疫苗pGRA2（0．382±0．66）和双基因疫苗pSAG2-GRA2（0．548±0．137）免疫组吸光度值显著高于PBS（0．137±0．016）或pCMV—Taq2B（0．135±0．010）对照组吸光度值。免疫单基因疫苗pSAG2（14．3±1．8）、pGRA2组（13．5±2．1）小鼠存活时间（d）明显长于PBS（4．3±1．6）及pCMV—Taq2B组（4．1±1．3）,且双基因疫苗pSAG2．GRA2组（19．6±2．4）小鼠存活时间明显长于单基因疫苗pSAG2组及pGRA2组。弓形虫双基因疫苗pSAG2-GRA2能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫,其免疫保护性优于pSAG2、pGRA2单基因疫苗。     

Chitosan-DNA基因免疫诱导粘膜特异性免疫应答及其抗CVB3感染作用

目的：构建新型粘膜基因疫苗，诱生CVB3VP1特异性粘膜免疫应答，探讨粘膜免疫抗CVB3感染的作用，为病毒性心肌炎的特异性防治奠定基础。方法：抽提CVB3 RNA，以RT-PCR扩增得VP1基因，插入真核表达载体pcDNA3中，构建质粒pcDNA3-VP1，以Chitosan多糖包裹形成Chitosan-DNA基因疫苗。将该质粒转染Hela细胞，观察其体外表达情况。以50辉DNA剂量的Chitosan-DNA疫苗滴鼻免疫BALB／C小鼠3次，检测CVB3特异性体液和细胞免疫应答；隔4周以5LD50活CVB3致死攻击小鼠，观察攻击后存活情况。结果：制备了直径为80-100nm的Chitosan-DNA复合物颗粒，体外转染证实Chitosan-DNA复合物中VPl的表达高于pcDNA3-VP1质粒-Lipofectamine的表达水平。该疫苗滴鼻3次免疫后，不仅诱生了高水平的IgG，而且诱生了高水平的粘膜IgA抗体，第6周抗体P/N值分别达3．5和3．2。特异性细胞免疫应答研究发现，该疫苗诱生了较强的VP1特异性CTL杀伤作用，并显著高于pcDNA3-VP1和pcDNA3组。CVB3攻击后，可保护33．3％小鼠长期存活，而pcDNA3和pcDNA3-VP1质粒滴鼻免疫对照组的平均存活天数分别为8．5和10．8天。病理学研究显示：Chitosan-DNA免疫小鼠心肌组织基本正常，而对照小鼠死亡前心肌显示大量的灶性坏死和炎性浸润。结论：Chitosan-DNA基因疫苗滴鼻免疫可诱生CVB3特异性粘膜IgA应答及CTL反应，具有一定的抗CVB感染的免疫保护力。     

孕期弓形虫感染对小鼠胎盘补体调节蛋白表达水平的影响

目的 通过检测弓形虫感染对C57BL/6孕鼠胎盘补体调节蛋白的表达水平,探索孕期弓形虫感染致不良妊娠结局的分子免疫机制.方法 将C57BL/6孕鼠随机分为感染组和正常对照组,每组12只,感染组每只孕鼠于孕8 d腹腔注射200个弓形虫强毒株(RH株)速殖子,对照组于相应时间注射等量生理盐水.所有孕鼠均于孕14 d无菌分离胚胎组织,观察胎鼠发育情况.采用实时荧光定量PCR检测胎盘补体调节蛋白Crry、GPI-DAF及CD59a的mRNA的表达水平;采用流式细胞术检测胎盘单细胞悬液中Crry、GPI-DAF阳性细胞率.结果 弓形虫感染导致感染组死胎率显著升高(感染组死胎率为80.95%,对照组为4.41%),两组之间差异有统计学意义(P＜0.01);弓形虫感染组及对照组Crry、GPI-DAF和CD59a的mRNA表达水平分别为0.786±0.199、0.594±0.096、0.880±0.179和0.550±0.077、0.221±0.074、0.591±0.075,3类补体调节蛋白感染组与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.01);感染组和对照组Crry、GPI-DAF的阳性细胞百分率分别为(10.03±2.11)%、(2.95±1.04)%和(3.15±1.32)%、(0.66±0.26)%,两类补体调节蛋白感染组与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 弓形虫感染导致孕鼠胎盘3种补体凋节蛋白Crry、GPI-DAF及CD59a表达水平均升高,打破了母胎界面维持正常妊娠所需的免疫微环境,这可能是孕期弓形虫感染致不良妊娠结局的分子免疫机制之一.

Abstract：

Objective To investigate the expression of complement regulatory proteins on placentas of pregnant C57BL/6 mice infected with Toxoplasma gondii in order to explore the molecular immunological mechanism for abnormal pregnancy induced by T. gondii infection. Methods Twenty-four pregnant C57BL/6 mice were randomly divided into two groups equally. The infection group was intraperitoneally injected with 200 of living T, gondii RH strain tachyzoites on the 8th day of gestation, and the normal group of mice was injected with physiological saline. All mice were killed on day 14 after gestation and placentas were collected. The expression levels of Crry, GPI-DAF and CD59a mRNA were analyzed by real-time quantitative PCR, and the positive rates of Crry and GPI-DAF were measured with flow cytometry. Results The died fetus rates of infected group and control were 80. 95% and 4. 41% , respectively. The infected group was significantly higher than of that the control group (P＜0.01). The expression levels of Crry, GPT-DAF and CD59a mRNA in the infected and control group were 0.786 ±0. 199, 0.594 ±0.096, 0.880 ±0. 179 and 0.550 ±0.077, 0.221 ±0.074, 0.591 ± 0.075 , respectively, and the difference of three kind of complement regulation proteins between two groups was all significant (P＜0.01). The positive percentages of Crry and GPI-DAF cells of infected and control group were (10. 03 ± 2. 11) % , (2.95 ±1.04)% and (3. 15 ± 1. 32) % , (0. 66 ±0. 26) % , respectively, and the difference of the two kind complement regulation proteins between two groups was also significant ( P ＜ 0. 01). Conclusion The expression level of mouse placental complement regulatory proteins was increased after infection with T. gondii, and then immunological microenvironment at the fetomaternal interface was destroyed. It may be one of important immunological mechanism for abnormal pregnancy induced by T. gondii infection.     

重组IL-12对乙肝疫苗在小鼠诱导免疫应答的作用

目的:观察重组IL-12对乙肝疫苗在小鼠诱导应答的强度与性质的作用,探讨将重组IL-12用作乙肝治疗性疫苗分子佐剂的可能性.方法:将乙肝疫苗联合重组IL-12肌注免疫小鼠,检测小鼠产生的抗乙肝表面抗原特异性体液和细胞免疫应答.结果:乙肝疫苗联合重组IL-12能明显增强小鼠T淋巴细胞的增殖活性、促进分泌细胞因子IFN-γ和IL-2并提高IgG2a抗体水平.结论:重组IL-12可显著增强乙肝疫苗诱导的细胞免疫应答,并使免疫应答转向Th1型.     

中国株HIV-1外膜蛋白基因疫苗诱导免疫小鼠免疫应答的实验研究

目的 :构建中国流行株HIV 1外膜蛋白 (gp12 0 )基因疫苗并接种小鼠 ,评价其诱导的体液和细胞免疫应答。方法 :将HIV 1gp12 0基因插入到真核表达载体pVAX1中 ,构建重组真核表达质粒pVAX1 GP12 0 ,并经EcoRI和PstI双酶切以及测序鉴定。同时以pVAX1 GP12 0和空载体pVAX1分别免疫BALB/c小鼠 ,采用ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体和IFN γ水平 ,用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖 ,用乳酸脱氢酶 (LDH)试验检测小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)的应答。结果 :酶切及测序结果表明 ,成功地构建了HIV 1gp12 0基因疫苗。与空载体pVAX1组相比较 ,pVAX1 GP12 0免疫组小鼠血清抗HIV 1gp12 0抗体的滴度和IFN γ的水平均升高 ,两者差异显著 (P <0 .0 1)。pVAX1 GP12 0免疫组小鼠脾淋巴细胞增殖的刺激指数 (SI)及特异性CTL的杀伤活性 ,均高于空载体pVAX1组 (P <0 .0 1)。结论 :构建了针对我国HIV 1流行株的gp12 0基因疫苗。以其免疫BALB/c小鼠可诱导特异性体液和细胞免疫应答 ,为进一步将其用于我国的HIV的治疗奠定了基础。     

弓形虫ROP2基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 :构建弓形虫棒状体蛋白 (ROP2 )基因重组质粒并在大肠杆菌中表达 ,用于筛选弓形虫新的诊断抗原和疫苗分子。方法 :根据ROP2基因已知序列 ,设计合成一对引物 ,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出ROP2基因片段 ,再克隆到pGEX 4T 1质粒 ,重组质粒经酶切及PCR鉴定 ,而后进行测序 ;重组质粒在大肠杆菌BL2 1 (DE3)中进行ITPG诱导表达 ,表达产物经SDS PAGE及WesternBlot分析。结果 :ROP2基因PCR产物大小与预期相符 ,约 1 0 4 3bp ,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子 ,测序结果与已知序列基本吻合 ;SDS PAGE及免疫印迹显示ROP2融合蛋白表观分子量约为 5 5kDa ,表达产物约占菌体总蛋白1 7% ,具有一定的免疫反应性。结论 :克隆并表达了弓形虫ROP2基因 ,为下一步弓形虫诊断及疫苗研究奠定了基础     

旋毛虫Ts87重组蛋白诱发小鼠保护性免疫的研究

为了进一步探讨旋毛虫Ts87基因原核表达重组蛋白的保护性免疫作用 ,本试验用此纯化重组蛋白组分加福氏完全佐剂 (FCA)皮下注射免疫NIH小鼠 3次 ,继以旋毛虫感染性幼虫 2 5 0条攻击 ,攻击后每周取血清测抗体IgG滴度 ,第 35天计数小鼠肌肉幼虫数。结果显示重组蛋白免疫鼠的肌肉幼虫减虫率为4 2 3% ,血清抗Ts87重组蛋白体IgG的几何平均倒数滴度 (GMRT)达到 80 0 0以上 ,均显著高于佐剂组和对照组。Ts87基因表达的重组蛋白可产生明显的保护性免疫作用     

间接原位PCR检测实验性弓形虫感染病理标本

探讨间接法原位 PCR在弓形虫感染病原学检测中的应用。以 RH株弓形虫速殖子感染小鼠后第 2、4、6天处死 ,取肝脏制备石蜡标本及冰冻切片标本 ,以间接法原位 PCR扩增并检测石蜡标本中的弓形虫 DN A,与原位杂交方法检测冰冻切片标本的结果比较。以间接原位 PCR方法检测 18例标本均得到阳性信号 ,病原体检出率为 10 0 % ,优于原位杂交法 ( 9/18)。间接法原位 PCR为弓形虫病的病理检测提供了一种可行的新方法     

随机引物聚合酶链反应技术鉴别弓形虫株的研究

本文运用随机引物聚合酶链反应技术鉴别弓形虫株，获得较满意结果。实验根据Ｍ１３噬菌体已知部分核酸序列，自行设计并合成了３条引物，在一定条件下扩增ＲＨ，ＺＳ１、ＺＳ２、ＳＨ－１等４株弓形虫基因组ＤＮＡ，扩增产物经２％琼脂糖凝胶电泳分带。扩增带型显示４株受检的弓形虫株具有株间差异。     

弓形虫排泄-分泌抗原鼻内免疫小鼠诱导体液免疫应答的动态观察

观察从Vero细胞与弓形虫速殖子共培养液分离的排泄-分泌抗原(Excreted-secreted antigens,ESA)鼻内免疫小鼠诱导的体液免疫应答及动态变化,为弓形虫复合黏膜疫苗候选抗原提供实验依据。BALB/c小鼠84只随机分为实验组和对照组,实验组以ESA为抗原(20μg/只),对照组用未接种弓形虫的细胞培养上清液20μL(μg/只),滴鼻免疫2次(间隔2周)。分别于2次免疫后第1、2、3、4、5、6、7周颈椎脱位处死小鼠。ELISA法测定血清IgG、IgA,粪便sIgA及肠液sIgA。结果表明,免疫组小鼠血清IgG、IgA和粪便sIgA及肠液sIgA均增高。血清IgG、IgA水平分别第5周、第4周达高峰,免疫后第1~7周(P<0.05)显著高于对照组。粪便sIgA第4周即达高峰,之后逐渐降低,至第7周仍(P<0.05)显著高于对照组。肠液sIgA第4周达高峰,第2、3、4周(P<0.05)高于对照组。可见,弓形虫ESA鼻内免疫BALB/c小鼠可有效诱导体液免疫应答,特异性抗体生成明显且可持续较长时间。     

旋毛虫Ts87重组蛋白诱导的小鼠黏膜免疫保护性研究

本实验探讨旋毛虫Ts87重组蛋白灌胃免疫小鼠诱导的黏膜免疫保护性作用。实验分对照组、佐剂组(霍乱毒素B亚单位组,CTB)和免疫组(CTB Ts87重组蛋白),灌胃免疫,间隔1周共免疫3次。末次免疫后第7天用400条旋毛虫感染期幼虫攻击,比较3组小鼠肠道成虫数、雌虫生殖力和肌幼虫数。且于末次免疫后第7天刮取肠黏液、取血检测特异性sIgA、IgG抗体水平。结果显示免疫组小鼠成虫减虫率、新生蚴减虫率、肌幼虫减虫率分别是81·34%、67·02%、84·49%;小鼠肠黏液sIgA水平及血清IgG水平显著高于对照组和佐剂组。结果表明Ts87重组蛋白黏膜免疫能够诱导小鼠产生抗旋毛虫的保护性免疫。灌胃免疫能显著提高肠黏液特异性sIgA水平,对促进肠道成虫的排出有明显作用。     

STAg联合ESA鼻内免疫小鼠对弓形虫垂直传播的阻断作用

观察弓形虫可溶性速殖子抗原（Soluble tachyzoite antigen,STAg）与排泄-分泌抗原（Excreted/secreted antigens,ESA）单独或联合鼻内免疫小鼠对弓形虫垂直传播的阻断作用。分别用PBS 20μL和STAg 20μg、ESA 20μg及联合抗原（STAg 10μg＋ESA 10μg）鼻内免疫BALB/c处女鼠2次,间隔2周。末次免疫后第13天处女鼠与雄鼠以2∶1同居。妊娠第8天用弓形虫速殖子（8000个/只）灌胃攻击所有孕鼠。妊娠第18天处死,计算活胎率,并测定孕鼠肝、胎盘和胎鼠脑组织弓形虫抗原和孕鼠脾组织内虫荷,同时测定孕鼠小肠冲洗液SIgA、血清IgG水平。结果表明,ESA组和联合抗原组活胎率显著高于PBS组,STAg组、ESA组和联合抗原组胎盘及胚胎感染率均低于PBS组,联合抗原组最低。孕鼠在弓形虫速殖子攻击后,PBS组明显出现竖毛、倦怠、腹部塌陷等异常表现,感染率为100%,死亡率为22.22%,而STAg组、ESA组和联合抗原组有轻微症状,感染率分别为85.71%、57.14%、57.14%,死亡率分别为16.67%、0%、0%。STAg组、ESA组和联合抗原组脾组织内虫荷均显著低于PBS组,减虫率分别为72.19%、72.29%、78.45%,ESA组和联合抗原组小肠冲洗液特异性SIgA均显著高于PBS组,联合抗原组最高,血清特异性IgG抗体水平差异不显著。由此可见,ESA单独或与STAg联合免疫可诱导孕鼠小肠液高水平SIgA,显著降低脾组织虫荷,显著提高胚胎存活率,表现出明显的垂直传播阻断的作用。     

弓形虫慢性感染小鼠的系统性细胞免疫应答规律

弓形虫感染可激发宿主产生Th1型免疫反应,因此研究弓形虫疫苗尤其需要关注系统性T细胞免疫应答与保护力的关系。本研究被弓形虫Pru株包囊口服感染BALB／c小鼠,成功建立了弓形虫慢性感染小鼠模型。慢性感染小鼠的脾细胞用弓形虫可溶性抗原刺激后可以产生特异性增殖。进一步分析发现弓形虫特异性CD3＋T、CD4＋T和CD8＋T细胞都可以产生IFN-γ。本研究建立的弓形虫慢性感染小鼠模型可以产生较强的系统性T细胞免疫应答,为弓形虫疫苗研制的效果评价提供重要参考。