人巨细胞病毒先天性感染胎鼠大脑皮质钙调素基因mRNA表达的研究

目的 研究先天性人巨细胞病毒（HCMV）感染致脑损害后钙调素（calmodulin,CaM)基因mRNA表达的改变,以探讨先天性HCMV感染所致脑损害的机制。方法 选用10周龄Balb/c小鼠,雌雄小鼠腹腔内分别注射1.0ml、0.5ml、0.25ml HCMV后合笼交配以建立先天性HCMV中枢神经系统（CNS）感染小鼠模型,并以腹腔注射1.0ml 1640液鼠为对照。剖腹取21天胎龄小鼠大脑皮质,以自行设计的CaM cDNA编码区的一对引物与一条CaM特异性探针,分别用逆转录聚合酶链反应（RP－PCR）技术CaM mRNA相对含量,用原位杂交检测大脑皮质细胞内相应mRNA的表达及定位。结果 母鼠腹腔内接种HCMV量为1.0ml与0.5ml的临产胎鼠大脑皮质分离出相应病毒,病理学检查等确诊发现了侵袭性脑膜脑炎性病理改变,证实HCMV可以小鼠宫内传播至CNS。1.0ml组与0.5ml组胎鼠RT－PCR产物浓度明显高于0.25ml组及对照组,而1.0ml组与0.5ml组间亦有明显差异。电泳结果显示对照组与0.25ml组胎鼠未见阳性条带,而1.0ml组胎鼠特异性条带信号强于0.5ml胎鼠,仅略低于同组母鼠。原位杂交显示CaM mRNA不但出现在1.0ml组胎鼠大脑皮质大神经元胞核及胞浆内,在中小神经元及胶质细胞的胞核及胞浆亦有高密度表达,阳性细胞的突起中亦有弱信号存在。结论 本研究结果揭示先天性感染HCMV胎鼠大脑皮质内CaM mRNA表达量明显增加,且神经元及胶质细胞均有表达,并与感染剂量有依赖关系。提示CaM mRNA表达增高可直能直接参与了HCMV先天性感染脑损害的过程。     

人巨细胞病毒先天性中枢神经系统感染小鼠模型的建立

将人巨细胞病毒 (HCMV)接种至 8～ 12周龄 BAL -B/ c雌雄小鼠腹腔后合笼交配。待雌鼠临床产时剖宫取出胎鼠脑双侧大脑皮层 ,进行病毒分离、病理学检测及用地高辛标记的 HCMV寡核苷酸探针对大脑皮层细胞压印片进行原位分子杂交检测。病理学研究结果证实 ,鼠脑为侵袭性脑膜炎性病理改变 ,并在神经细胞内发现病毒特征性的大的核内嗜碱性包涵体 ;原位杂交结果显示 ,病毒核酸存在于受染神经细胞及神经胶质细胞核内及胞浆内 ;在鼠脑组织上清液中分离出HCMV。且感染组雌鼠血清特异性 Ig M抗体阳性率为73.9% ,Ig G抗体阳性率为 95 .7% ;而对…     

人巨细胞病毒先天性感染对ICR鼠胚胎生长及脑组织发育的影响

目的　探索人巨细胞病毒 (HCMV )先天性感染对胎鼠胚胎生长及脑组织发育的影响。方法　 10周龄的ICR♀♂鼠按 1∶1配对 ,实验组于交配前及妊娠 3天 (E3 )、7天(E7)、15天 (E15)腹腔内接种HCMV悬液 ,对照组接种HF细胞上清液。于E0 、E3 、E6、E9、E12 、E15、E19称取孕鼠体重。临产时剖腹取胚胎的大脑皮质 ,用常规组织切片及HE染色 ,检测组织的病理变化 ,同时取部分组织进行病毒分离。结果　各实验组 (除E15组 )孕鼠自E15后体重较对照组明显降低。组织病理学检查发现 ,各实验组ICR胎鼠大脑皮质血管扩张、充血、出血 ,脑实质有单核细胞浸润 ,部分神经细胞变性坏死或凋亡及噬神经细胞现象 ,软化灶形成 ;受染的神经细胞核内出现HCMV特征性包涵体。E0 、E3 、E7、E15实验组大脑皮质病毒分离阳性率分别为 6 0 %、6 2 %、6 7%、2 5 % ,组间差异显著 (χ2 =13 475 ,P <0 0 5 ) ,E15组低于其他3组。结论　不同孕期ICR胎鼠大脑皮质均可先天性实验感染HCMV且大脑皮质损伤明显 ,胚胎发育迟缓     

HCMV先天性感染胎鼠脑组织中iNOS基因的表达

目的　研究人巨细胞病毒 (HCMV)先天性感染小鼠及在不同剂量诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)抑制剂和促进剂的干预下脑组织中的iNOS基因表达情况。方法　将 6～ 8周龄BALB/c小鼠分为 6组 ,每组 6只 ,♀♂各半。A组腹腔注射HCMV 1 0ml,B组、C组腹腔注射HCMV 1 0ml后2d ,分别每天腹腔注射氨基胍 (AG) 2 0 0mg/kg、2 0mg/kg ,D组、E组腹腔注射HCMV 1 0ml后 2d ,分别每天腹腔注射左旋精氨酸 (L Arg) 30 0mg/kg、30mg/kg ,F组为DMEM对照组 ,每天每只 0 2ml。持续 17d。以上各组在孕鼠受孕第19天 ,剖腹取胎鼠 ,观察各组胎鼠生长发育及体重 ,有无皮下出血、淤血等情况 ,同时取胎鼠脑组织 ,作以下检测 :①硝酸还原酶法测定脑组织匀浆中NO代谢产物亚硝酸盐的含量。②RT PCR测iNOSmRNA的转录。结果　HCMV感染各组孕鼠在孕 19d ,其体重明显低于对照组 ,有部分胎鼠发育迟缓并可见明显的出血现象。感染各组胎鼠脑组织匀浆NO代谢产物明显高于DMEM对照组 (P <0 0 0 1) ,以B组尤为明显 ,A、C、E组间无差异显著性。RT PCR在感染各组均扩增出iNOSmRNA特异性条带表达 ,B组信号量最高 ,D组信号最弱。DMEM对照组未检测到iNOS特异性条带。结论　HCMV先天性感染可刺激胎鼠脑组织iNOS的表达 ,其表达产物NO可能参与了脑组织病理损伤     

巨细胞病毒先天性感染对ICR鼠胚胎生长及脑组织发育的影响

目的探索人巨细胞病毒（HCMV ）先天性感染对胎鼠胚胎生长及脑组织发育的影响。方法 10周龄的ICR ♀♂鼠按1∶1配对,实验组于交配前及妊娠3天（E3）、7天（E7）、15天（E15）腹腔内接种HCMV悬液,对照组接种HF细胞上清液。于E0、E3、E6、E9、E12、E15、E19称取孕鼠体重。临产时剖腹取胚胎的大脑皮质,用常规组织切片及HE染色,检测组织的病理变化,同时取部分组织进行病毒分离。结果各实验组（除E15组）孕鼠自E15后体重较对照组明显降低。组织病理学检查发现,各实验组ICR胎鼠大脑皮质血管扩张、充血、出血,脑实质有单核细胞浸润,部分神经细胞变性坏死或凋亡及噬神经细胞现象,软化灶形成;受染的神经细胞核内出现HCMV特征性包涵体。E0、E3、E7、E15实验组大脑皮质病毒分离阳性率分别为60%、62%、67%、25%,组间差异显著（χ2=13.475,P＜0.05）,E15组低于其他3组。结论不同孕期ICR胎鼠大脑皮质均可先天性实验感染HCMV且大脑皮质损伤明显,胚胎发育迟缓。     

中药金叶败毒制剂体外抗人巨细胞病毒作用观察

目的：研究中药金叶败霉制剂(JYBD)抗人巨细胞病毒(HCMV)感染的可能机制。方法：采用体外细胞培养技术建立HCMV感染细胞模型，应用更昔洛韦(GCV)和JYBD进行干预，采用定量RT-PCR法检测干预后不同时间感染细胞HCMV即刻早期基因IE86 mRNA的表达水平，观察感染细胞的病变进展情况，同时采用放射免疫法测定受染细胞细胞因子TNF-α和IL-6的分泌水平。结果：JYBD与GCV对HCMV IE86 mRNA的表达以及HCMV所致细胞病变有明显的抑制作用，降低受染细胞TNF-α、IL-6的分泌水平，JYBD作用弱于GCV。结论：JYBD可通过抑制HCMV IE基因的转录。促进细胞因子的分泌而发挥体外抗HCMV作用。     

人巨细胞病毒AD169株引起小鼠脑部畸形的初步探讨

目的 :探讨人巨细胞病毒 (humancytomegalovirus ,HCMV)感染昆明小鼠的敏感性 ,建立HCMV致畸的动物模型。方法 :昆明系小鼠 4 0只 ,随机分为两组 :对照组 (8只 )和接种病毒组 (32只 ) ,病毒感染途径为脑内注射。在接种病毒 7,1 5 ,30 ,6 0d后不同时期分别以病理学方法观察动物脑部发育特点 ,以免疫组织化学方法检查病毒抗原 ,PCR方法检测动物脑组织中HCMV基因。结果 :接种HCMVAD1 69株的小鼠脑组织在不同时期发生了病理改变和脑部发育畸形 ,用免疫组织化学方法和PCR方法在脑组织细胞内检获HCMV抗原和基因。结论 :HCMVAD1 69株可引起小鼠脑部发育畸形 ,这对研究HCMV感染致畸的机制提供了有价值的参考依据     

抗病毒药物对HCMV感染的人脐静脉内皮细胞ICAM-1表达的影响

目的 观察人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cell,HUVEC304)细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)基因表达及抗病毒药物对ICAM-1表达的影响.方法 应用半定量逆转录-聚合酶链反应技术动态检测HCMV感染的HUVEC304和更昔洛韦(ganciclovir,GCV)与膦甲酸钠(foscarnet sodium,PFA)干预受染的HUVEC304 ICAM-1 mRNA的表达.结果 常规培养的HUVEC304可表达ICAM-1;HCMV感染后4 h,ICAM-1 mRNA的表达开始增加(P＜0.05),6 h达高峰(P＜0.01),36 h表达水平开始下降,但仍高于正常细胞;GCV和PFA可抑制HCMV感染诱导的ICAM-1表达的上调(P＜0.05).结论 HCMV感染可引起ICAM-1 mRNA的表达增加;应用GCV和PFA可抑制HCMV诱导ICAM-1 mRNA的表达.     

更昔洛韦联合中药金叶败毒制剂体外抗人巨细胞病毒作用观察

目的：研究更昔洛节(GCV)联合中药金叶败毒制剂(JYBD)抗人巨细胞病毒(HCMV)感染的可能机制。方法：采用体外细胞培养技术建立HCMV感染细胞模型．应用GCV、JYBD及两药联用进行干预,采用定量RT-PCR法检测干预后不同时间感染细胞HCMV即刻早期基因IE72 mRNA的表达水平,观察感染细胞的病变情况,同时采用放射免疫法测定受染细胞TNF-α和IL-6的分泌水平。结果：JYBD与GCV对HCMV IE72 mRNA的表达以及HC-MV所致细胞病变有明显的抑制作用,降低受染细胞的TNF-α、IL-6的分泌水平,JYBD作用弱于GCV,2药联合作用最强。结论：GCV联合JYBD可通过促进细胞因子的分泌,调节免疫功能,具有良好的体外抗HCMV作用。     

胎鼠大脑皮层神经干细胞的分离培养、分化及鉴定

目的:建立胎鼠大脑皮层神经干细胞体外分离、培养、分化及鉴定的方法,探讨神经干细胞的基本生物学特性.方法:取孕14 d胎鼠大脑皮层,吸管吹打机械分离制成单细胞悬液,采用无血清培养和胎牛血清诱导分化,应用免疫荧光技术鉴定神经干细胞及其分化的子代细胞.结果:从胎鼠大脑皮层分离的细胞呈神经巢蛋白(Nestin)免疫阳性并能在体外传代培养,血清诱导分化后的细胞可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白,诱导分化成的神经元能表达突触的特异性标志Synatophymin.结论:分离和培养的细胞能表达神经干细胞的特异性标志物Nestin,并且具有很强的增殖能力和多向分化潜能,属于中枢神经系统的神经干细胞.     

人巨细胞病毒增殖性感染新生乳鼠大脑皮质神经细胞

目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)AD169株在体外增殖性感染新生乳鼠大脑皮质神经细胞。方法在长成单层的Balb/c新生乳鼠的大脑皮质神经细胞培养物上,接种TCID50为5×103/3ml的HCMVAD169株感染的HF细胞上清液。通过相差显微镜、PCR、RT-PCR、间接免疫荧光、TCID50、透射电镜等方法观察和鉴定HCMV在神经细胞内的感染状况。结果接种病毒的大脑皮质神经细胞在感染后第1天即可观察到特征性细胞病变效应,且随着感染时间的延长病变逐渐加重;HCMVIE和UL83DNA及mRNA检测均可见阳性条带;HCMVpp65蛋白免疫荧光检测亦为阳性,蛋白质表达量随着培养时间的延长明显提高;TCID50检测随着感染时间的延长病毒滴度逐渐上升;在神经元胞浆内通过透射电镜观察到病毒颗粒。结论HCMVAD169株可能具有增殖性感染乳鼠大脑皮质神经细胞的能力。     

胶质瘤组织中人类巨细胞病毒的感染研究

目的 探讨人类巨细胞病毒(HCMV)在胶质瘤组织中的表达,为阐述HCMV感染在胶质瘤发病中的作用提供依据.方法 以HCMV糖蛋白B(UL55)基因设计引物,对62例不同级别星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤组织和7例外伤脑组织DNA进行巢式PCR检测.结果 62例中58例检测出HCMV基因片段,7例正常脑组织未检测出HCMV基因片段.结论 星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤患者存在HCMV感染,HCMV感染可能在胶质瘤发生、发展中起作用.     

巨噬细胞集落刺激因子在PDAPPV717I转基因小鼠脑组织中的表达

目的鉴定巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)在阿尔茨海默病(AD)模型PDAPPV717I转基因小鼠脑组织中表达与分布情况.方法通过原位杂交和免疫组织化学套染技术检测PDAPPV717I转基因小鼠脑组织中M-CSF mRNA的表达与分布情况.结果PDAPPV717I转基因小鼠脑组织中M-CSF mRNA的表达水平显著高于年龄匹配的非转基因小鼠(P＜0.01),而且M-CSF mRNA主要由活化的反应性星形胶质细胞产生.结论星形胶质细胞在AD的神经病理发生发展过程中发挥重要作用.     

弓形虫感染孕鼠后胎鼠脑病变动态定位研究

经孕鼠尾静脉注射弓形虫ＮＴ强毒株滋养体孵育液后分批处死，观察胎鼠脑动病理变化。结果表明，胎鼠脑病变主要为神经细胞变性、坏死、数量减少，胶质细胞明显增生。孕鼠感染后２小时，免疫组化即可在胎鼠脑组织内发现弓形虫。提示，先天性弓形虫感染的新生铆出现的中枢神经系统发育异常，是由于弓形虫对大脑神经细胞的损害所致；免疫组化显示组织、细胞内的弓形虫是一个简便、准确的诊断方法。     

产妇及其新生儿人巨细胞病毒感染状况研究

目的　探讨母亲分娩后和新生儿脐血中人类巨细胞病毒 (HCMV)IgM和IgG含量的关系 ,以及对新生儿1minApgar评分的影响。方法　分娩后母亲 96例 ,新生儿 96例 ,采用ELISA法检测HCMV IgG、IgM ,并计算新生儿1minApgar评分。结果　 96例产妇血清中HCMV IgG阳性率为 80 .2 1% ,IgM阳性率为 15 .6 3%。产妇妊娠期间HCMV感染均为激活感染。 96例新生儿先天性感染率为 2 .0 8%。产妇与其新生儿HCMV IgM检出情况密切相关。胎儿可以从其HCMV IgM阳性的母亲获得先天性感染 (13.3% )。此外 ,HCMV IgM阳性的产妇其新生儿Apgar评分低于正常产妇的新生儿 ,二者之间有明显差异 (P <0 .0 5 )。结论　HCMV活动性感染与母婴垂直传播密切相关。因此调查孕妇和新生儿HCMV感染情况对预防和减少新生儿先天性感染有重要意义     

人巨细胞病毒感染老龄小鼠的外周血T细胞亚群检测与分析

目的 在人巨细胞病毒(HCMV) 感染的BALB/c小鼠模型基础上,研究小鼠细胞免疫应答状态.方法 建立先天性潜伏感染的老龄小鼠(平均月龄≥18个月)模型,分别为HCMV先天性潜伏感染组(A)、先天性潜伏感染再激活组(B)及正常对照组(C),每组小鼠数均为6只.分别取各组小鼠外周血白细胞进行病毒分离、PCR和RT-PCR检测HCMV UL83基因DNA和相应mRNA来验证模型小鼠感染状态.采用流式细胞术对小鼠外周血T细胞亚群进行检测.结果 A组和B组小鼠病毒分离出HCMV,C组为阴性.A组小鼠可以用PCR检测出HCMV UL83 DNA,但RT-PCR检测不出相应的mRNA;B组小鼠用PCR、RT-PCR均可检测出相应产物;而C组均为阴性.A、B、C三组小鼠外周血中CD3+细胞构成比值分别为0.3305、0.0658和0.4318,组间差异有显著性(P<0.01);A、B、C三组中CD4+细胞的构成比值依次为0.6608、0.5998、0.6578,B组与A组及C组差异均有显著性(P<0.01),而在A组和C组间差异无显著意义(P>0.05);CD8+细胞比在A、B、C三组中的构成比值依次为0.2327、0.1150、0.1862,组间差异均有显著性(P<0.01);CD4+CD8+细胞在A、B、C三组中的比值依次为0.0990、0.1682、0.1192,组间差异有显著性(P<0.05).结论 HCMV先天性潜伏感染及 HCMV先天性潜伏感染再激活均可使老龄小鼠的细胞免疫功能降低,尤以后者显著.表明HCMV对先天性潜伏感染再激活老龄小鼠的细胞免疫状态有明显的抑制作用.     

人巨细胞病毒感染对人神经干细胞定向星形胶质细胞分化过程中Notch相关信号分子表达的影响

目的 人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)感染可抑制神经干细胞(neural stem cell, NSC)的增殖和分化,Notch信号对NSC的增殖和分化具有重要的调控功能.文中研究HCMV感染对人NSC向星形胶质细胞分化过程中Notch信号相关分子Notch1~3、Jagged(JAG)1、delta-like(DLL)1及早老素(presenilin, PS)1表达的影响.方法 体外分离培养海马NSC,并诱导其向星形胶质细胞分化.同时以感染复数(multiplicity of infection, MOI)为5的HCMV AD169株感染NSC,分别在感染后0、1、3、5、7d收获细胞,用实时RT-PCR法检测细胞内Notch1-3及其受体JAG1、DLL1的转录水平,Western blot法检测Notch1细胞内段(Notch 1 intracellular domain, NICD)含量的变化.结果 未分化状态的NSC含有大量Notch1 NICD,Notch1-3、JAG1、DLL1mRNA呈高表达.诱导分化1d后,Notch各受体、配体mRNA表达均显著下降,3d后表达回升,至第7天显著升高且可检出大量激活的NICD.HCMV感染组细胞在诱导分化1d后Notch相关受体、配体mRNA水平亦明显下降,与对照组相比Notch1、Notch2和DLL1的表达更少.在以后各个时间点Notch相关受体、配体mRNA水平均低于对照组.PS1的表达仅在1d时低于对照组.病毒感染7d后,细胞内NICD含量明显低于对照组. 结论 HCMV感染可抑制Notch相关受体、配体的表达与活化,Notch信号异常表达参与HCMV感染所致NSC分化和增殖异常.     

体外人巨细胞病毒感染与核转录因子AP-1活化及原癌基因c-jun表达的研究

目的　研究人胚肺成纤维 (HEL)细胞感染人巨细胞病毒 (HCMV)后 ,转录激活蛋白 1(AP 1)活化和原癌基因c junmRNA表达的时序性变化 ,探讨其在HCMV感染中的作用。方法　采用原位杂交法检测c junmRNA的表达 ,凝胶电泳迁移率改变试验 (EMSA)检测AP 1活性。结果　HEL细胞感染HCMV后 15min ,c junmRNA即有阳性表达 ,30～ 6 0min达高峰 (P <0 0 1) ,以后逐渐下降 ,正常对照组HEL细胞无c junmRNA表达。HCMV感染后AP 1亦迅速被活化 ,至 2h达高峰 (P <0 0 1) ,其后有所下降 ,维持于一定水平。结论　HEL细胞感染HCMV后 ,c junmRNA表达迅速增加 ,AP 1活化。提示HCMV可能通过刺激原癌基因过度表达而参与细胞的信号传导 ,以干扰细胞增殖和分化的调控 ;AP 1活化为早期病毒基因有效表达所必需 ,并可启动一系列前炎性细胞因子的基因转录与蛋白合成。     

人巨细胞病毒AD169株引起小鼠脑部畸形的初步探讨

目的：探讨人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)感染昆明小鼠的敏感性，建立HCMV致畸的动物模型。方法：昆明系小鼠40只，随机分为两组：对照组(8只)和接种病毒组(32只)，病毒感染途径为脑内注射。在接种病毒7，15，30，60d后不同时期分别以病理学方法观察动物脑部发育特点，以免疫组织化学方法检查病毒抗原，PCR方法检测动物脑组织中HCMV基因。结果：接种HCMV AD169株的小鼠脑组织在不同时期发生了病理改变和脑部发育畸形，用免疫组织化学方法和PCR方法在脑组织细胞内检获HCMV抗原和基因。结论：HCMV ADl69株可引起小鼠脑部发育畸形，这对研究HCMV感染致畸的机制提供了有价值的参考依据。     

临床低传代人巨细胞病毒株UL148开放阅读框mRNA的表达与鉴定

目的 研究广州地区人巨细胞病毒(HCMV)临床病毒株特有基因UL148的结构,分析其结构多态性与HCMV先天性感染致病的关系;研究UL148的表达情况,探讨其产物可能的功能及在致病机制中的可能作用.方法 采集广州地区新生儿HCMV感染患者尿液标本进行病毒分离培养,从分离的病毒株中提取病毒DNA,扩增鉴定UL148基因片段;TA克隆,基因测序;抽提病毒总RNA,用RT-PCR方法鉴定UL148基因mRNA表达情况.结果 成功分离到HCMV低传代临床株,获得UL148基因全序列.RT-PCR产物检测582 bp大小的特异性条带,证实了UL148基因mRNA的表达.结论 广州地区临床低传代HCMV分离病毒株存在UL148基因结构,证实UL148开放阅读框是具有mRNA水平表达的基因结构.