喹乙醇单克隆抗体的制备及其免疫学特性的鉴定

通过质谱法鉴定合成喹乙醇-半琥珀酸酯(OLA-HS),紫外法及凝胶电泳法鉴定全抗原OLA-BSA和OLA-OVA后,使用杂交瘤技术制备喹乙醇单克隆抗体(OLA mAb),对其效价、亲和力、敏感性、特异性及亚型进行鉴定,并通过体内诱生腹水法进行大量制备。试验结果表明,本研究成功制备了OLA-HS,且半抗原与载体蛋白偶联成功;筛选出的5株杂交瘤细胞单抗同种型均为IgG1,细胞培养上清间接ELISA效价在1∶3.0×102～1∶1.28×103之间,用4E12细胞株制作的腹水效价为1∶5.12×105。OLAmAb亲和常数Ka为3.75×1010L/mol,对OLA的IC50为1.51ng/ml,且具有较好的特异性。试验获得了高效价、敏感、特异的OLA mAb,可用于动物性食品中OLA残留检测的免疫学试验。     

磺胺二甲氧嘧啶单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

用重氮化法将SDM(磺胺二甲氧嘧啶)偶联于载体蛋白BSA和OVA,合成免疫原BSA-SDM和包被原OVA-SDM,并用紫外扫描(UV)、SDS-PAGE进行鉴定;用BSA-SDM免疫BALB/C小鼠,间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠;应用杂交瘤技术建立分泌SDM mAb细胞株,用体内诱生腹水法制备SDM mAb;对SDM mAb的效价、亲和性、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。结果表明,BSA-SDM人工抗原制备成功,分子结合比约为1∶12.1;筛选出1B43、D9、4E1共3株敏感特异的杂交瘤细胞,间接ELISA效价细胞培养上清分别为1∶3.2×102、1∶5.12×102、1∶8.1×102,腹水分别为1∶2.56×105、1∶2.56×1051、∶5.12×105,4E1亲和常数(Ka)为1.25×1010L/mol;4E1株对SDM的IC50为16.64ng/ml,与磺胺-6-甲氧嘧啶交叉反应率为5%,与其他磺胺类药物无交叉反应性。本试验获得了抗SDM高价、敏感、特异的mAb,可用于SDM残留检测的免疫学试验。     

绵羊甘露聚糖结合凝集素基因(MBL)全长DNA序列克隆及生物信息学分析

绵羊甘露聚糖结合凝集素(MBL)是肌体天然免疫系统的重要组成部分。根据人(Homo sapiens)和牛(Bos taurus)的MBL基因序列的同源保守区域,分段设计9对特异性引物,以中国美利奴羊(Ovis aries)血液基因组DNA为模板,经扩增、测序、拼接,首次克隆到长为4462bp的绵羊MBL基因组DNA序列,包括了该基因的启动子区、4个外显子和3个内含子,编码249个氨基酸;BLAST分析其与牛MBL-C编码的氨基酸同源性最高为96.39%,判定其为MBL-C型基因,并将该序列提交至GenBank(Accession No.FJ977629);通过Expasy网站预测其蛋白结构功能特征,1～19氨基酸为绵羊MBL基因信号肽区域,外显子1编码N-端富含胱氨酸区和8个Gly-X-Y重复序列的胶原样区,外显子2含有12个Gly-X-Y的胶原样区,外显子4编码的碳水化合物识别域(CRD)具有C型凝集素CRD的共同特征。本研究为国内首次报道绵羊MBL基因比较完整基因组DNA序列,为深入研究MBL的结构与功能以及MBL缺损的分子机制提供基础数据。     

绵羊甘露聚糖结合凝集素（MBL）基因的克隆及序列分析

甘露聚糖结合凝集素(MBL),又称甘露聚糖结合蛋白(mannan/mannose-binding protein,MBP),是C型凝集素超级家族中胶凝素家族成员.目前,关于MBL的研究在人、小鼠和大鼠上已经相当详尽,在牛、猪、马、弥猴、黑猩猩、狒狒、兔和鸡上也有一定的研究,除鸡外,其余的都已发现2种MBL:MBL-A(血清型)和MBL-C(肝型),但在绵羊上仍为空白.本实验以绵羊的基因组DNA为模板,借助人、牛MBL的保守序列来获得绵羊MBL基因片段.     

安徽省大豆疫病病原鉴定及生物学特性研究

自安徽蒙城大豆疫病病株上分离得到2个疫霉菌株,对其培养性状、形态特征、生理特性等方面进行了鉴定研究。结果表明,2个菌株均为同宗配合的,雄器绝大多数侧生,偶见围生;孢子囊无乳突,不具脱落性,内层出;最高生长温度35°C,最低生长温度高于7°C,对孔雀绿敏感;对大豆具有致病性。根据研究结果,参照主要疫霉分类检索表,将上述菌株鉴定为大雄疫霉大豆专化型(P hy tophthora m eg asp erm af.sp.g ly cinea)。据此初步认为大雄疫霉大豆专化型是引致安徽蒙城大豆疫病的病原菌。     

大豆抗胞囊线虫4号小种转录组测序及分析

大豆胞囊线虫(soybean cyst nematode,SCN)(Heterodera glycines)是一种世界性的大豆(Glycine max)病害.本研究以抗SCN4号生理小种的黑豆为研究对象,对大豆胞囊线虫侵染后的两个发育时期进行转录组测序和生物信息学分析,宏观了解大豆的抗病机制.通过Illumina HiSeqTM2500测序共获得1.96× 1010 bp的数据.经过分析后,接种后第9天(第一时期)和接种后第17天(第二时期)分别得到2 180个和4 210个差异表达基因,同时,对差异表达基因进行基因本体(Gene Ontology,GO)注释,蛋白质直系同源簇(Clusters of Orthologous Groups of proteins,COG)注释,结果显示,GO注释和COG注释分别将差异表达基因分为了58和25个功能类别.另外,京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析结果表明,可将两个时期的差异表达基因分别定位到83和105个具体的代谢途径分支.其中,参与到激素信号转导途径,苯丙氨酸代谢,能量代谢等过程中的差异基因最多,这些数据为进一步筛选抗病关键基因及功能验证等研究提供了依据.     

检测及鉴定Roundup Ready转基因大豆寡核苷酸芯片的制备

通过对Roundup Ready转基因大豆（简称RRS）的基因盒结构分析,筛选了包含筛选基因、种属相关基因、目的基因、交联结构基因、特异结构基因、内对照基因、其它阴性控制基因和阳性参考目的基因的特异探针,制备了检测及鉴定Roundup Ready转基因大豆的寡核苷酸芯片。实验表明,该芯片探针特异性好,可在一张芯片上完成对Roundup Ready转基因大豆结构的鉴定;内对照基因灵敏度高,检测极限为0．1ng（DNA）,从而消除假阴性概率;同常用的凝胶电泳检测方法相比,芯片杂交方法灵敏度（RRS为0．5％）优于凝胶电泳检测（RRS为1％）。     

调环酸钙对盐碱胁迫下不同耐盐性大豆品种根系生长及生理特性的影响

为探讨调环酸钙(Pro-Ca)对盐碱胁迫下大豆(Glycine max)根系生长的缓解作用,以大豆品种合丰50(耐盐)和垦丰16(盐敏感)为试验材料,研究叶面喷施100 mg·L^-1 Pro-Ca对盐碱胁迫下大豆根系生长特性、活性氧代谢、抗氧化酶活性和渗透调节物质含量的影响。结果表明,外源喷施Pro-Ca均能不同程度缓解盐碱胁迫对合丰50和垦丰16根系生长的抑制,两品种根长、根鲜重和根干重分别增加了11.2%和23.6%、3.2%和19.8%、38.0%和37.6%;上调了盐碱胁迫下大豆根系超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性以及抗坏血酸(AsA)和谷胱甘肽(GSH)水平;抑制了 {\mathrm{O}}_2^{\frac{-}{·}} 和H₂O₂积累,降低了丙二醛(MDA)含量和电解质渗漏率(EL);促进了渗透调节物质积累,合丰50和垦丰16大豆根系的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量分别增加了5.1%~7.8%和6.2%~28.0%、6.6%~17.8%和3.8%~10.3%、19.1%~31.9%和6.9%~27.8%。主成分分析表明外源喷施Pro-Ca对耐盐品种合丰50 和盐敏感品种垦丰16根系均具有较好的调控效果。综上所述,外源喷施Pro-Ca可通过增强根系抗氧酶活性、渗透调节能力以及降低膜脂过氧化来增强大豆根系的耐盐碱能力。本研究初步阐明了Pro-Ca缓解大豆根系盐碱胁迫伤害的生理生化机制,为进一步从分子水平揭示其作用机制提供了理论依据。     

荫蔽信号对大豆幼苗生长和光合特性的影响

红光/远红光比值(R/FR)下降是自然界荫蔽发生的重要信号。为探究大豆幼苗对荫蔽信号的应答机制,本文采用室内盆栽试验,以‘南豆12’和‘南032-4’两个大豆品种幼苗为材料,通过正常光照和低R/FR两种光照处理后,对其形态、光合特性以及叶绿素荧光参数进行研究。结果表明:与正常光照相比,低R/FR下,两个大豆材料幼苗均表现出典型的避荫性反应,即株高、叶面积、叶柄长、节间长增加,茎秆变细,其中,‘南豆12’的株高、叶柄长、节间长分别显著增加7.86%、81.48%、26.55%,‘南032-4’分别增加3.95%、76.67%、20.00%;叶片的光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)提高,胞间二氧化碳浓度(Ci)和初始荧光强度(Fo)、最大荧光(Fm)、最大光化学效率(Fv/Fm)、PSⅡ实际光化学效率(ΦPSⅡ)、光化学淬灭系数(q P)等降低,非光化学淬灭系数(q N)升高,总干物质积累量增加,其中,‘南豆12’和‘南032-4’的Pn分别增加37.21%和39.04%、总干物质积累量分别增加12.35%和17.36%、Ci分别降低9.29%和11.72%。然而,不同大豆材料对低R/FR的敏感程度不同。在低R/FR光环境下,‘南豆12’较‘南032-4’表现出较低的株高、节间长、叶柄长,较大的叶面积和茎粗,较高的光能传递转换效率、Pn、Gs以及干物质积累量,体现了对荫蔽较强的适应性。本研究进一步证实了大豆具有感受荫蔽信号(低R/FR)的能力,但其敏感程度因品种不同而不同,在间套作过程中,为提高大豆耐荫性,降低大豆因避荫反应导致的倒伏率,保障大豆产量,应该选择对荫蔽信号不敏感的品种。     

播期对高蛋白大豆新品种(系)农艺性状、品质及产量的影响

为明确高蛋白大豆新品种(系)在黄淮海区的适宜播期,本研究以黄淮海地区高蛋白大豆新品种(系)圣豆18、圣豆24、菏豆37、菏豆38为试验材料,设置不同播期试验,研究不同播期对各大豆品种(系)生育期、农艺性状、干物质积累、籽粒品质及产量的影响.结果 表明,播期推迟,出苗至始花期缩短幅度较大,大豆全生育期缩短;大豆株高、底荚...     

抗苯巴比妥单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选及ciELISA试剂盒的研制

用BSA-pAPB免疫Balb/c小鼠，用细胞融合技术制备并用间接ELISA和阻断ELISA筛选抗苯巴比妥单克隆抗体(PB mAb)杂交瘤细胞株，体内诱生腹水法生产PB mAb，应用PB mAb研制PB残留竞争ELISA(ciELISA)快速检测试剂盒(PB-Kit)，并测定其性能。结果表明，筛选出3株杂交瘤细胞，最好的3F6-C4株的PB mAb间接ELISA效价为1∶6.4×105，亲和常数(Ka)为1.96×1010 L/moL，半数抑制浓度(IC50)为5.7 μg/L，与巴比妥的交叉反应率(CR%)12.4%，与其它化合物无CR；PB-Kit的线性检测范围1.0～81 μg/L，灵敏度0.75 μg/L，检测限1 μg/L；饲料样和猪尿样的平均添加回收率85.8%和91.3%，平均批内和批间变异系数均<15%。PB-Kit具有快速、敏感、特异、简便等特点，适合PB残留快速检测的推广应用。     

重组马白细胞介素-18生物学活性的测定及单克隆抗体中和活性鉴定

应用实时荧光定量RT-PCR方法评价了大肠杆菌表达的重组马白细胞介素-18（rEIL-18）蛋白在商品化的重组人IL-12（rhIL-12）协同作用下刺激马外周血单核细胞（PBMCs）产生EIFN-gamma的情况。在rhIL-12的协同作用下,rEIL-18在体外刺激马PBMCs产生EIFN-gamma的效应是阴性对照的20倍之多,并且在一定rhIL-12浓度的条件下,rEIL-18在体外诱导马PBMCs产生EIFN-gamma的能力是呈一定的剂量依赖性。此外,评价了制备的9株抗rEIL-18单克隆抗体中和rEIL-18的生物学活性的能力,证实其中1株可中和rEIL-18的生物学活性,并且呈一定的剂量依赖性。结果表明：首次获得原核表达的具有生物活性的rEIL-18,其活性可被1株抗rEIL-18单克隆抗体中和。     

BBTV单克隆抗体的制备及其检测应用

香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)是危害香蕉(Musa paradisiaca)生产的重要病毒.本研究旨在以制备的抗BBTV特异性单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb)为核心建立检测BBTV的血清学方法,从而为该病毒的诊断和科学防控提供技术支撑.通过改进提纯方法获得了提纯的BBTV,以BBTV病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),经细胞筛选和克隆,获得1株分泌抗BBTV单克隆抗体的杂交瘤细胞22E3,并制备其单抗腹水.用间接酶联免疫吸附试验(indirect-enzyme-linked immunosorbent assay,in-ELISA)方法测定制备的单抗腹水效价达到10-7,抗体类型及亚类为IgG1,κ轻链.Western blot检测表明,该单抗与BBTV外壳蛋白亚基有特异性反应.利用制备的单抗建立了检测BBTV的斑点酶联免疫吸附试验(dot-ELISA).该方法检测感染BBTV香蕉植物组织粗提液呈特异性阳性反应,而和健康香蕉组织呈阴性反应,说明建立的dot-ELISA方法能特异性地检测香蕉植物组织中的BBTV.灵敏度分析表明,以22E3单抗为核心建立的dot-ELISA方法检测香蕉病组织的灵敏度达1∶640(W/V,g/mL).田间样品检测结果表明,建立的dot-ELISA方法能准确、可靠地用于香蕉中BBTV病毒的检测.BBTV单克隆抗体的制备及其dot-ELISA血清学检测方法的建立为我国香蕉上BBTV的诊断、无毒苗的生产及科学防控提供了物质和技术支撑.     

抗鸡贫血病毒结构蛋白单克隆抗体制备及其对应抗原表位分析

以纯化的原核表达的鸡贫血病毒结构蛋白为抗原，免疫6-8w的雌性Balb/c鼠, 经过三次免疫后，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，以纯化的蛋白为抗原进行ELISA检测，将阳性细胞孔经过三次有限稀释，共获得6株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株。间接免疫荧光试验证实6株单抗可以与鸡贫血病毒感染的MDCC-MSB1细胞发生特异性反应，Western blot结果显示单抗与杆状病毒表达的VP1重组蛋白可以发生特异性反应。利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒进行亚型鉴定，结果表明6株单抗均为IgG1亚型，且所有单抗的轻链均为κ链。用单克隆抗体对分段表达的VP1蛋白进行免疫印迹分析，初步鉴定了筛选出的单抗所对应的抗原表位，其中有四株单抗识别的表位位于VP1 218-274位氨基酸之间，另外两株单抗识别的表位分别位于275-301位、324-369位氨基酸之间。     

马白细胞介素-18单克隆抗体的制备及其特性的初步鉴定

摘要：利用纯化的用原核系统表达的重组马白细胞介素-18成熟蛋白(pET-mEIL-18)抗原免疫BALB/c 小鼠，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，同时以昆虫杆状病毒表达系统获得的马白细胞介素-18成熟蛋白(mEIL-18)作为抗原进行间接ELISA检测，筛选并最终得到了9株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株。利用IFA试验对9株单克隆抗体进行鉴定，结果证实所获得的9株细胞分泌的抗体都是针对mEIL-18的特异性抗体。将此9株单克隆抗体分别与用原核系统分段表达的重组马白细胞介素-18成熟蛋白pET-mEIL-18-(1)(mEIL-18 1～78位氨基酸残基)和pET-mEIL-18-(2)(mEIL-18 79～157位氨基酸残基)蛋白进行特异性ELISA检测，结果表明，9株单克隆抗体有5株识别表达的pET-mEIL-18-(1)(mEIL-18 1～78位氨基酸残基)，而另外4株单克隆抗体与pET-mEIL-18-(2)(mEIL-18 79～157位氨基酸残基)发生反应，说明所获得的9株单克隆抗体至少针对pET-mEIL-18 2个或2个以上不同的抗原表位。单克隆抗体亚型鉴定试剂盒的鉴定结果显示，除M1F11、M3A11和N7D9为IgM，其余的单克隆抗体均为IgG1，而且所有单克隆抗体的轻链均为?资链。     

Fusion Expression and Purification of Marek’s disease virus Tegument Protein VP16 and Its Antibody Preparation

马立克氏病病毒(Marek’s disease virus ,MDV)UL48基因编码的蛋白与单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus ,HSV)衣壳蛋白VP16为同源物，将其克隆入pET-32a载体中，获得pET-VP16, 转化Escherichia coli BL21感受态细胞，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳显示:融合蛋白获得可溶性表达，表达蛋白的相对分子量约为67 kD；将表达的融合蛋白过His·Bind柱，获得纯化的蛋白，将该蛋白免疫家兔，制备多克隆抗体。通过间接ELISA和Western blot鉴定制备的多克隆抗体的效价和特异性，结果表明，该抗体具有较高的特异性，间接ELISA效价大于2×10－5。     

兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白A(OmpA)重组蛋白单克隆抗体的制备及潜在应用

制备兔多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)外膜蛋白A(OmpA)重组蛋白单抗,为兔多杀性巴氏杆菌病的诊断提供特异性强,灵敏度高的单克隆抗体。本研究选取并扩增Pm外膜蛋白基因OmpA,原核表达获得了的大小为37.6kD的OmpA重组蛋白,以纯化复性的兔多杀性巴氏杆菌OmpA重组蛋白作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),取其脾细胞与SP2/0细胞融合,ELISA筛选出了4株分泌Pm OmpA蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为5D2、BC11、2A2和6A4。其中2A2细胞培养液效价为1∶256,5D2、BC11和6A4效价为1∶128;2A2腹水效价为1∶12800,其余3株达1∶6400。杂交瘤细胞经反复冻存、复苏及多次传代,仍能稳定分泌高效价抗体。Western blot显示,4株单克隆抗体均能与Pm OmpA重组蛋白重组发生特异性反应。用ELISA方法鉴定2A2单克隆抗体亚型为IgG2b,Protein A亲和纯化2A2腹水抗体,获得的单抗浓度为130μg/mL。选取纯化的2A2单克隆抗体进行潜在应用研究,Western blot与间接免疫荧光结果显示,单克隆抗体能与兔多杀性巴氏杆菌分离菌株发生特异性反应。表明利用体外重组表达兔多杀性巴氏杆菌OmpA融合蛋白制成的杂交瘤能够稳定分泌效价高、特异性强的单克隆抗体,可用于兔多杀性巴氏杆菌诊断,本研究结果为兔多杀性巴氏杆菌诊断试剂盒的研制提供技术参数。     

猪转录因子Nanog高效表达、多克隆抗体制备及其应用

多能转录因子Nanog可维持干细胞的自我更新和多向分化潜能.为深入研究猪(Sus scrofa)Nanog在多能性调控网络的作用,本研究制备了鼠抗猪源Nanog多克隆抗体.首先,从猪肾脏中克隆Nanog基因CDS,再将CDS连接到pET32a质粒上,构建重组表达载体pET32a-Nanog.将重组载体转化大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3),经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,优化最佳诱导时间、温度和IPTG浓度等表达条件,获得分子量为57 kD的Nanog重组蛋白.将纯化的Nanog蛋白,免疫C57BL/6小鼠(Mus musculus),6周后获得阳性抗血清,通过Western blot和免疫荧光检测其抗体效价及其特异性.结果显示,在28℃、8 mmol/L IPTG、诱导2.5 h的条件下,可获得高效Nanog重组表达;制备的鼠抗猪Nanog多克隆抗体能特异性识别猪诱导多能干细胞表达的Nanog蛋白.研究结果为猪多能性干细胞的研究提供了有力工具.