METH1在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测

目的通过观察血管生成抑制因子METH1的cDNA片段在酵母双杂交中的表达及检测其对报告基因有无激活作用,为进一步明确METH1抑制增生性瘢痕的分子机制奠定基础。方法采用酵母双杂交Gal4系统3,经PCR扩增子METH1的cDNA片段,分别克隆入pUC19质粒,经测序正确后,再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中。将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因的激活作用。结果成功获得METH1的cDNA片段,该片段所表达的蛋白对酵母菌AH109无毒性,且对报告基因无激活作用。结论血管生成抑制因子METH1蛋白活性区在酵母双杂交系统中的表达产物,可作为诱饵蛋白进行相互作用蛋白的筛选研究。     

蛋白质酵母双杂交系统的建立及其在大肠癌肝转移研究中的意义

目的 建立酵母双杂交系统,筛选与FasL相互作用的蛋白,探讨FasL与大肠癌肝转移的关系。方法 以FasL基因构建诱饵蛋白质粒,筛选人胎肝cDNA文库,鉴定与FasL相互作用的蛋白,通过生物信息学分析FasL及其相互作用蛋白在大肠癌肝转移中的作用。结果 筛选出10个与FasL特异性相互作用的蛋白,包括金属硫蛋白1K、1G、2A,组织蛋白酶B,脂肪酸合成酶,干扰素α诱导蛋白27,磷脂清除酶,丝氨酸／苏氨酸样激酶,锚着黏附蛋白以及纤维微丝蛋白-5等。结论 成功建立了筛选FasL相互作用蛋白的酵母双杂交系统,并初步证明FasL与组织蛋白酶、金属硫蛋白、锚着黏附蛋白等之间的相互作用与大肠癌肝转移密切相关。     

应用酵母双杂交系统筛选小鼠PIAS2相互作用蛋白

目的:应用酵母双杂交技术,从小鼠精原细胞cDNA文库中筛选与PIAS2(protein inhibitor of activatedSTAT2,PIAS2)相互作用的未知蛋白。通过对其相互作用蛋白的筛选和研究,探讨PIAS2在精子发生中的作用机制,为临床男性不育症的治疗和诊断提供理论基础。方法:以pGBKT7-PIAS2为诱饵质粒,从小鼠精原细胞cDNA文库中筛选出与pGBKT7-PIAS2相互作用的阳性克隆,对验证后的阳性克隆进行测序及生物信息学分析,进一步采用直接酵母双杂交进行相互作用的验证。结果:经过筛选、测序、同源性分析及直接酵母双杂交验证,发现了与PIAS2相互作用的8个候选蛋白:Cyfip2、Psmb3、Nme1、nischarin、Nsun5、Ints10、Gnb2l1及Ndufaf3。结论:应用酵母双杂交系统,共筛选得到了8个不同的基因,其编码蛋白与PIAS2相互作用,可能与男性生殖调控相关。对上述蛋白与PIAS2的相互作用研究有助于揭示PIAS2的作用机制。     

乳鼠成骨细胞酵母双杂交cDNA文库构建

目的构建乳鼠成骨细胞的酵母双杂交cDNA文库。方法用TRIzol法提取乳鼠成骨细胞总RNA,按照SMART cDNA Library Construction Kit ( CLONTECH)说明书反转录合成双链cDNA.Spin Column去除短片段,然后用同源重组的方法将双链 cDNA和PGADT7~rec载体共转化到酵母细胞Y187中,建立文库并计算文库滴度。结果提取的总RNA的A 260/A 280为 1.99,琼脂糖凝胶电泳示28SrRNA、18SrRNA2条带,且28S与18S带亮度比值约为2。酵母文库库容为1. 68 x 107,重组率为 100%。插人片段PCR检测提示大小分布为1. 5 -4. 0 kb,平均长度约为3. 0 kb。结论乳鼠成骨细胞酵母双杂交cDNA文 库构建成功。     

人分泌的凋亡相关蛋白1基因酵母双杂交诱饵载体的构建及表达鉴定

目的构建人分泌的凋亡相关蛋白1(secreted apoptosis-related protein 1,SARP1)基因酵母双杂交诱饵载体,为鉴定SARP1基因相互作用蛋白、探讨SARP1基因在瘢痕组织中的生物学功能奠定基础。方法根据GenBank中SARP1的mRNA序列,设计分别带有NdeⅠ和SalⅠ酶切位点的上、下游引物,人工合成SARP1基因片段,扩增SARP1基因片段,构建含pGBKT7-SARP1基因的重组质粒,用NdeⅠ和SalⅠ进行双酶切、PCR,凝胶电泳及测序。用醋酸锂法将序列正确的重组质粒pGBKT7-SARP1(卡那霉素抗性筛选)转化入AH109酵母菌株,在缺陷型培养基上观察pGBKT7-SARP1在AH109中的表达情况。结果 SARP1基因扩增后的片段大小符合预期,并成功克隆入pGBKT7载体中;酶切后凝胶电泳及DNA测序显示pGBKT7-SARP1基因重组载体构建正确,对酵母菌株AH109无毒性,且不具自主激活报告基因的效应。结论成功构建了pGBKT7-SARP1基因酵母双杂交诱饵载体。     

人睾丸酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

目的:构建应用于酵母双杂交系统的人睾丸组织cDNA文库。方法:从正常人睾丸组织总RNA中纯化出mRNA,以SMARTШTM和CDSШ为引物,合成两端具有同源臂的双链cDNA,后者与线性质粒pGADT7-Rec共转化入感受态酵母细胞Y187,两者在酵母细胞中同源重组成环形的cDNA文库质粒,收集在营养缺陷培养板上筛选出的所有克隆,即为人睾丸酵母双杂交cDNA文库。结果:构建了具有基因多样性和库容量足够大的人睾丸cDNA文库,共获得2×106个转化子,插入的双链cDNA片段的长度在0.3～4.0 kb之间。结论:利用ClontechSMART技术,成功构建了应用于酵母双杂交的人睾丸组织cDNA文库,为探讨人精子发生的分子机制奠定了基础。     

酵母双杂交技术筛选p7TP2蛋白结合肝细胞蛋白的编码基因

目的 筛选HCV p7蛋白反式调节蛋白p7TP2的结合蛋白,探讨HCV的致病机制及新蛋白p7TP2的生物学功能.方法 应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的p7TP2基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化单倍体酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝细胞文库质粒pACT2的单倍体酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠埃希菌氨苄青霉素-LB平板上选择并测序,结果在GenBank中进行生物信息学分析.然后将阳性文库质粒与诱饵质粒回交,以证实其相互作用.结果 筛选出与p7TP2结合的蛋白基因10个,其中包括金属硫蛋白2A、载脂蛋白H、蛋白C、果糖二磷酸醛缩酶B、配对免疫球蛋白样2型受体α、CTL1基因类胆碱运输蛋白等已知功能蛋白基因相互作用,回交试验已经证实其相互作用.结论 由本研究结果发现p7TP2蛋白可以结合一系列不同功能的肝细胞蛋白,作为一种新基因,对它的进一步作用机制的研究将为阐明HCV感染及慢性肝炎、肝纤维化和肝癌的病理机制提出新的思路.     

雄激素受体相关蛋白267-α酵母双杂交诱饵重组质粒的构建及转化

目的 构建和转化雄激素受体相关蛋白267—α(ARA267—α)的酵母诱饵重组质粒，为通过酵母双杂交研究ARA267—α的功能奠定基础。方法 用PCR扩增ARA267—α全长cDNA中编码PWWP和PHD-SET蛋白结构域的两个基因片段；将基因片段与pGBKT7载体定向重组；用酶切和测序鉴定重组质粒；将核苷酸序列正确的重组质粒转化入AH109酵母菌株。结果 成功构建pGBKT7-PWWP和pGBKT7—PHDSET重组质粒。分别转化有2种重组质粒和pGBKT7空载体的3种AH109酵母都能在SD／-Trp／X—α—gal培养基中长成白色菌落，但都不能在SD／-HiS／-Trp／2．5mmol／L 3-AT／X—α—gal和SD／-Ade／-Trp／X—α—gal培养基中生长，在SD／-Trp液中培养16h后，A600均值分别为0．8、0．9、0．9。这表明重组质粒表达的融合蛋白没有激活HIS3、ADE2和MEL1酵母报告基因表达的活性，也没有酵母毒性作用。结论 构建的诱饵重组质粒可以用于下一阶段的cDNA文库筛选。     

斑马鱼notch1a对pka报告基因转录调控作用

目的 通过双荧光素酶报告基因研究斑马鱼notch1a对pka的转录调控作用.方法 利用NCBI数据库获得斑马鱼notch1a基因序列,克隆notch1a基因的胞内段NICD(Notch intracellular domain),构建pCMV-N1aICD表达载体,利用蛋白质印迹法检测N1aICD蛋白的表达水平;利用加...     

酵母双杂交系统筛选IEX-1相互作用蛋白

骨肉瘤恶性程度高,侵袭力强,易发生早期肺转移,预后差,严重影响青少年身心健康.近20年来,其5年生存率虽有所增加,但治疗一直处于平台期,化疗疗效没有较大提高[1].我们研究表明早期应答基因IEX-1与骨肉瘤相关,IEX-1在As2O3作用后,表达明显下调[2].     

人血管生成抑制分子的分子克隆与真核表达

目的　克隆人血管生成抑制分子 (METH1)全长cDNA ,建立稳定表达人METH1分子的哺乳动物细胞系。方法　RT PCR获取人METH1cDNA ,序列测定后克隆人真核表达载体pCDNA3 0中 ,用脂质体转染入HepG2细胞 ,G4 18筛选出稳定表达细胞系 ,用RT PCR与Westernblot分别检测RNA和蛋白表达水平。结果　RT PCR扩增得到预期大小的目的条带 ,序列分析表明成熟肽编码区与发表序列 [GI∶5 72 5 5 0 5 ]完全一致 ;克隆人pCDNA3 0中得到METH1真核表达载体 ,G4 18筛选 3周后得到稳定表达细胞系 ,RT PCR与Westernblot显示METH1在HepG2细胞中有高水平表达。结论　人METH1全长cDNA成功克隆 ,并在哺乳动物细胞系HepG2中获得稳定表达 ,为进一步研究METH1分子对增生性瘢痕血管形成的作用奠定了理论基础。     

METH1基因截短体的构建及其对HUVEC细胞增殖的影响

目的筛选血管生成抑制因子METH1功能编码区基因片段,为进一步研究METH1抑制增生性瘢痕的分子机制奠定基础。方法设计METH1三种基因截短体,分别构建相应的重组pcDNA3.1真核表达载体,然后将其稳定转染入HUVEC细胞,用RT-PCR、Western-Blot方法检测其在细胞中的表达,最后,通过MTT及FCM法验证其对HUVEC细胞增殖的影响。结果获得了能稳定表达的三种截短体,其中METH1-T2同METH1一样具有明显抑制HUVEC细胞增殖的作用,而METH1-T1、METH1-T3抑制细胞增殖的效果不明显。结论所获METH1-T2为功能活性区片段,可以替代METH1全长进行抑制增生性瘢痕的分子机制研究。     

METH1基因截短体的构建及其对HUVEC细胞增殖的影响

目的筛选血管生成抑制因子METH1功能编码区基因片段,为进一步研究METH1抑制增生性瘢痕的分子机制奠定基础。方法设计METH1三种基因截短体,分别构建相应的重组pcDNA3.1真核表达载体,然后将其稳定转染入HUVEC细胞,用RT-PCR、Western-Blot方法检测其在细胞中的表达,最后,通过MTT及FCM法验证其对HUVEC细胞增殖的影响。结果获得了能稳定表达的三种截短体,其中METH1-T2同METH1一样具有明显抑制HUVEC细胞增殖的作用,而METH1-T1、METH1-T3抑制细胞增殖的效果不明显。结论所获METH1-T2为功能活性区片段,可以替代METH1全长进行抑制增生性瘢痕的分子机制研究。     

pCDNA3.0载体介导METH1基因对人脐静脉内皮细胞生长的抑制

目的研究METH1基因对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外生长的抑制作用。方法构建真核表达载体pCDNA3.0-METH1,转染肝癌细胞系HepG2中。体外扩增HUVEC,采用MTT法检测HepG2/METH1及HepG2培养的上清对HUVEC增殖的影响。结果成功的构建了真核表达载体pCDNA3.0-METH1,并在HepG2中稳定表达。MTT法结果显示与对照组相比,HepG2/METH1组对HUVEC增殖有明显的抑制作用,并呈剂量依赖性(P<0.01);而HepG2组对HUVEC增殖有明显的促进作用,呈剂量依赖性(P<0.05)。结论pCDNA3.0-METH1对HUVEC体外生长具有明显的抑制作用,提示METH1对瘢痕内血管的抑制治疗具有潜在的临床应用价值。     

Notch信号转导途径配体基因JAG1和DLL1在结直肠癌中的表达及临床意义

目的探讨Notch信号传导途径配体基因JAG1和DLL1在结直肠癌的表达及其与临床病理特征和肿瘤预后之间的关系。方法回顾性分析2004年8月至2006年9月在南京中医药大学第三附属医院全国肛肠医疗中心行手术治疗的146例结直肠癌患者的临床及随访资料．建立患者肿瘤标本组织芯片并对JAG1和DLL1基因表达进行免疫组织化学检测。结果146例患者JAG1表达与其肿瘤分化程度有关．DLL1表达在不同肿瘤部位的表达差异有统计学意义（均P〈0．05）;两种基因表达与微卫星不稳定状态之间差异无统计学意义（P〉0．05）。134例（91．8％）患者获随访,随访时间（42．3±13．3）个月。无瘤生存86例（64．1％）,1、3和5年总生存率分别为93％、74％和67％。多因素分析显示,患者预后与TNM分期、病理学类型、微卫星状态、JAG1基因表达有关（P〈0．05）。JAG1基因高表达患者预后优于阴性表达和弱阳性表达的患者（P〈0．05）。结论Notch信号转导途径配体基因JAG1和DLL1表达分别与肿瘤分化程度及肿瘤部位有关．JAG1基因与预后有关。     

Caveolin-1在肝细胞癌表达及与肿瘤血管生成的关系

目的：探讨caveolin-1与肝细胞癌（HCC）侵袭转移的关系及其可能的机制。方法：应用实时PCR方法检测伴肝内转移的 HCC组织、癌旁组织、肝硬化组织、正常肝组织中 caveolin-1 mRNA的表达;用Western blot方法检测伴肝内转移的 HCC组织、癌旁组织中caveolin-1蛋白的表达;用免疫组化方法检测75例HCC组织中caveolin-1,血管内皮生长因子（VEGF）,CD34,α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达,分析caveolin-1,VEGF的表达以及肿瘤微血管密度（MVD）,非成对动脉（UA）计数与临床病理因素的关系。结果：在伴肝内转移的HCC组织中,caveolin-1 mRNA表达明显高于癌旁组织、肝硬化组织、正常肝组织（均P<0.05）,其蛋白表达明显高于癌旁组织;caveolin-1表达水平的升高与肿瘤转移有关（P<0.05）,且caveolin-1的表达与VEGF表达及MVD和UA计数呈正相关（r=0.293,P=0.011;r=0.361,P=0.001;r=0.388,P=0.001）。结论：caveolin-1表达升高促进HCC的侵袭转移,其机制可能是通过诱导HCC表达VEGF,促进肿瘤新生血管生成而实现的。     

转录调节因子Ets-1在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

目的　研究转录调节因子Ets 1在结直肠癌组织中的表达规律与特点 ,探讨其与肿瘤血管生成和肿瘤侵犯、转移等肿瘤进展的生物学行为的关系。方法　取我院从 2 0 0 1年 9月至 2 0 0 2年 11月间住院手术切除的结直肠癌标本 4 0例 ,同时取 5例正常结直肠组织和 3例结直肠息肉作对照。采用免疫组化技术链霉素抗生物素蛋白 过氧化物酶连接法 (S P法 ) ,检测转录调节因子Ets 1和CD34在它们中的表达特性 ,并结合临床病理参数进行综合分析。结果　正常结直肠组织和结直肠息肉几乎不表达Ets 1,结直肠癌细胞高表达Ets 1;4 0例结直肠癌组织中 ,Ets 1阳性表达及MVD均值显著高于正常结直肠组织和结直肠息肉 ,P <0 .0 1;Ets 1阳性表达组MVD值明显高于阴性组 ,P <0 .0 5 ;Ets 1、CD34在淋巴结转移组、肝转移组、Dukes分期的C期和D期的表达分别显著高于无淋巴结转移组、无肝转移组、Dukes分期的A期和B期 ,P <0 .0 1。结论　 (1)Ets 1促进结直肠癌血管生成 ,并参与肿瘤浸润和淋巴道转移 ,与肝转移有关 ,可作为监测结直肠癌预后的重要指标 ;(2 )检测Ets 1的表达 ,可作为判定结直肠癌血管形成、浸润转移等生物学行为的重要指标。     

CCL3L1融合蛋白的表达纯化及其多克隆抗体的制备

目的 表达和纯化CCL3L1融合蛋白,并对其免疫原性进行分析.方法 应用分子生物学技术将pGEX-4T-1-CCL3L1质粒进行酶切,收集CCL3L1片段与pET-32a(+)表达载体连接,构建pET-32a(+)-CCL3L1重组质粒,将其转化BL-21大肠埃希菌进行蛋白表达并纯化.应用酶切鉴定、SDS-PAGE及Western blot等方法确保基因片段的正确性及表达蛋白的特异性.以间接ELISA法测定BABL/c小鼠多克隆抗体滴度.结果 成功获得了高纯度的CCL3L1融合蛋白,且该蛋白为可溶性表达,以其制备的多克隆抗体滴度最高可达1:51 200.结论 获得高纯度可溶性表达的CCL3L1融合蛋白及其高效价的多克隆抗体.     

MMP-1、TIMP-1及PDGF在病理性瘢痕中的表达

目的研究基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)、血小板源性生长因子(PDGF)在病理性瘢痕中的表达及意义。方法对58例病理性瘢痕手术切除标本采用免疫组化方法。结果MMP-1、TIMP-1、PDGF在病理性瘢痕中呈阳性表达(62.07%,63.71%,55.17%),在正常皮肤与普通瘢痕中几乎无阳性表达,病理性瘢痕组与两对照组差异均有显著意义(P<0.05)。病理性瘢痕中TIMP-1与PDGF呈正相关(r=0.331,P<0.05)。结论TIMP-1、PDGF促进病理性瘢痕形成;在病理性瘢痕形成过程中PDGF可促进TIMP-1的表达;病理性瘢痕的形成与MMP-1、TIMP-1、PDGF相互作用失衡有关。