三个常染色体隐性遗传性青少年型帕金森综合征家系的基因型与表型分析

目的探讨常染色体隐性遗传性青少年型帕金森综合征(autosomal recessive juvenile parkinson-ism,AR-JP)parkin基因的突变及临床特征。方法应用聚合酶链反应、DNA测序和限制性核酸内切酶酶切等技术对15个AR-JP家系先证者的parkin基因进行突变研究。结果发现3个家系有parkin基因的突变,其中2个家系含parkin基因的杂合缺失突变,分别为第2外显子的202-203delAG及第9外显子的1069-1074delGTGTCC;另一家系发现一个杂合点突变,为第12外显子的1422(T→C)。其中1069-1074delGTGTCC和1422(T→C)为新的突变。3个家系共6名患者,发病年龄18~31岁,平均25.2±5.7岁;病情进展慢,腱反射活跃或亢进、症状波动常见;对小剂量多巴制剂反应良好。结论我国的AR-JP家系存在parkin基因的突变;含parkin基因突变的AR-JP患者有帕金森病的一般临床表现,又有其独特的临床特征。     

E-选择素基因第2外显子G98T单核苷酸多态性的调查

目的 :研究湖北地区汉族人群E 选择素 (E selectin)基因第 2外显子 98位点的单核苷酸多态性 (SNP) ,比较种族间单核苷酸的基因频率分布差异。方法 :应用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性(PCR RFLP)的分析方法 ,检测了 2 40名健康者E selectin第 2外显子 98位点单核苷酸的基因型。结果 :E selectin各基因型频率GG型91.3 % ,GT型 8.7% ;G ,T各等位基因频率分别为 95 .6% ,4.4% ,这种基因多态性分布在男女间均无显著性差异 (P >0 .0 5 )。与其它种族比较 ,发现不同种族间E selectin基因型分布及等位基因频率均存在显著差异 (P <0 .0 5 )。结论 :在湖北地区汉族人群中存在E se lectin基因第 2外显子 98位点的单核苷酸多态性 ,这种多态性在种族间可能存在着较大的差异     

CPT-Ⅱ基因4号外显子质粒构建与变异分析

背景：肉毒碱棕榈酰转移酶Ⅱ(Carnitine palmitoyltransferase-Ⅱ, CPT-Ⅱ)位于细胞线粒体内膜上,是脂肪酸氧化过程中起关键作用的酶之一。目前关于流感病毒感染与CPT-Ⅱ基因变异尚未见报道。 目的：构建CPT-Ⅱ第4号外显子(E4)表达质粒及其核苷酸变异分析。 方法：从流感病毒感染2例患者外周血中提取DNA,以PCR法扩增CPT-Ⅱ基因的第4号外显子,将其片段插入pGEM-T载体,以T4 DNA连接酶,构建T-CPT-Ⅱ E4,转化大肠杆菌DH5α细胞,增菌,制备质粒,EcoR I酶切、测序和变异分析。 结果与结论：成功构建重组表达质粒pGEM-T-CPT-ⅡE4,经DNA测序,证实质粒中插入CPT-Ⅱ第4号外显子完整序列,全长1 305个核苷酸,编码435个氨基酸;与Genebank源序列对照比较,发现含有两个变异位点：1 618(GTC→ATC)和1 858 (TTT→TCT),对应氨基酸为V368I和F448L。     

EGFR基因19外显子del18bp突变检测技术平台的构建及优化

目的构建高保真酶介导的EGFR基因19外显子del18bp的突变敏感性分子开关检测平台,并对其进行优化。方法以健康人全血基因组DNA为模板,利用普通PCR与重叠PCR技术扩增分别得到包含EGFR基因19外显子del18bp的野生型和突变型DNA片段,并将其插入pMD19-T质粒,转化大肠埃希菌E.coli DH5α,通过菌液PCR及基因组测序进行鉴定。设计EGFR基因19外显子del18bp突变型特异性检测引物,并在3′端进行硫化修饰;用高保真聚合酶进行双向引物延伸。通过正交实验方案对高保真酶介导的PCR体系中的退火温度、引物浓度、模板浓度、循环数等条件进行优化,建立突变敏感性分子开关检测平台。结果成功建立了EGFR基因19外显子del18bp突变检测技术平台。分子开关技术检测EGFR基因19外显子del18bp突变位点的最佳PCR条件为:模板浓度1.48×10~(-2)μmol/L,引物浓度0.16μmol/L,退火温度57℃,循环数25;对突变模板的最低检出率为10~(-3)copies/μL。结论高保真聚合酶偶联硫化修饰构成的突变敏感性分子开关技术可望为肺癌患者实施EGFR基因突变检测,进行个体化靶向用药提供新的技术手段。     

一个近亲婚配家系中的一种P基因新突变

目的在DNA水平上对1个有2例患者的姨表兄妹近亲婚配家系中的眼皮肤白化病患者进行分型诊断。方法用PCR扩增先证者P基因及TYR基因各外显子、外显子-内含子交界区及3＇端和5＇端非翻译区，以DNA序列测定技术检测基因突变，以DNA测序技术和限制性内切酶酶切法检测该家系其他成员及群体中正常人的相应基因位点。结果先证者和其白化病妹妹为P基因A787T突变纯合子，其父母和表型正常的弟弟均为A787T突变杂合子。先证者TYR基因未见突变。群体中102名表型正常者中无A787T突变等位基因。结论在基因水平确定我国存在眼皮肤白化病Ⅱ型，同时发现了一种P基因病理性新突变。     

三例眼皮肤白化病患者TYR和P基因的突变分析

目的 分析眼皮肤白化病(oculocutaneom albinism,OCA)患者酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)基因和P基因的基因突变.方法 应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction ,PCR)和变性高效液相色谱(de-naturing high-perfomanee liquia chromatography,DHPLC)技术对3例患者的眼皮肤白化病Ⅰ、Ⅱ型相关基因(TYR和P基因)的外显子进行突变检测,并对DHPLC检出的突变样本进行测序和限制性内切酶分析以验证该突变.针对未见报道的新突变,筛查100名表型正常的无关个体,排除多态的可能.结果 在3例患者中检测出两种P基因突变,未检测到TYR基因突变.其中,患者1的P基因第13外显子发生杂合突变T450M;患者2的P基因发生两个杂合突变,分别是第13外显子T450M和第23外显子G775R;患者3的P基因第23外显子发生杂合突变G775R.P基因第13外显子限制性内切酶分析显示,患者1、2均出现杂合突变T450M导致的Oli I酶切位点部分消失,100名表型正常的无关个体未检出该突变;经检索,T450M为一未见报道的新突变.结论 联合应用PCR、DHPLC、DNA测序和限制性内切酶分析的方法可有效的对白化病进行基因诊断.     

视网膜色素变性隐性遗传致病基因PDE6B的突变分析

目的 了解常染色体隐性遗传视网膜色素变性(autosomal recessive retinitis pigmentosa，ARRP)致病基因磷酸二酯酶β亚单位(phosphodiesterase β subunit,PDE6B)基因在中国视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)患者中的突变谱及突变率。方法 应用聚合酶链反应—单链构象多态性，对收集的35个常染色体隐性RP家系38例患者和55例散发RP患者进行PDE6B基因的22个外显子和5’端非翻译区突变筛选；对有变异条带者进行DNA序列分析。结果 测得一个常染色体隐性家系患者PDE6B基因第11外显子5’端上游第19位碱基(第10内含子内)发生G→A转换。1例散发RP患者同时检测到第6外显子第2492位点碱基T颠换为C和第10外显子5’端上游(第9内含子内)第27—28碱基之间有两个碱基TG插入。另两例散发RP患者分别发现第4外显子5’端上游30—31碱基处两个碱基GT插入和第18外显子3’端下游第15个碱基发生G→C颠换。结论 发现1名中国人的散发RP患者携带RP致病基因PDE6B基因的一种复合杂合突变。中国人的PDE6B基因内含子有多种变异。     

两个新RUNX2基因突变引起家族性锁骨颅骨发育不全

目的 探讨RUNX2基因突变在锁骨颅骨发育不全病因研究中的意义及两个中国家族性锁骨颅骨发育不全家系发病的分子机制.方法 提取收集到的2个锁骨颅骨发育不全家系中4例患者和4名家系健康成员、102名无关正常对照外周血基因组DNA,应用PCR扩增产物双向直接测序方法 检测RUNX2基因第1～7外显子及相邻侧翼区的DNA序列,测序结果 与RUNX2基因正常序列对比分析.对发现的突变位点用酶切方法 证实.结果 测序结果 发现一家系中两例父子患者的RUNX2基因第1外显子发生错义突变c.346T＞A(W116R),该错义突变通过Bsr Ⅰ限制性内切酶对PCR扩增产物行酶切分析得到进一步确认.另一家系中两例患者的RUNX2基因第3外显子发生无义突变c.610A＞T(K204X).在两个家系中的正常家系成员和无关正常对照RUNX2基因DNA序列中没有发现上述突变.结论 通过RUNX2基因,检测在中国人群中发现两个RUNX2基因新致病突变,扩展了遗传性锁骨颅骨发育不全的基因突变谱,对阐明该病发病机制及其基因诊断和遗传咨询有重要意义.     

一个脂蛋白肾小球病家系中apoE基因的九个碱基缺失

目的 分析1个脂蛋白肾小球病家系的载脂蛋白E(apolipoprotein E,apoE)基因突变.方法 用盐析法提取该家系4名成员和2名正常人的外周血基因组DNA,PCR扩增apoE基因第4外显子、第3外显子以及多态性片段,扩增产物纯化后分别构建到pTA2载体中,克隆载体转化至大肠杆菌DH5α感受态中,经蓝白斑和抗菌素筛选后集菌,提取重组子质粒,EcoRⅠ酶切鉴定是否转化成功,鉴定正确的菌液行双向测序.PCR-限制性片段长度多态性检测apoE基因多态性.结果 家系中先证者及其母亲和姐姐apoE基因第4外显子第484～492位9个碱基(CAAGCTGCG)缺失,为杂合缺失,其导致apoE氨基酸序列第143～145位KLR的3个氨基酸缺失.第3外显子测序未发现异常.apoE基因多态性分析结果与测序结果一致.结论 该家系的脂蛋白肾小球病因可能为apoE基因第484～492位9个碱基(CAAGCTGCG)缺失.     

G蛋白β3基因多态性与人类疾病

人类G蛋白β3亚单位基因(GNB3)位于染色体12p13,长约7.5kb,由11个外显子和10个内含子组成(编码蛋白区涉及其中9个外显子)。在GNB3基因整个序列中,存在多个多态性位点,包括A(-350)G、A(657)T、G(814)A、C(825)T、C(1429)T等。其中     

酒精代谢酶与酒精性肝病的关系研究进展

体内参与乙醇代谢的酶主要有乙醇脱氢酶 (ADH)、细胞色素P45 0 2E1(CYP2E1)和过氧化物酶 ,前两者均存在基因多态性。代谢酶的基因多态性与酒精性肝病有密切关系。     

肝硬变患者内分泌激素与HBVX基因相关性的初步探讨

研究表明,HBVX基因在HBV全基因中有三个直接重复顺宇和两个反转重复顺序共五对保守的重复顺序,表明Ⅹ基因在HBV基因中占有很重要的地位;HBVX基因已成为研究的热点。但是,在评价HBVX基因的生物学作用时,应综合考虑机体激素-内分泌网络的整体效应,本文将分析肝硬变患者血清睾酮(T)、雌二醇(E2)、生长激素(HGH)、泌乳素(PRL)及HBVX的相关性,初步探讨肝硬变形成中乙型肝炎病毒感染、内分泌激素的综合作用。     

非小细胞肺癌患者肿瘤组织中EGFR和KARS基因突变的分子病理检测分析

目的：探讨非小细胞肺癌患者肿瘤组织中EGFR和KRAS基因各亚型突变情况。方法：应用直接测序方法检测非小细胞肺癌石蜡组织中1273例EGFR基因和1062例KRAS基因突变情况。结果：非小细胞肺癌肿瘤组织中EGFR基因总突变率为36.68%(467/1273),外显子18、19、20和21的突变率分别为1.02%(13/1273)、18.93%(241/1273)、2.59%(33/1273)和15.95%(203/1273);EGFR基因各外显子之间双重突变共17例(1.34%),其中18外显子与20外显子双重突变3例(0.24%),19外显子与20外显子双重突变7例(0.55%),19外显子与21外显子双重突变4例(0.31%)和20外显子与21外显子双重突变3例(0.24%);EGFR基因各外显子内双重突变共2例(2.18%),均为21外显子双重突变。KRAS基因总突变率为3.01%(32/1062),外显子2的密码子5、12、13和25的突变率分别为0.09%(1/1062)、2.64%(28/1062)、0.18%(2/1062)和0.09%(1/1062),外显子3密码子61的突变率为0.09%(1/1062)。结论：非小细胞肺癌患者中EGFR基因存在较高的突变率,尤其为19和21外显子突变,其基因突变亚型分类能指导EGFR-TKI的肿瘤靶向治疗,KRAS基因突变率虽低但不容忽视,其基因突变预示着EGFR-TKI原发耐药。     

广西壮族与汉族人群E-选择素基因的遗传多态性

目的研究E-选择素(E-selectin)基因第2外显子G98T和第4外显子S128R遗传多态性在广西壮、汉两民族中的分布。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性和DNA序列测定法检测162名壮族人和170名汉族人E-选择素基因第2外显子G98T和第4外显子S128R遗传多态性,比较两组E-选择素基因型和等位基因的分布频率。结果E-选择素基因第2外显子等位基因G、T频率在壮族与汉族正常人群中分别为94.8%、5.2%和95.3%、4.7%;第4外显子等位基因S、R频率分别为92.0%、8.0%和95.9%、4.1%(χ2=4.482,P=0.034)。结论E-选择素基因S128R多态性在广西壮、汉两民族中差异有显著性;E-选择素基因G98T多态性在广西壮、汉两民族中差异无显著性。     

老年消化性溃疡患者性激素水平的变化

目的:探讨血清睾酮(T)、雌二醇(E2)、皮质醇(Cor)的含量在老年消化性溃疡病程中的变化。方法:用微粒子化学发光免疫分析法分别检测86例老年消化性溃疡活动期、愈合期及78例健康老年人的血清T、E2、Cor的水平。结果:老年消化性溃疡患者活动期血清T、E2比溃疡愈合期和健康老年人明显降低(P<0.01),Cor含量无明显差异(P>0.05)。结论:血清T、E2的浓度变化对老年消化性溃疡的病程和疗效判断有指导意义。     

遗传性出血性毛细血管扩张症基因突变分析

目的 分析遗传性出血性毛细血管扩张症(hereditary hemorrhagic telangiectasia,HHT)家系ENG、ACVEL1和SMAD4基因突变.方法 收集4个HHT家系临床资料并分析其临床特点,应用直接测序和多重连接探针扩增技术对11例临床确诊及可疑患者的ENG、ACVRL1和SMAD4基因进行突变分析,将结果与HHT基因突变数据库进行对比.结果 家系2先证者及2个妹妹的ENG基因发生了第2外显子c.207G＞A(p.L69L)同义突变、第8外显子c.1004A＞T(p.Q335L)错义突变、ACVRL1基因第7外显子c.817C＞T(L273L)同义突变;家系3先证者及其母亲和弟的ENG基因发生了第8外显子c.1004A＞T(p.Q335L)突变;也检测到家系4先证者及其兄的ENG基因第8外显子c.1004A＞T(p.Q335L)突变.家系1先证者及其他HHT患者,未检测到基因突变.其中ENG基因第8外显子c.1004A＞ T(p.335Q＞L)为新突变,在200名正常对照中也未检测到该突变.结论 HHT具有遗传异质性,ENG基因第8外显子c.1004A＞T(p.Q335L)为HHT新的致病突变.     

中国汉族人ATM基因的单核苷酸多态与点突变

目的研究中国汉族人共济失调性毛细血管扩张症(ataxiatelangiectasiamutated,ATM)基因的单核苷酸多态和点突变。方法首先用PCR扩增ATM基因第39、61和63外显子的靶片段,然后用单链构象多态性(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)技术进行筛选,选择典型带型经全自动DNA测序证实。结果在ATM基因第39外显子以及第61和63内含子发现6个新的单核苷酸多态,它们分别是第39外显子第5689位和第5691位的A/T多态,第61内含子第 69位的T/G多态、第 94位的A/G多态和第 99位的T/G多态,第63内含子第 17位的G/C多态。在ATM基因第61外显子、第62内含子和第63外显子发现5个新的点突变,它们分别是第61外显子第8618位的T/G颠换、第62内含子第-13位的T/G颠换、第63外显子第8793位的T/G颠换、第8816位和第8848位的G/A转换。证实了ATM基因第39外显子第5557位G/A、第61内含子第 104位T/C和第62内含子第-55位T/C多态在中国汉族人中的存在。结论中国汉族人ATM基因的单核苷酸多态与白人存在较大差异。     

Analysis of CDH1 gene expression in hereditary diffuse gastric cancer

目的 研究在遗传性弥漫型胃癌家系中是否存在上皮型钙黏素基因(CDH1)以及基因表达的异常.方法 收集符合遗传性弥漫型胃癌(HDGC)诊断标准的1个家系中15例成员的外周血和组织标本.用免疫组化和Westernblot法检测组织CDH1蛋白表达;提取基因组DNA,通过PCR扩增DNA直接测序检测CDH1基因16个外显子突变.用克隆测序法,鉴定CDH1基因启动子区CpG位点甲基化状况.结果 先证者和另一胃癌患者(家系2号成员)的癌旁胃黏膜上皮细胞CDH1蛋白表达较正常胃黏膜减弱,两者肿瘤组织的蛋白表达几乎为阴性.包括先证者在内的11例家系成员第14外显子mRNA水平2 377位点存在一个C→T的单核苷酸多态性(SNP),但未检测到16个外显子的胚系突变.相对于正常胃黏膜,先证者和家系2号成员的胃癌组织均有CDH1基因启动子的高甲基化,其瘤旁黏膜也有高甲基化.结论 此HDGC家系中,CDH1基因外显子胚系突变不是其致病原因,基因启动子区的甲基化可能是导致基因失活的原因之一.     

山西汉族遗传性多发性骨软骨瘤家系EXT1及EXT2基因突变研究

目的 对山西一个汉族遗传性多发性骨软骨瘤家系的EXT1和EXT2基因的全部外显子序列进行分析,以寻找致病突变.方法 用PCR扩增先证者EXT1和EXT2基因的全部外显子,将PCR产物送直接测序分析.结果 发现EXT1基因2种同义突变(P477P、E587E)、3种内含子突变(c.1537-48A＞G、c.1721 +203 A＞G、c.1722-103 C＞G).EXT2基因共发现5种内含子突变(c.-29-148 A＞T、c.1080-18 T＞A、c.1336-93 C＞T、c.1526-166 C＞T、c.1526-195C＞T).其中,EXT1 P477P、EXT1 E587E和EXT2 c.1080-18 T＞A为多发性骨软骨瘤突变数据库已收录的多态位点,其余7个位点尚未见报道.结论 对该家系EXT1、EXT2基因全部外显子的测序分析未发现明确的致病突变,该家系遗传性多发性骨软骨瘤的发生是否由除EXT1、EXT2外的其它EXT相关基因引起尚需进一步的连锁定位分析.     

广西壮族人群ICAM-1基因多态性及血清水平与脑梗死关系的研究

探讨细胞间黏附分子1(ICAM-1)基因K469E多态性各等位基因及基因型在广西壮族脑梗死患者中的分布频率,初步分析其基因及血清水平与脑梗死的关系。采用聚合酶连反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)和DNA序列测定法检测19例脑梗死及210例对照者ICAM-1基因第6外显子K469E多态性,同时采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测脑梗死和对照者血清ICAM-1水平。脑梗死组ICAM-1血清水平显著高于对照组(P<0.01),ICAM-1基因K469E基因频率和等位基因频率在脑梗死组和对照组比较差异有显著性(P<0.05),等位基因频率的相对风险分析发现,E等位基因携带者患脑梗死的风险是K等位基因的1.454倍(OR=1.454,95%CI1.090～1.940),携带E等位基因的脑梗死患者ICAM-1血清水平显著高于不携带者(503.31±141.32)ng/ml和(489.80±122.43)ng/ml,(P<0.01)。ICAM-1基因K469E多态性与脑梗死的发病具有相关性,E等位基因可能是广西地区壮族人脑梗死发病的遗传易感基因,携带E等位基因的个体可能通过促进ICAM-1的高度表达进而增加脑梗死的发病风险。