恒河猴外周血pDC1/pDC2的形态学研究

目的 研究恒河猴外周血pDC1和pDC2的形态学特征。方法 采集健康、SIV阴性的恒河猴外周血，用Ficoll—Hypaque梯度离心法提取外周血单核细胞(PBMC)。利用与恒河猴有交叉反应的人单克隆抗体以及三色流式细胞仪分离pDC1和pDC2。新鲜分离和经CD40L培养的pDC1进行形态学观察。新鲜分离和经CD40L、rhIL—3和rhGM—CSF培养的pDC2进行形态学观察。结果 恒河猴外周血树突状细胞(DC)具有较大不规则偏心的细胞核，其细胞表面有大量典型的树突状突起。结论 本研究为pDC1和pDC2作为抗原递呈细胞(APC)在排斥反应中的免疫调整功能奠定基础。     

恒河猴外周血pDC1/pDC2的分离和细胞表现型的研究

目的 研究恒河猴外周血树突状细胞（DC）的亚群pDC1和pDC2的分离方法。并探讨其细胞表现型。方法 采集健康，SIV阴性的恒河猴外周血，用Ficoll-Hypaque梯度离心法提取外周血单核细胞（PBMC），利用与恒河猴有交叉反应的人单克隆抗体以及三色流式细胞仪分离pDC1和pDC2，并对其进行细胞表现型的鉴定。结果 首次分离出恒河猴pDC1和pDC2细胞；并保持其活性。pDC1细胞表现型为Lineage^-,HLA-DR^ 和BDCA1^ ;pDC2的细胞表现型为Lineage^-,HLA-DR^ 和IL-3Rα^ 。结论 成功分离和鉴定了与人相似的恒河猴pDC1和pDC2细胞，对今后异种移植排斥反应的研究具有一定的意义。     

阻断B7-H1通路增强膀胱癌患者外周血树突状细胞免疫功能的实验研究

目的:探讨膀胱癌患者外周血与正常人外周血树突状细胞(DCs)免疫功能的差异以及B7-H1阻断对膀胱癌患者外周血DCs免疫功能的影响。方法:采集膀胱癌患者及正常人的外周血,用rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-α自外周血单个核细胞(PBMC)诱导分离DCs,混合淋巴细胞反应检测DCs刺激淋巴细胞增殖的能力。然后于膀胱癌DCs组加入B7-H1的阻断型抗体,混合淋巴细胞反应检测B7-H1阻断后DCs刺激淋巴细胞增殖的能力,ELISA法检测阻断后DCs分泌IL-10和IL-12的水平。结果:膀胱癌患者外周血DCs刺激淋巴细胞增殖的能力低于正常人外周血DCs,而加入B7-H1阻断型抗体阻断B7-H1后,膀胱癌患者外周血DCs刺激淋巴细胞增殖的能力得到明显提高,同时其分泌IL-10水平明显降低,而分泌IL-12水平明显增加。结论:膀胱癌患者外周血DCs存在免疫功能缺陷,其机制可能与DCs表面B7-H1的诱导高表达有关,而B7-H1阻断能够增强膀胱癌患者外周血DCs的免疫功能。     

树突状细胞疫苗诱导免疫效应细胞对PC3生长的抑制作用

耳的体内外观察多种细胞因子及肿瘤相关抗原（TAA）体外培养的树突状细胞（DC）诱导免疫效应细胞对PC3的抑制。方法用淋巴细胞分离液分离抗凝新鲜全血以获得单核细胞（PBMC），用贴壁法获取DC和去DC的单核细胞（免疫效应细胞），并分别用粒／巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、人白细胞介素（IL）-4、肿瘤坏死因子（TNF）-α、PC3肿瘤相关抗原（PC3TAA）和人白介素2（IL-2）培养正常人DC和免疫效应细胞，5．6d后将DC和免疫效应细胞混合培养1-2d。观察DC，免疫效应细胞生长状况。酶法检测DC诱导免疫效应细胞对PC3的毒性作用。体内观察DC诱导免疫效应细胞和DC培养上清液对裸鼠PC3移植瘤的生长抑制作用。结果体外多种细胞因子和肿瘤相关抗原能有效引起DC增殖。DC疫苗诱导免疫效应细胞对PC3的最大杀伤效率为62．4％。体内实验见：阴性对照组Ⅰ，单纯细胞治疗组Ⅲ及其联合培养上清液治疗组Ⅳ裸鼠均于第12天发生移植瘤；预防治疗组Ⅱ，观察30d时，6例只有2例发生移植瘤；于移植瘤产生后的第45天处死所有裸鼠并称瘤体的重量，各组比较差异有统计学意义（P〈0．05），两两比较。组Ⅰ分别与组Ⅱ、Ⅲ比较差异有统计学意义（P〈0．001），组Ⅰ与组Ⅳ、组Ⅱ与组Ⅲ比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论DC疫苗在抗恶性肿瘤中有重要作用。     

转染肿瘤mRNA的树突状细胞疫苗诱导抗肝癌免疫研究

目的探讨转染原发性肝癌(HCC)mRNA的树突状细胞(DC)能否诱导抗肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。方法采用HCC患者外周血单核细胞(PBMC)体外刺激分化为DC细胞；从人肝癌HepG-2细胞和3例HCC患者的肝癌组织中体外扩增mRNA。以mRNA转染DC细胞，并与PBMC混合培养诱导扩增CTL。流式细胞计数仪检测培养细胞中CD3^ 、CD4^ 、CD8^ 细胞的比例。^51Cr释放法测定CTL的杀瘤活性。结果经扩增人肝癌HepG-2mRNA和2例AFP( )患者的AFP( )HCCmRNA诱导3周后，CD3^ 、CD8^ 细胞占淋巴细胞总数由诱导前的27．8％、26．5％、29．6％升高至89．3％、73．6％、86．8％；而经扩增AFP(-)HCCmRNA诱导3周后，CD3^ 、CD8^ 细胞占淋巴细胞总数由诱导前的25．4％升高至53．6％。转染HepG-2细胞和AFP( )的患者HCCmRNA的DC诱导的CTL对HepG-2细胞杀瘤活性明显高于AFP(-)的患者，其杀瘤特性由MHC-I限制的CD8^ T细胞所介导。结论HCCmRNA体外转染DC能诱导肿瘤特异性CTL，可为肝癌的免疫治疗提供新的有效手段。     

磁转染MUC1/Y基因入树突状细胞抗膀胱肿瘤的免疫效应研究

目的：研究体外磁转染人MUC1/Y基因至人树突状细胞（DC）的可行性,以及在体外诱导特异忡抗MUC1／Y膀胱癌的免疫效应。方法：以葡聚糖磁性纳米颗粒（DMN）作为载体,在多聚赖氨酸（PLL）的辅助下,通过静电作用结合MUC1／Y基因的真核表达载体pEGFP-C1—MUC1／Y．在铜-硼-锡磁块的固定磁场作用下转染至人DC中,荧光显做镜下以及流式细胞仪观察其转染效率;再将这种转基因DC与自体T细胞共培养,观察其致敏的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对MUC1／Y特异性抗膀胱癌（膀胱肿瘤BIU87细胞系）的杀伤活性,即分别用LDH释放法检测CTL杀伤活性和透射电镜观察CTL诱导靶细胞凋亡情况：ELISA法测定基冈修饰后的DC刺激自体T细胞分泌IFN-γ了的能力。结果：pEGFP-C1／-MUC1／Y转染效率为15％左右,荧光显微镜下可观察到明显绿色荧光蛋白的表达;与自体T细胞混合培养后能诱导出湿著的MUC1/Y特异性的CTL对BIU87细胞的杀伤实验表明T-DC-MUC1的杀伤活性约为52％,显著高于埘照组T-DC诱导的CTL;住透射电镜下也可以清楚的观察到部分BIU87膀胱肿瘤细胞出现了细胞核核仁消失,染色质浓集于核膜周围等早期凋亡表现;基因修饰后的DC能刺激自体T细胞分泌高水平的IFN-γ,与未转染的DC相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：葡聚糖磁性纳米颗粒（DMN）在固定磁场的作用下成功将MUC1/Y基因转入DC,并可有效诱导出特异性的抗MUC1/Y膀胱癌的免疫效应。     

尿胞外体1型辅助性T细胞/2型辅助性T细胞失衡与2型糖尿病肾病的相关性

目的 探讨2型糖尿病（DM）患者尿胞外体1型辅助性T细胞/2型辅助性T细胞（Th1/Th2）的变化与2型糖尿病肾病（DN）发生发展的相关性。 方法 选取120例2型糖尿病患者及健康对照组30例为对象,根据尿白蛋白肌酐比（UACR）,2型糖尿病患者分为糖尿病非肾病组（DM,40例,UACR<30 mg/gCr）、微量白蛋白尿组（DN1,50例,UACR≥30~300 mg/gCr）和临床白蛋白尿组（DN2,30例,UACR＞300 mg/gCr）。用特异性单克隆抗体提纯尿胞外体。用酶联免疫吸附法（ELISA）检测尿胞外体干扰素γ（IFN-γ）和白细胞介素4（IL-4）水平。用多元逐步回归方法分析尿胞外体IFN-γ/IL-4比值与糖化血红蛋白（HbA1c）、胆固醇（CH）、UACR、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）相关性。 结果 DM、DN1、DN2组胞外体Th1/Th2水平显著高于健康对照组（0.8089±0.2458、0.8993±0.3515、0.8571±0.2470比 0.6198±0.1769,均P < 0.01）。DN1组胞外体Th1/Th2显著高于DM组（P < 0.01）。尿胞外体IFN-γ/IL-4与UACR（r = 0.213,P = 0.015）、BUN（r=0.292,P = 0.001）呈正相关。逐步多元回归分析显示, BUN是尿胞外体IFN-γ/IL-4的独立影响因素（β = 0.246,P = 0.006）。 结论 尿胞外体Th1/Th2漂移与2型糖尿病肾病密切相关,可能在糖尿病早期肾病发病过程中起重要的作用。     

NOD小鼠未成熟树突状细胞体外诱导淋巴细胞生成并扩增调节性T细胞的研究

目的 探索非肥胖糖尿病(non-obese diabetic,NOD)小鼠未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,imDC)诱导并扩增调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的优化方案.方法 分离、培养NOD小鼠骨髓来源的imDC和淋巴细胞,并进行混合淋巴细胞培养,分别加...     

输异体血胃癌根治术病人外周血Th1/Th2细胞亚群的变化

输血引起免疫抑制的原因尚不十分清楚。CD4^ T细胞和CD8^ T细胞的比值对机体免疫平衡的维持极为重要，其中CD4^T细胞中Th1和Th2细胞亚群的变化又起着主要作用。因此，本研究旨在观察胃癌根治术病人输异体血后外周血Th1，Th2细胞亚群的变化，以探讨输异体血后免疫抑制的部分原因，为临床输血提供参考。     

树突状细胞与尤文肉瘤细胞融合诱导抗肿瘤免疫应答的体外研究

目的检测尤文肉瘤细胞A673和树突细胞(DC)融合构建的肿瘤疫苗对尤文肉瘤细胞株A673的杀伤作用。方法应用促融合剂PEG对尤文肉瘤A673细胞和从外周血单个核细胞(PBMC)诱生的树突细胞进行融合。利用细胞因子hGMCSF和hIL4从PBMC诱生DC,并对其表型进行流式细胞仪(FCM)分析,红色荧光染料PKH26标记A673细胞,绿色荧光染料PKH67标记DC,应用促融合剂PEG融合后光镜及电镜观察DC细胞和融合细胞形态,FCM检测融合效率,通过同种混合淋巴细胞反应检测其免疫刺激活性。通过IFNγELISA法产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的量,通过51Cr细胞杀伤试验检测融合细胞对A673细胞的杀伤作用。结果FCM检测出从PBMC成功诱生出CD83、CD80、CD86及HLADR高表达的成熟DC。DCs/A673融合细胞的融合效率达到23%,同种混合淋巴细胞反应显示DCs/A673融合细胞有很强的免疫刺激活性。IFNγ分泌检测显示DCs/A673融合细胞组较对照组产生CTL水平显著增高。51Cr释放法检测融合细胞体外诱导抗原特异的CTL,融合细胞激活的CTL对肿瘤细胞系A673细胞的杀伤作用强于DCA673混合组、DC组、A673组的CTL(P<0.05),作用较对照各组显著增强。结论DC与A673细胞融合体外致敏自体T淋巴细胞能生成抗原特异CTL对尤文肉瘤细胞A673有一定的杀伤作用。     

串联铜珠394和Tcu_220宫内节育器的恒河猴研究

应用宫内节育器（ＩＵＤ）串联铜珠３９４和ＴＣＵ２２０对恒河猴进行临床前比较研究。结果表明两组置ＩＵＤ动物除１例外均呈现有排卵的周期性变化，妊娠率和脱落率为０，月经改变表现为周期不规则、经期延长、经量增多，随置器时间延长逐渐好转。置串联铜珠３９４１１个月后的动物血清铁蛋白水平有所下降（Ｐ＜０．０５），两种ＩＵＤ在宫腔内释放ＣＵ２＋无明显差异（Ｐ＞０．０５）。     

猕猴异体子宫移植技术的应用研究

目的探讨猕猴异体子宫移植活体捐赠手术技巧应用,为下一步人体子宫移植临床试验提供实验数据。方法选用性成熟、月经规律的雌性猕猴2只,根据血型和体重选取供体1例和受体1例,将切除的供体子宫及髂血管给予器官保存液冷保存、灌注后原位移植到受体盆腔,供体的髂内动脉、髂外静脉与受体的髂外动、静脉使用端-侧吻合法间断吻合,术中根据移植血管的搏动、子宫的色泽判断移植是否成功,术后给予他克莫司、环孢霉素、泼尼松三联免疫抑制剂预防移植免疫排斥。结果受体猕猴移植双侧髂血管吻合成功,可触及移植血管搏动,移植子宫恢复血流灌注后子宫颜色由灰白逐渐转为暗红。受体动物于子宫移植术后28d死亡,评估死亡原因可能为慢性衰竭。结论猕猴是适用于异体子宫移植研究的大型动物模型,使用髂内动脉与受体的髂外动脉进行端-侧吻合法吻合是可行的,三联免疫抑制剂可有效预防移植免疫排斥。     

血管内介入方法制作偏侧帕金森病猴模型

目的 探讨血管内介入方法制作偏侧帕金森病(PD)猴模型的稳定技术和方法,评价其有效性及实用性.方法 4只健康老年恒河猴,经右股动脉插管至颈内动脉注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP),剂量为1.0 ～ 1.2 mg/kg,药物浓度为0.2g/L.术后2周进行运动功能评分,行阿扑吗啡诱转试验,10周后采用免疫组织化学方法检测中脑多巴胺能神经元变化.结果 4只恒河猴制作模型成功.免疫组织化学检测示注药侧中脑黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞形态改变,数量减少,注药侧平均为(20.3±4.7)个,正常侧平均为(66.3±11.9)个(P＜O.05).结论 血管内介入方法制作偏侧帕金森病猴模型是一种安全、有效的方法,但对硬件及技术条件有一定要求.     

应用微创技术建立恒河猴腰椎间盘早期退变模型

目的 应用CT定位,经皮穿刺纤维环诱导恒河猴腰椎间盘退变,建立灵长类动物腰椎间盘早期退变模型.方法 恒河猴13只,随机分为三组:(1)造模组:在CT定位下,用20G穿刺针从左侧后方入路经皮穿刺L1,2:(n=12),L2,3、L3,4、L4,5、L5,6(n=13)椎间盘的纤维环全层至椎间盘髓核正中,共64个椎间盘.(2)穿刺对照组:15G穿刺针穿刺1只猴的L1,2椎间盘.(3)正常对照组:L6,7,L7-S1,共26个椎间盘.造模前及造模后4、8、12周对各组椎间盘行MRI检查,并行HE、Masson、番红O、免疫组织化学染色组织学观察.结果 (1)MRI:20G穿刺针穿刺的造模组椎间盘造模前及造模后4、8、12周,椎间盘信号强度按Pfirmann分级均为Ⅰ级.15G穿刺针穿刺椎间盘4周时信号降低(Pfirrmann Ⅲ级),8周时为黑色椎间盘(Pfirmann Ⅳ级).正常对照组椎间盘为Pfirmann Ⅰ级.(2)组织学:造模组椎间盘造模后4周未见改变,8周时HE染色示髓核内细胞数减少,12周时较为明显.Masson染色4周未见改变,8周时各层纤维间出现裂隙,12周时裂隙增宽.番红O染色见8、12周髓核内蛋白聚糖进行性减少.免疫组织化学结果显示4周和8周时同正常椎间盘比较差异无统计学意义(P＞0.05),12周时,Ⅱ型胶原合成减少(P＜0.05).15G穿刺对照组在8周时HE染色见髓核内细胞减少明显,Masson染色见纤维环各层间裂隙明显,呈波浪状.番红O染色示髓核内蛋白聚糖数量明显减少.免疫组织化学染色示Ⅱ型胶原合成减少.正常对照组在各时间点未见到形态学改变.结论 20G穿刺针可以诱发椎间盘缓慢进展的轻度退变.MRI平均信号强度观察椎间盘轻度退变时,不是敏感的指标,需要依靠组织学证实.     

重组质粒pEGFP-c1-FLT3L的构建及鉴定

目的：构建重组质粒pEGFP-c1-FLT3L并鉴定,为下一步利用纳米载体介导FL基因移植作用于结肠癌细胞的体内实验奠定基础。方法：应用基因合成和克隆技术构建重组质粒pEGFP-c1-FLT3L,并进行酶切鉴定及序列测定,以检测其核苷酸序列与设计的是否完全一致。结果：重组质粒pEGFP-c1-FLT3L经酶切鉴定分析,琼脂糖凝胶电泳鉴定可见清晰地切出与FLT3L基因大小相符的片段并与DNAmarker相符,同时进行序列测定,证实其核苷酸序列与设计完全一致。结论：成功构建重组质粒pEGFP-c1-FLT3L并得到正确鉴定,为下一步结肠癌的基因治疗打下实验基础。     

Flt3L‐mobilized dendritic cells bearing H2‐Kbm1 apoptotic cells do not induce cross‐tolerance to CD8+ T cells across a class I MHC mismatched barrier

Tolerization of allogeneic CD8⁺ T cells is still a pending issue in the field of transplantation research to achieve long‐term survival. To test whether dendritic cells (DC) bearing allogeneic major histocompatibility complex (MHC) class I mismatched apoptotic cells could induce cross‐tolerance to alloreactive CD8⁺ T cells, the following experimental strategy was devised. Rag2/γ_c KO B6 mice were treated with Fms‐like tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L)‐transduced B16 melanoma cells to drive a rapid expansion and mobilization of DC in vivo. Of all DC populations expanded, splenic CD11c⁺CD103⁺CD8α⁺ DC were selectively involved in the process of antigen clearance of X‐ray irradiated apoptotic thymocytes in vivo. Considering that CD11c⁺CD103⁺CD8α⁺ DC selectively take up apoptotic cells and that they are highly specialized in cross‐presenting antigen to CD8⁺ T cells, we investigated whether B6 mice adoptively transferred with Flt3L‐derived DC loaded with donor‐derived apoptotic thymocytes could induce tolerance to bm1 skin allografts. Our findings on host anti‐donor alloresponse, as revealed by skin allograft survival and cytotoxic T lymphocyte assays, indicated that the administration of syngeneic DC presenting K^bm1 donor‐derived allopeptides through the indirect pathway of antigen presentation was not sufficient to induce cross‐tolerance to alloreactive CD8⁺ T cells responding to bm1 alloantigens in a murine model of skin allograft transplantation across an MHC class I mismatched barrier.     

Adjuvant effect of a Flt3 ligand (FL) gene-transduced xenogeneic cell line in a murine colon cancer model

BACKGROUND: Flt3 Ligand (FL) has been shown to elicit antitumor responses induced by tumor antigen stimulation. Allogeneic and xenogeneic cell lines transduced with cytokine genes may be used to augment the antitumor efficacy of tumor antigens. OBJECTIVES: The objective was to evaluate the augmentation of tumor lysate-induced immunity by a more clinically applicable FL gene-transduced xenogeneic cell line in combination with interleukin-2 (IL-2) in a CC-36 murine colon cancer model. METHODS: Human 143B osteosarcoma tumor cells were transduced with full-length FL cDNA (143B-FL). Secretion of FL from 143B-FL was analyzed in vivo in normal BALB/c mice transplanted with 143B-FL, and expansion of dendritic cells (DC) was also analyzed in the same mice by flow cytometry. Eight-week-old, male BALB/c mice were used in a prophylactic vaccination protocol utilizing tumor lysate (CLy), 143B-FL, and soluble IL-2. Prophylactic group designations (n = 10/group) were as follows: ten million 143B-FL cells (alone, with tumor lysate, or with tumor lysate and IL-2), IL-2 with tumor lysate, IL-2 alone, or a no treatment control. The tumor lysate (200 microg of protein) and IL-2 (100,000 IU) injections were administered intraperitoneally. Mice were challenged subcutaneously with 10(3) CC-36 tumor cells. Tumor protection and tumor burden (TB), as mean tumor diameter, were determined. Peripheral blood lymphocytes (PBLs) from the 143B-FL + IL-2 + tumor lysate vaccinated group were analyzed for cytolytic activity in 4-h chromium release assays. In addition, plasma cytokine concentrations of interleukin-12 (IL-12) and interferon gamma (IFN-gamma) were assessed by ELISA. Student's t tests were used for all statistical comparisons. RESULTS: In vivo expression of FL was observed 24 h following the inoculation of 143B-FL, and a four fold increase in DCs was observed in the peripheral blood of these mice. Mice immunized with a combination of 143B-FL, tumor lysate and IL-2 showed statistically significant protection against tumor development (10%) for 100 days after tumor challenge; incidences in other groups ranged from 40 to 100% (P < 0.05). Moreover, this immunization protocol produced the lowest TB at 3- and 6-week time points (0, 1.6 mm) when compared to all other groups (TB between 7.2 and 15.9 mm) (P < 0.05). In addition, PBLs from vaccinated mice showed increased cytolytic activity against CC-36 target cells. This corresponded to increased levels of IL-12 and IFN-g in the plasma of mice following vaccination. CONCLUSIONS: These data suggest that FL gene-transduced xenogeneic tumor cells may augment the immunity induced by tumor antigens and systemic IL-2 through the activation of dendritic cells and T-cell-mediated mechanisms.     

恒河猴骨髓源性神经样细胞分化分子机制的基础研究

目的 探讨神经发育音猬因子(SHH)诱导恒河猴骨髓间质细胞(BMSCs)向神经样细胞分化的丝裂原活化蛋白激酶信号分子变化. 方法 密度梯度离心法分离培养恒河猴骨髓干细胞,应用Westem-blot方法检测SHH诱导细胞内信号蛋白变化,免疫组化方法观察丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)特异性抑制剂对细胞诱导过程的影响. 结果 SHH诱导恒河猴BMSCs分化为神经样细胞分化过程,细胞内激酶p38在加入诱导液5 min后即被激活,随着时间的延长持续升高,1h达到最高峰,诱导前、后p38的总量未见变化;而磷酸化的ERKl/2被抑制,5 min时即开始减少,在2h内逐渐降低,诱导前、后ERKl/2的总量未见变化. 结论 MAPK激酶系统参与SHH诱导恒河猴MSCs分化为神经样细胞分化过程,p38被激活,而ERK被抑制.