耐热木聚糖酶和葡萄糖醛酸苷酶的共表达及应用

目的：提高海栖热袍菌（Thermotoga maritima MSB8）来源的木聚糖酶XynB和α-葡萄糖醛酸苷酶AguA生产效率并降低生产成本。方法：利用基因重组技术将海栖热袍菌的XynB和AguA基因置于不同表达盒下构建共表达载体pET-20b-xynB-aguA和pET-28a-xynB-aguA,分别转化大肠杆菌Escherichia coli JM109（DE3）进行诱导表达,获得双酶混合物进而水解桦木木聚糖及玉米芯。结果：重组菌E. coli JM109（DE3）/pET-28a-xynB-aguA比E. coliJM109（DE3）/pET-20b-xynB-aguA产酶更具优势,在LB培养基中诱导培养8 h,XynB和AguA的产量分别达到7.6 U/mL和0.5 U/mL,在TB培养基中培养,XynB可达到10.27 U/mL,AguA为1.5 U/mL。在80 ℃水解条件下,双酶比单一木聚糖酶能够更彻底降解桦木木聚糖,所得酶解液中木二糖的含量和纯度更高;从还原糖释放量及电子显微镜观察可以看出双酶液对农副产品玉米芯具有良好的降解作用。结论：XynB和AguA基因（T. maritima）的克隆共表达具有可行性,并且在生物转化、食品工业和饲料生产等领域具有潜在应用前景。     

响应面法优化稻壳中木聚糖的提取工艺

为提高稻壳中木聚糖的提取率,稻壳经3％的硫酸预处理后再用碱法进行木聚糖的提取,采用响应面法优化工艺条件,先对提取温度、NaOH浓度、固液比、提取时间4个因素进行单因素试验.根据单因素试验结果设计中心组合试验,以木聚糖提取率为考察指标,采用响应面分析法确定最优工艺参数.结果表明:提取温度69.8℃、NaOH浓度10.7％、固液比1∶13(m∶V)、提取时间5.1h.该条件下,木聚糖提取率可达76.57％.     

响应面法优化草鱼内脏蛋白质酶解工艺

为实现草鱼内脏蛋白质的高值化利用,本研究在单因素试验基础上应用响应面试验优化了木瓜蛋白酶水解脱脂草鱼内脏蛋白质的条件,响应面法分析得出4 个影响因素的最佳组合为加酶量33 015 U/g、酶解温度62.35 ℃、酶解时间5.37 h、酶解pH 7.9,此时水解度为44.48%,肽得率为19.68%,水解液鲜味较明显。     

响应面分析法优化蔗渣木聚糖提取工艺

采用响应面分析法优化蔗渣中木聚糖的提取工艺,在单因素试验基础上,利用Design-Expert 8设计了响应面试验,研究了NaOH浓度、水解时间、液料比对木聚糖得率的影响。结果表明：蔗渣木聚糖提取的最佳工艺条件为NaOH浓度8.86%,水解时间205min,液料比66：1。在此最优水解条件下,模型预测木聚糖得率为28.10%,验证实际得率为27.94%。     

响应面法优化玉米芯中木聚糖的提取工艺

为提高玉米芯中木聚糖的得率,采用响应面法优化碱法提取玉米芯中木聚糖的工艺条件,对碱液质量浓度、固液比、处理时间、处理温度4个因素进行单因素试验。根据单因素试验结果设计中心组合试验,以木聚糖得率为指标值,采用响应面分析法确定最优工艺参数。结果表明：NaOH溶液的质量浓度为25g/100mL、固液比1:25(g/mL)、94℃抽提3h,在上述条件下木聚糖得率为24.39%,比单因素试验的最高得率20.35%高出19.85%,与模型的预期值24.41%基本相符。响应面优化法能够提高玉米芯的木聚糖得率。     

超声耦合木聚糖酶水解棉籽壳木聚糖高效制备低聚木糖

本研究以棉籽壳水不溶性粗木聚糖为底物,考察超声耦合酶解棉籽壳木聚糖制备低聚木糖的工艺条件。通过单因素实验以及Box-Behnken响应面实验对低聚木糖的制备工艺进行了优化。实验结果显示,最佳超声耦合酶解条件为时间42 min,温度45℃,反应体系p H=5.1,超声频率40 k Hz,超声强度0.22 W/cm2,还原糖总量达到最高50.46%。经HPLC分析,木二糖的含量占粗棉籽壳木聚糖的29.38%,占还原糖总量58.22%。      

响应面优化超声辅助碱法提取花生壳木聚糖的工艺研究

以花生壳为原料,通过超声辅助碱法提取木聚糖,单因素实验选取因素和水平,根据Box-Benhnken实脸设计原理,用Design-Expert软件进行响应面分析,得出最佳提取工艺条件为:碱浓度7%、处理时间80min、固液比1:16、温度78.1℃、超声功率120W,经验证实际测定木聚糖提取率为56.43%,与预测值57.13%基本相符。      

响应面优化超声辅助碱法提取花生壳木聚糖的工艺研究

以花生壳为原料,通过超声辅助碱法提取木聚糖,单因素实验选取因素和水平,根据Box-Benhnken实脸设计原理,用Design-Expert软件进行响应面分析,得出最佳提取工艺条件为:碱浓度7%、处理时间80min、固液比1:16、温度78.1℃、超声功率120W,经验证实际测定木聚糖提取率为56.43%,与预测值57.13%基本相符。     

响应面法优化多黏芽孢杆菌产α-环糊精葡萄糖基转移酶发酵培养基

为了提高多黏芽孢杆菌YLW-8产α-环糊精葡萄糖基转移酶的能力,对培养基条件进行优化,并利用优化后的培养基条件考察培养时间及不同初始p H对YLW-8产酶的影响。采用Plackett-Burman重要因素筛选实验筛选出影响产酶的3个主要因素:玉米淀粉、麸皮、磷酸氢二钾。在此基础上利用最陡爬坡实验逼近最大响应值区域,最后利用中心组合实验确定主要因子之间的交互作用及最佳条件。结果表明,玉米淀粉1%,硫酸铵0.15%,麸皮1.5%,碳酸钙0.5%,蛋白胨0.5%,磷酸氢二钾0.01%,酵母膏0.4%,硫酸镁0.015%时,α-环糊精葡萄糖基转移酶的酶活为3089.8U/m L,利用该培养基条件培养时间可缩短至3d,初始p H8.0。该条件可以降低染菌的几率,大大减少生产成本,可应用于α-环糊精生产工业。     

β-葡萄糖醛酸酶发酵培养条件优化及提取研究

β-葡萄糖醛酸酶（β-G）是大肠杆菌（E．coli）的特异酶,本文利用酶-底物法测定β-G活性,确定了β-G的最佳发酵培养基：胰蛋白胨1％、淀粉5％、NaCl0．5％、酵母膏0．5％、pH7．2～7．4;最佳发酵培养条件：通气量50mL/250mL三角瓶,转速110rpm,并用硫酸铵分级沉淀法对β-G进行提取研究。     

响应面法优化微波辅助酶解制备α-葡萄糖苷酶抑制活性肽工艺

为了优化微波辅助酶解制备α-葡萄糖苷酶抑制活性肽工艺,以冷榨花生蛋白粉为原料,以酶解得到的α-葡萄糖苷酶抑制活性肽复合物对α-葡萄糖苷酶的抑制率为考察指标,在单因素实验基础上,通过响应面Box-Benhnken实验设计进行工艺优化。结果表明,最优工艺条件为底物浓度9.77%、加酶量0.94%、温度59 ℃、时间10 min、pH9.0、微波功率1000 W;此工艺条件下的α-葡萄糖苷酶抑制活性肽复合物对α-葡萄糖苷酶的抑制率的响应面模型预测值为84.80%,验证实验的抑制率为90.21%±0.93%,两者的差异值为6.38%。本研究结果为花生α-葡萄糖苷酶抑制活性肽的分离、纯化和应用等研究提供了理论基础。     

响应面法优化α-葡萄糖苷酶发酵条件研究

采用Plackett-Burman(PB)分析法和响应面法(Response surface methodology,RSM)对臭曲霉产α-葡萄糖苷酶的发酵条件进行了优化。PB实验表明麦芽浸粉、KH2PO4、尿素、pH和接种量具有显著影响效应;然后利用最陡爬坡实验逼近最大响应区域,通过中心组合实验对影响产酶的主要因素进行研究,建立了影响因素与响应值之间的回归方程,并获得最佳发酵条件:麦芽浸粉38.13g/L,KH2PO47.88g/L,尿素0.91g/L,pH为5.76,接种量为9.63%。在此优化条件下发酵,α-葡萄糖苷酶产量提高了35%左右,达到1218.6U/mL。     

响应面法优化α-葡萄糖苷酶发酵条件研究

采用Plackett-Burman（PB）分析法和响应面法（Response surface methodology,RSM）对臭曲霉产α-葡萄糖苷酶的发酵条件进行了优化。PB实验表明麦芽浸粉、KH2PO4、尿素、pH和接种量具有显著影响效应;然后利用最陡爬坡实验逼近最大响应区域,通过中心组合实验对影响产酶的主要因素进行研究,建立了影响因素与响应值之间的回归方程,并获得最佳发酵条件:麦芽浸粉38.13g/L,KH2PO47.88g/L,尿素0.91g/L,pH为5.76,接种量为9.63%。在此优化条件下发酵,α-葡萄糖苷酶产量提高了35%左右,达到1218.6U/mL。      

响应面法优化里氏木霉产木聚糖酶发酵培养基

采用响应面法对里氏木霉产木聚糖酶的发酵培养基进行了优化。首先利用Plackett-Burman实验设计筛选出影响产酶的3个主要因素:乳糖、玉米浆和KH2PO4。在此基础上运用最陡爬坡路径法逼近最大响应值区域,最后利用响应面分析法确定主要因子之间的交互作用及最佳条件。结果表明,乳糖45.13g/L,玉米浆15.94g/L,（NH4）2SO43g/L,KH2PO42.73g/L,MgSO4·7H2O0.8g/L,无水CaCl20.6g/L,吐温-801mL/L时,木聚糖酶最大理论酶活为855.01U/mL。经5次平行实验验证,实际平均酶活与预测酶活相近,比优化之前的酶活提高了24.1%。      

响应面法优化漂白浆酶水解

采用响应面法中的Box-Behnken实验设计,研究了温度、酶用量和pH值对漂白针叶木浆酶解效率的影响,分别提出了用于预测可溶糖转化率和葡萄糖转化率的数学模型.通过规划求解,优化了3个因素:当温度、酶用肇和pH值分别为52.8℃、10g/L、5.5以及45.9℃、10 g/L、5.3时,可溶糖转化率和葡萄糖转化率分别达到最大81.5%和54.3%.通过实验数据与预测数据的对比,证明模型具有准确的预测性能.     

经密码子优化的葡萄糖醛酸酶在E.coli中的表达

对α-葡萄糖醛酸酶基因(AguA)的稀有密码子进行了优化,经过稀有密码子优化的基因在pTrc99A载体中由于二级结构稳定性的增加使得目的基因的表达水平比原始基因还要低.在权衡几个载体后使用本实验室构建的热激载体pAT,可以降低mRNA二级结构自由能(△g),得到了α-葡萄糖醛酸酶的高表达,结果充分说明了mRNA二级结构的自由能对外源基因的表达的影响.     

β-葡萄糖醛酸酶提取及其活性研究

β-葡萄糖醛酸酶(β-G)是大肠杆菌(E.coli)的特异酶,利用酶-底物法测定β-G活性,确定了β-G的最佳发酵培养基:胰蛋白胨1%、淀粉5%、NaCl 0.5%,、酵母膏0.5%、pH 7.2～7.4;最佳发酵培养条件:通气量50 mL/250 mL三角瓶,转速110 r/min,并用硫酸铵分级沉淀法对β-G进行提取研究。     

甲壳素固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的研究

以甲壳素为载体、戊二醛为交联剂,固定β-葡萄糖醛酸苷酶,对β-葡萄糖醛酸苷酶的固定化条件进行了研究,并通过正交实验确定了酶固定的最佳条件：戊二醛浓度0.7%,交联时间4h,吸附时间为9h,反应温度40℃,此时酶活力回收率可达67.32%。     

海藻酸钠固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的研究

本文研究了以海藻酸钠为载体,采用交联-包埋方式固定β-葡萄糖醛酸苷酶的固定化工艺。分别考察海藻酸钠浓度、戊二醛体积分数、氯化钙浓度、交联时间和固化时间对固定化酶相对酶活力的影响,并以正交试验确定β-葡萄糖醛酸苷酶最佳的固定化条件:海藻酸钠质量浓度35g/L、给酶量1600U/g载体、戊二醛体积分数0.2%、氯化钙质量浓度20g/L、交联时间2h、固化时间2h。研究表明此时固定化酶的回收率较高,可达到71.66%,本文使用的固定化工艺简单易行,具有广阔的工业前景。     

甲壳素固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的研究

以甲壳素为载体、戊二醛为交联剂,固定β-葡萄糖醛酸苷酶,对β-葡萄糖醛酸苷酶的固定化条件进行了研究,并通过正交实验确定了酶固定的最佳条件:戊二醛浓度0.7%,交联时间4h,吸附时间为9h,反应温度40℃,此时酶活力回收率可达67.32%。