谷氨酸棒状杆菌的谷氨酸分泌模式初探

在不同初始生物素添加量的条件下进行谷氨酸发酵实验,探讨生物素对谷氨酸棒杆菌分泌谷氨酸的影响机制。实验结果表明:生物素浓度是控制胞内谷氨酸向胞外分泌的关键因素,生物素浓度进入亚适量范围后胞内谷氨酸开始向胞外分泌,名义生物素"亚适量"的浓度范围在1.97～2.29μg/g DCW。在菌体胞内谷氨酸正常向外分泌时添加20μg/L的生物素,谷氨酸正常向外分泌即停止,胞内谷氨酸浓度增加,进一步证明谷氨酸分泌受生物素浓度控制。通过胞内、胞外谷氨酸浓度对比及生物素所起的作用,提出了谷氨酸分泌的一种新的假定模式——"生物素浓度触发式分泌"模式。     

谷氨酸棒状杆菌硫酯酶基因表达对脂肪酸合成的影响

旨在为进一步构建脂肪酸高产菌株奠定基础,通过异源和同源表达,研究了谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中硫酯酶的基因(NCgl2365和NCgl0090)对脂肪酸合成的影响。结果表明：硫酯酶的过表达对大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌中脂肪酸的种类和含量都产生了影响;基因NCgl2365在大肠杆菌中过表达后脂肪酸产量增加了37.86%,且促进了饱和脂肪酸C16∶0、C18∶0和不饱和脂肪酸C17∶1和C20∶3的生成,在谷氨酸棒状杆菌中同源表达后脂肪酸产量提高了33.43%,C17∶0相对含量增加了51.82%,而C6∶0、C8∶0、C12∶0、C17∶1、C18∶0、C18∶1和C18∶3的相对含量显著减少;基因NCgl0090在大肠杆菌中过表达后脂肪酸产量增加了58.15%,促进了饱和脂肪酸C14∶0、C16∶0、C18∶0和不饱和脂肪酸C17∶1的生成,而在谷氨酸棒状杆菌中同源表达后脂肪酸产量提高了59.12%,其中C16∶0相对含量增加了40.18%,促进了C10∶0、C14∶0、C14∶1、C15∶0、C16∶1、C18∶2、C20∶1和C21∶0 8种新脂肪酸的合成。综上,基因NCgl2...     

谷氨酸棒状杆菌基因NCgl1600异源表达对大肠杆菌脂肪酸合成的影响

异源表达是研究基因功能的重要环节.通过基因标识以及氨基酸序列比对,发现基因NCgl1600所编码的蛋白酶与E.coli MG1655硫酯酶Ⅱ相似度高达91％.为进一步鉴定其蛋白功能,将目的片段与质粒pET-28a连接转化到大肠杆菌BL21中,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导 下过表达基因NCgl1600并...     

谷氨酸对地衣芽孢杆菌产杆菌肽的影响

研究了发酵过程中添加谷氨酸对菌体代谢和杆菌肽合成的影响。摇瓶发酵过程中添加0.03g/L谷氨酸,杆菌肽产量增加13.4%,而10L发酵罐发酵16h添加0.03g/L谷氨酸,杆菌肽效价在36h达到峰值。发酵16~26h以3mg/(L·h)流加谷氨酸,杆菌肽16~34h的合成速率是34.0U/(mL·h),比对照组提高55.3%;同时,生物量16~30h增长速率是20.2μg/(mL·h),比对照组提高了17.4%,但是菌体自溶时间比对照提前了6h。NO2-浓度在18~32h高于对照组11.4%~154.9%,挥发性脂肪酸(VFA)浓度在22~32h低于对照组10.3%~94.8%。说明流加谷氨酸起到了调控因子的作用,通过生成NO2-增加了NADH的消耗,降低了VFA的生成,刺激了菌体在发酵中前期的生长;谷氨酸同时也参与到了杆菌肽的合成,加快了杆菌肽的积累。     

谷氨酸棒状杆菌的利用及其代谢

从土壤中分离的革兰氏阳性细菌谷氨酸棒状杆菌是一个高产氨基酸的天然菌株。本文重点综述了谷氨酸棒状杆菌的发现利用及其部分代谢。     

谷氨酸棒状杆菌的利用及其代谢

从土壤中分离的苹兰氏阳性细菌谷氨酸棒状杆菌是一个高产氨基酸的天然菌株。本文重点综述了谷氨酸棒状杆菌的发现利用及其部分代谢。     

外源蛋白表达过程中谷氨酸棒状杆菌转录组及代谢物的多变元分析

以谷氨酸棒状杆菌为研究对象,在发酵罐水平30%溶解氧条件下对野生菌及表达EGFP的工程菌进行平行培养,对培养20 h的菌体进行转录组分析,并对不同时间点所取样品进行代谢物检测。利用多变元分析方法分析转录组和代谢物数据,其中主要利用主成分分析法进行关键因素分析,利用正交偏最小二乘法判别分析进行转录组数据分析,继而通过S-plot得到不同溶解氧下的生物标记物(biomarkers),最终找到了8个关键基因。代谢数据分析结果表明ATP、谷氨酸、乙酸、胞内谷氨酸、甲硫氨酸及乳酸是外源蛋白表达的关键代谢物;通过不同时间点代谢物含量变化分析发现外源蛋白表达的代谢变化类似于低氧环境下的代谢变化现象,即糖酵解增强,TCA溢流,回补途径增加,乙酸、乳酸生成增加。通过对比外源蛋白表达工程菌与野生菌的转录组数据及代谢物含量数据,为今后在代谢工程中菌株改造、优化代谢获得高效表达外源蛋白的谷氨酸棒状杆菌表达宿主奠定基础。     

高产L-精氨酸谷氨酸棒状杆菌的构建

以产L-精氨酸诱变菌株谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）AJC为出发菌株,采用基因组编辑技术对其进行改造。 首先,敲除阻遏蛋白ArgR和FarR,解除反馈阻遏作用;然后,敲除乳酸脱氢酶编码基因ldh和整合鸟氨酸乙酰转移酶编码基因argJ,阻 断乳酸合成途径和增加前体物;最后,敲除谷氨酸分泌蛋白编码基因NCgl1221和整合乙酰谷氨酸激酶基因argB,减弱L-谷氨酸的胞 外分泌,筛选一株L-精氨酸高产菌株。 结果表明,获得一株高产L-精氨酸菌株AJC-4（C. glutamicum AJCΔargRΔfarRΔldh::PtufargJ ΔNCgl1221::PsodargB）,该菌株在5 L发酵罐中发酵64 h后,L-精氨酸产量和糖酸转化率分别为78.0 g/L和0.38 g/g,较出发菌株AJC分 别提高21.9%、18.8%;副产物乳酸和L-谷氨酸积累量分别为0.11g/L、0.16 g/L,较出发菌株AJC分别降低96.8%、96.1%。     

谷氨酸棒状杆菌高效发酵谷氨酸的关键分子机理研究进展

谷氨酸是世界上产量最大的氨基酸,在食品、医药、工农业等领域具有广泛的用途。谷氨酸棒状杆菌是工业生产谷氨酸的主要菌株,从发现谷氨酸棒状杆菌以来,国内外在谷氨酸过量产生机理方面的研究已取得了一定的科研成果。本文就发酵过程中基因转录水平、关键酶酶活、细胞膜与运输蛋白的结构3个层面机理的研究进展做一综述。最后对谷氨酸过量产生的机理进行分析,将来需从生理作用及调控因子等方面研究,进一步完善谷氨酸过量产生机理,以期对提高谷氨酸产量以及开发微生物合成其他生物产品提供参考和方向。     

谷氨酸棒状杆菌果糖代谢阻断工程菌的构建

谷氨酸棒状杆菌不仅可以利用葡萄糖和果糖作为碳源进行糖类代谢,也可以利用这些碳源作为底物生产葡萄糖酸、甘露醇及山梨醇等产品。为了提高底物利用率和目的产物的积累量,利用代谢工程阻断糖类代谢的磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统（phosphoenolpyruvate carbohydrate phosphotransferase system,PTS）和失活相应磷酸激酶。是实现此目标的有效手段。本实验利用同源重组和反向筛选等技术手段,分别获得ptsF单基因缺失工程菌CGΔptsF和ptsF、ptsH、ptsI三基因缺失工程菌CGΔptsFΔptsHΔptsI。工程菌的生长情况研究表明：在以葡萄糖为唯一碳源的培养基上,工程菌CGΔptsF和工程菌CGΔptsFΔptsHΔptsI与野生型生长情况基本一致,说明葡萄糖代谢不受3 个基因影响;在以蔗糖为唯一碳源的培养基上,工程菌CGΔptsF和工程菌CGΔptsFΔptsHΔptsI的生长速率分别是野生型的48.4%和29.7%,菌体浓度分别是野生型的61.6%和34.1%;在以果糖为唯一碳源的培养基上,工程菌CGΔptsF菌体浓度是野生型43.2%,工程菌CGΔptsFΔptsHΔptsI生长为0,证明其完全阻断了果糖代谢,同时说明果糖的PTS系统受ptsF、ptsH和ptsI基因编码的PTS相关蛋白的联合控制。果糖代谢阻断工程菌的获得,为进一步构建以果糖原型为底物的甘露醇或山梨醇生产工程菌株提供了遗传资源,也为谷氨酸棒状杆菌的糖类代谢研究提供了理论依据。     

谷氨酸棒状杆菌葡萄糖代谢阻断工程菌的构建

采用反向代谢工程的策略,以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032野生型为出发菌株,利用无抗性标记的同源重组方法,敲除了编码葡萄糖pts系统关键转运蛋白基因ptsG、ptsH-ptsI和葡萄糖转运系统关键转运蛋白基因abc、abc2和iolt1,得到了5株逐次敲除了相应基因的突变株。结果表明:当以葡萄糖为唯一碳源培养时,CGΔptsG菌株的葡萄糖的消耗是野生型的50%,菌体OD值为1.473;CGΔptsH-ptsI菌株的葡萄糖的消耗是野生型的39.5%,菌体OD值为1.226;CGΔabc菌株的葡萄糖的消耗是野生型的36%,菌体OD值为1.092;CGΔabc2菌株的葡萄糖的消耗是野生型的26.2%,菌体OD值为0.486;CGΔiolt1葡萄糖的消耗和菌体生长OD值为0,实现了谷氨酸棒状杆菌葡萄糖代谢的阻断,说明ptsG、ptsH-ptsI、abc、abc2和iolt1所编码的转运蛋白具有葡萄糖转运功能。     

全局调控因子Lrp的表达强化谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-缬氨酸

作者研究发现全局调控因子Lrp的表达能促进谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-缬氨酸,但对菌体生长有一定影响。RT-PCR分析发现:Lrp的表达能提高L-缬氨酸合成相关基因ilv A、ilv BN、ilv C、ilv D及转运相关基因brn FE的转录水平,这也许是L-缬氨酸产量提高的原因。实验还发现:表达含有点突变(Arg39Trp)的Lrp可以进一步提高谷氨酸棒状杆菌L-缬氨酸的产量,而且对菌体生长的影响也减小;这种效果在lrp-brn F间隔区域存在突变的L-缬氨酸生产菌VWB-1中更加明显。在VWB-1中共表达lrp1和brn FE基因,5 L罐发酵L-缬氨酸产量达到42.1 g/L,比对照提高了48.9%。     

琥珀酸对谷氨酸棒杆菌谷氨酸合成的影响

研究了在发酵培养基中添加琥珀酸对谷氨酸棒杆菌谷氨酸合成的影响。琥珀酸的添加使菌体生长受到一定程度的抑制，残糖有所升高，但是增加了谷氨酸的合成量。当琥珀酸添加量分别为3g／L、5g／L、7g／L、lOg／L、和20g／L时，谷氨酸合成量分别增加了3．57％，20．53％，46．43％，64．29％和81．25％。未见有类似的研究报道。     

敲除aceA和gogat及过表达gltA对谷氨酸棒状杆菌GKGD合成α-酮戊二酸的影响

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)在生命活动中具有重要的作用,被广泛应用于食品、医药等领域。以α-KG生产菌谷氨酸棒状杆菌GKGD为出发菌株,敲除其异柠檬酸裂解酶编码基因ace A以增加异柠檬酸供应,获得GKGD-1,摇瓶发酵条件下其α-KG产量和转化率分别提高14.72%和9.76%;敲除谷氨酸合酶编码基因gogat以降低L-谷氨酸生成量,获得GKGD-2,其α-KG产量和转化率分别提高7.39%和5.43%,L-谷氨酸生成量降低52.87%;过表达柠檬酸合酶编码基因glt A以进一步增加前体物供应,获得GKGD-3,其α-KG产量提高35.9%;于7.5 L发酵罐经30 h发酵,GKGD-3α-KG产量达49.5 g/L,较出发菌株提高36.4%,L-谷氨酸生成量降低50%。敲除ace A和gogat并过表达glt A可显著提高α-KG产量并降低L-谷氨酸生成量。     

增强回补途径对谷氨酸棒状杆菌合成L-异亮氨酸的影响（英文）

该实验考察和比较增强回补途径对谷氨酸棒状杆菌合成Lacterium glutamicum-异亮氨酸的影响。通过以L-异亮氨酸生产菌Corynebppc YI为出发菌株,分别采用基因组整合和质粒的方式过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因及丙酮酸羧化酶编码基因pyc。结果表明,获得pyc基因组整合和质粒过表达菌株ILE01和ILE02,摇瓶条件下菌株L-异亮氨酸产量分别提高17. 3%(6. 1 g/L)和9. 6%(5. 7 g/L)、发酵罐条件下分别提高11. L7%(24. 8 g/L)和8. 1%(24. 0 g/L)。获得ppc基因组整合和质粒过表达菌株ILE03和ILE04,摇瓶条件下菌株-异亮氨酸产量分别提高(30. 8%(6. 8 g/L)和13. 5%(5. 9 g/L)、发酵罐条件下分别提高15. 8%(25. 7 g/L)和9. 5%24. 3 g/L)。此外,过表达pyc和ppc还可不同程度地提高L-异亮氨酸转化率。然而采用质粒过表达pyc和ppc均使得菌株生物量下降。因此,过表达pyc和ppc均能显著提高L-异亮氨酸产量和转化率,基因组整合的过表达方式效果优于质粒...     

谷氨酸棒杆菌中基因NCgl2632的敲除和过表达对三种外源蛋白表达的影响

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)作为应用日益广泛的蛋白表达宿主菌,其全基因组虽然已经被测序,但是一些影响蛋白表达的关键基因仍未被研究。基因NCgl2632被预测可能是影响谷氨酸棒杆菌能量代谢的关键基因之一。因此该文首先分别构建了NCgl2632敲除菌株、NCgl2632过表达菌株,测定了生长曲线和胞内ATP水平的变化,并用增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)和重链抗体可变区蛋白(variable domain of heavy chain antibody, VHH)验证该基因表达水平的变化对外源蛋白表达的影响,发现敲除该基因对外源蛋白表达量提高有利。同时,由于前期工作中发现NCgl0909的敲除表型比较有利于外源蛋白表达水平的提高,因此在其基础上构建了C.g 15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909双敲除菌株,并表达VHH蛋白进行了验证。此外,该文还选取了一种有潜力的蛋白human MutT homolog 1(hMTH1)进行了表达验证和活性检测,由于其分子质量较小且较稳定易于...     

谷氨酸棒状杆菌ATCC14067阻遏蛋白ArgR与L-精氨酸合成途径相关基因的相互作用

在细菌中阻遏蛋白ArgR通过与精氨酸合成途径相关基因中的保守序列结合,阻遏相关基因的转录。在谷氨酸棒状杆菌ATCC 14067中,精氨酸生物合成涉及的基因位于基因簇argCJBDFRGH和carAB中。构建重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET22b-argR,诱导表达ATCC 14067来源的ArgR,成功得到目的蛋白。利用分子筛色谱柱对ArgR蛋白进行分析,表明ArgR蛋白相对分子质量在108 ku左右,在活性状态下ArgR蛋白为六聚体。合成生物素标记的谷氨酸棒状杆菌ATCC 14067来源的argC、argJ、argB、argF、argG、argH、carA基因片段,采用凝胶阻滞实验(EMSA)观察ArgR蛋白与其在体外的相互作用。结果表明,ArgR蛋白能够在体外与argC基因-26～+32 bp、argB基因-86～-29 bp、argG基因-161～-104 bp、carA基因-99～-42 bp结合,且与argB基因的结合程度最大,但不与argJ、argF、argH基因片段结合。本文首次将argC、argB、argG、carA基因中ArgR蛋白结合的靶标位点定位在60bp内,为更深入的研究谷氨酸棒状杆菌ATCC 14067中精氨酸合成的调控机制提供了理论依据。     

代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌促进L-异亮氨酸发酵合成的研究进展

L-异亮氨酸作为必需氨基酸具有多种生理功能,对人体和动物健康有重要的调节作用。微生物发酵是工业生产L-异亮氨酸的主要方式,而谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）是L-异亮氨酸发酵生产的主要菌株,主要通过筛选和随机诱变得到,其遗传背景不明且很难通过诱变进一步提高产量,因而通过代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌生产L-异亮氨酸成为近年来研究热点。该文综述了近年来代谢工程改造谷氨酸棒杆菌促进L-异亮氨酸生物合成的相关研究,主要涉及代谢通量调控、解除反馈抑制、强化还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）水平以及提高产物分泌能力等方面,对进一步改造菌株和促进L-异亮氨酸发酵合成具有一定的参考意义。     

搅拌对谷氨酸棒杆菌絮凝的影响

谷氨酸棒杆菌等电点为4.2,当等电母液pH在3.2左右时,菌体zeta电势为正值,添加絮凝剂聚丙烯酸钠能有效使分散的细胞聚集成絮凝体。以菌体、COD及蛋白质去除率为指标,借助Mastersize 2000测定絮凝体粒度分布,考察了搅拌速率和搅拌时间对絮凝的影响。结果表明,在搅拌转速为400 r/min,搅拌时间为50 s时,絮凝效果最好,菌体、蛋白质、COD去除率分别达到99%、75%、55%以上,絮凝体粒径达到491μm,C.V.值为53.52%。搅拌速率和搅拌时间在很大程度上影响絮凝效果和絮凝体大小,控制搅拌速率和搅拌时间可以优化絮凝效果和优选絮凝体大小,增强絮凝后的沉降过滤。     

增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性对谷氨酸棒状杆菌积累α-酮戊二酸的影响

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是谷氨酸棒杆菌中催化合成TCA循环中重要代谢物草酰乙酸的关键酶,本文以谷氨酸棒状杆菌GDK-10为出发菌株,通过同源重组技术对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pepc进行以下改造:将GDK-10的Ppepc启动子替换为强启动子Ptuf,获得菌株GDK-11;构建pepc双拷贝菌株GDK-12;对GDK-10基因组pepc进行定点突变(N917G),获得菌株GDK-13。实时荧光定量PCR检测表明,菌株GDK-11和GDK-12的pepc表达量是GDK-10的47.05倍和2.03倍。发酵结果表明,菌株GDK-11和GDK-12的产酸量相对于出发菌株分别下降45.50%和13.90%,但GDK-12的单位菌体产量较GDK-10提高38.59%。菌株GDK-13产酸量无明显变化,但其单位菌体产量和糖酸转化率分别提高21.14%和8.97%。可见,适量过量表达pepc和将GDK-10基因组pepc替换为解除天冬氨酸反馈抑制的pepc(N917G)均可提高α-KG的单位菌体产量且后者可显著提高糖酸转化率。本研究结果可对α-KG的基因工程改造奠定基础。