抗人CD3单链抗体/p53四聚功能域融合基因的构建及表达

目的：构建抗人CD3单链抗体(scFv)／p53四聚功能域融合基因，并进行真核表达及活性测定。方法：在已经构建抗人CD3 scFv和人IgG3上游铰链区／p53四聚功能域融合基因基础上，将抗人CD3 scFv克隆入载体pUC18／IgG3／p53中，构建抗人CD3 scFv／p53四聚功能域融合基因。经酶切鉴定及序列测定证实后，将融合基因克隆入真核表达载体pSecTag2-B中，并转染Hela细胞进行表达。表达产物纯化后，利用流式细胞仪进行活性测定。结果：获得了抗人CD3 scFv／p53四聚功能域融合基因，基因全长为882 bp，可编码294个氨基酸，与已发表的抗人CD3 scFv、人IgG3上游铰链区和人p53四聚功能域基因cDNA序列相一致。表达产物经SDS-PAGE和Western blot证实，为Mr约35000的特异蛋白条带。纯化后经流式细胞仪检测，可特异性地结合人外周血单个核细胞(PBMC)，亲和力高于scFv。结论：获得了可与PBMc特异性结合的抗人CD3 scFv四聚体，为进一步临床应用奠定了基础。     

微型双功能抗体抗CD3／抗CD20的构建和表达

目的：构建和表达抗CD3／抗CD20微型双功能抗体,并测定微型双功能抗体的生物学活性。方法：采用PCR和overlap PCR方法构建抗CD3／抗CD20微型双功能抗体,并用双脱氧终止法测定DNA序列;采用亲和层析法纯化该产物,并用Western blot和分了排阻层析鉴定纯化产物;采用FACS法和玫瑰花环试验鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性。结果：DNA序列测定结果表明：抗CD3／抗CD20微型双功能抗体已构建成功,表达可溶性产物的产量达1mg/ml以上,纯化产物中二聚体的比例达90％,具有与Jurkat(CD3^ 0和Daudi细胞（CD20^ ）结合的活性,且能同时与Jurkat和Daudi细胞结合形成玫瑰花环。结论：利用Diabody形式,首次成功地构建了抗CD3／抗CD20微型双功能抗体,并获得较高表达,表达产物具有与相应2个靶抗原结合的活性。     

抗人CD16单克隆抗体可变区基因的克隆和表达

目的：克隆抗人CD16单克隆抗体重，轻链可变区（VH，VL）基因并合成单链抗体（ScFv)基因。方法：从分泌抗人CD16单克隆抗体的杂交瘤细胞B88－9中提取总RNA，应用RT－PCR技术获得抗CD16单克隆抗体的VH，VL基因，用连接肽（Linker)肽VH和VL连接成具有VH－Linker-VL结构的ScFv基因，将其克隆到表达载体pcDNA3.1( )，并转杂COS－7细胞。结果：VH基因长度为354bp，属于鼠抗体可变区重链基因家族I（B）亚群，VL基因长度为333bp，属于鼠抗体可变区kappa轻链基因家族Ⅲ亚群，采用夹心ELISA方法检测到ScFv的表达。结论：抗人CD16单克隆抗体VH与VL基因的克隆和ScFv基因的构建为基于CD16的导向免疫治疗奠定了基础。     

人源化抗CD3单链抗体在大肠杆菌中的表达

在以前的工作中 ,我们利用本研究室制备的抗胶质瘤单克隆抗体ＳＺ39通过化学偶联的方法制备了抗ＣＤ3/抗胶质瘤双特异性抗体 ,并在体外细胞毒及荷瘤动物体内试验中取得较好疗效[1,2 ] ,但存在着分子量大 ,穿透力弱 ,免疫原性强 ,制备困难等缺点。因此 ,研制小分子 ,低免疫原性的人源化抗ＣＤ3/抗胶质瘤双特异性抗体是我们正在开展的研究项目之一。目前我们已构建并原核表达了抗胶质瘤单链抗体ＳＺ39 ＳｃＦｖ。本研究构建并表达的人源化抗ＣＤ3单链抗体 ,旨在为下一步制备高效低毒的抗ＣＤ3/抗胶质瘤双特异性抗体提供一个理想的构件。1　材…     

人CD4基因在大肠杆菌中的表达

本文设计并化学合成了一对ＰＣＲ引物，以人ＣＤ４ｃＤＮＡ为模板，成功地扩增出人ＣＤ４Ｎ端两个结构域的编码基因（６００ｂｐ），并在此基因两端分别插入了ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切位点及起始和终止码。通过ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切位点将ＣＤ４基因克隆入ｐＵＣ１９质粒，经过ＰＣＲ和酶切鉴定得到ＣＤ４重组克隆ｐＴ４０３。ＤＮＡ序列分析结果表明，所克隆ＣＤ４基因与已发表的人ＣＤ４基因序列完全一致。将ＣＤ４基因     

利用基因重组抗原研制人CD20单克隆抗体及其功能的研究

目的　利用基因重组抗原免疫小鼠 ,制备人CD2 0单克隆抗体 ,研究其特异性和功能。方法　用表达重组人CD2 0基因的细胞NIH 3T3免疫BALB c小鼠 ,取其脾细胞与Sp2 0细胞融合 ,以间接免疫荧光法筛选杂交瘤上清。免疫沉淀法及流式细胞术鉴定其识别抗原的相对分子质量 (Mr)和特异性 ;以MTT法、流式细胞术及形态学方法检测诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖的功能。结果　利用杂交瘤技术获得了 1株抗人CD2 0的单克隆抗体 1 2 8,它具有CD2 0抗体特异的细胞反应谱 ,其识别的抗原Mr 为 33× 10 3 。MTT实验证实 1 2 8能显著抑制Daudi和Raji细胞生长。结论　利用基因重组抗原制备了 1株能够稳定分泌抗人CD2 0的单克隆抗体的杂交瘤细胞株 1 2 8,此单抗具有抑制CD2 0阳性细胞增殖和诱导其凋亡的功能。     

人CD7胞外区基因在大肠杆菌中的表达

目的 在大肠杆菌中表达人白细胞分化抗原CD7胞外区蛋白。方法 采用PCR技术调整CD7基因的阅读框架,使之与生物素化蛋白基因阅读框架一致,缺失了CD7cDNA基因的起始密码子并增加一个大肠杆菌偏性终止密码子,构建CD7胞外区cDNA和生物素化蛋白基因融合的原核表达质粒PinPointxa3-CD7。将重组质粒转入大肠杆菌DH5α表达,SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果。结果 融合蛋白的分子量约为30000u,Western blotting结果表明,表达的蛋白质可被抗CD7的单克隆抗体识别。结论 为研制抗CD7基因工程抗体奠定了基础。     

抗CD3/抗CD20双特异双链抗体的生物学活性研究

目的研究抗CD3/抗CD20双特异双链抗体的生物学活性.方法采用亲和层析法纯化本室构建的抗CD3/抗CD20双特异双链抗体可溶性表达产物,并用SDS-PAGE,Westernblot和分子排阻层析鉴定纯化产物;采用FACS法和玫瑰花环试验测定纯化产物与靶细胞的结合活性;采用3H-TdR掺入实验和51Cr释放试验测定该双特异双链抗体的生物学性质.结果纯化的抗CD3/抗CD20双特异双链抗体具有与Jurkat(CD3+)和Daudi细胞(CD20+)的结合活性,且能同时与Jurkat和Daudi细胞结合形成玫瑰花环,并能竞争性封闭亲代鼠源性抗体HIT3a和HI47与Jurkat和Daudi细胞的结合位点;该双特异双链抗体具有促有丝分裂原作用和介导激活的T细胞杀伤Daudi细胞的活性.结论抗CD3/抗CD20双特异双链抗体具有与亲代鼠源性抗体HIT3a和HI47相同的性质,且能介导激活的T细胞杀伤表达CD20抗原的肿瘤细胞,是一个有望用于B细胞恶性肿瘤临床治疗的双特异性抗体.     

抗人CD20纳米抗体的筛选、表达及特性分析

目的 筛选出抗人CD20纳米抗体序列,并获得具有高亲和力与特异性的抗CD20-人IgG Fc纳米抗体.方法 利用天然噬菌体纳米抗体库,以生物素化的CD20抗原为靶标进行4轮液相亲和筛选,采用ELISA鉴定阳性克隆;将筛选到的阳性克隆基因序列与人IgG Fc片段偶联,构建到原核表达载体pCZN1中,并转化至大肠杆菌Arc...     

人CD20胞外区基因在原核系统中的表达

目的 将ＣＤ２０胞外区在大肠杆菌中表达,并研究表达产物作为抗原筛选抗体的可能性。方法 设计引物从ＰＵＣ１９／ＣＤ２０质粒上钓取取ＣＤ２０胞外区基因,克隆到ＰＥＸＳＥ１载体上,在大肠杆功各融合表达。结果 表达产物的相对分子建立了检测ＣＤ２０ｍＡｂ的ＥＬＩＳＡ方法。结论 为研制ＣＤ２０分子的ｍＲｂ奠定了基础。     

Selection and characterization of single domain antibodies against human CD20

CD20 is a membrane protein with four integral membrane regions and a large extracellular loop between residues 142 and 187, which serves as a target binding region for rituximab (RTX) and most other anti-CD20 monoclonal antibodies. It is highly expressed in B-lymphoma cells and B lymphocytes and often serves as a target for immunotherapy. In this study, we developed single domain antibodies (sdAbs) for the sensitive detection of CD20. To achieve this, an immune sdAb library was prepared from llamas immunized with a fusion between the large loop from CD20 and Hoc, a highly antigenic protein from the T4 bacteriophage, (CD20-Hoc). By subtracting binders to recombinant Hoc during the biopanning, potential anti-CD20 sdAbs were selected, sequenced, and characterized for their binding affinity to CD20-Hoc fusion versus Hoc. Twenty five clones grouped into three different families based on CDR3 sequence were identified as potential CD20 binders. The binding kinetics of representative sdAbs from each class and RTX were evaluated by surface plasmon resonance (SPR). Most of the sdAbs that were evaluated show binding affinities to CD20-Hoc in the nM range, and class A sdAbs, exhibited ≥40-fold increase in affinity for CD20-Hoc versus Hoc. When the binding of the sdAbs to CD20 on SU-DHL-4 cells was evaluated by flow cytometry, only class A sdAbs displayed strong binding to CD20 and recognized DHL cells in a concentration dependent manner.     

人CD19分子胞外区在大肠杆菌中的表达研究

本实验应用计算机优化设计，利用ＰＣＲ 和分子克隆技术，以ｐＵＣ１９／ＣＤ１９ 重组质粒为模板，扩增出人ＣＤ１９ 分子的胞外区基因，并与表达载体相连，经３０ ℃扩增菌体，４２ ℃诱导，实现了在Ｅ－ｃｏｌｉ 中融合表达相对分子质量（ Ｍｒ） 为４１ ０００ 的蛋白谱带。初步纯化的包涵体可溶于２ ％ ＳＤＳ，为对其单克隆抗体（ｍＡｂ） 的制备奠定了基础。     

CD3和CD20阳性细胞在人胎腭扁桃体的发育方法

目的 探讨T、B细胞在人胎儿腭扁桃体内的发育情况.方法 收集9～20周因故终止妊娠胎儿腭扁桃体22例,采用免疫组织化学方法,以细胞表面分化群(CD)抗体(CD3和CD20)染色分别显示T细胞和B细胞,用BioMiaspro图像分析软件对免疫反应阳性细胞进行计数,有关数据做统计学分析.结果 妊娠9周时,胎儿腭扁桃体原基内...     

利用重组痘苗病毒表达人CD20基因

目的获得重组人 CD2 0分子并研究编码人 CD2 0的基因在痘苗病毒中的表达。方法从 p GEM- T- EASY/ CD2 0载体上酶切下编码人 CD2 0分子的 c DNA,亚克隆到 p JSA1175载体上 ,重组质粒与野生痘苗病毒共转染 TK- 143细胞。结果APAAP检测到重组病毒感染的细胞表面有 CD2 0分子表达 ,富集后病毒滴度约为 1× 10 9pfu/ ml。结论人 CD2 0基因在痘苗病毒中表达 ,为研究其功能以及研制单克隆抗体奠定了基础     

人CD38抗原胞外段基因克隆及表达

目的 克隆并表达人CD38抗原分子的胞外估基因。方法 采用RT－PCR法，从高表达CD38抗原的Daudi细胞系中，扩增CD38全长cDNA，并将其插入pGEM-T载体中。重新设计引物，从重组pGEMT载体中，扩增CD38抗体分子的胞外段基因，再亚克隆到表达载体pET28a( )，转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导表达。结果 经酶切鉴定及序列分析表明，克隆的CD38外段基因的序列与文献^[1,2]的报道完全一致。将该片段亚克隆到表达载体pET28a( ) ,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21中获得表达。结论 获得了人CD38抗原分子胞外段基因及其原核表达产物，对进一步制备单克隆抗体，研究CD38分子的功能具有重要的意义。     

嵌合抗CD20抗体Fab片段在大肠杆菌中表达及活性鉴定

目的 :构建抗CD2 0 嵌合抗体Fab片段表达载体 ,并在大肠杆菌中进行高效可溶性分泌表达。方法 :利用PCR方法从抗CD2 0 单链抗体 (ScFv)表达载体上扩增抗CD2 0 抗体轻链可变区基因 (VL)、重链可变区基因 (VH) ,然后将VH、VL 基因重组到Fab表达载体pYZF中 ,构建抗CD2 0 Fab表达载体pYZF1cd2 0 ,并在 2 7C7菌中高效表这。结果 :经Fab表达载体转化的 2 7C7菌株 ,进行表达培养 ,经分离纯化获得具有CD2 0 特异结合活性的Fab片段 ,竞争性免疫荧光抑制实验表明 ,表达产物Fab片段能竞争性抑制鼠源性抗CD2 0 抗体HI47和CD2 0 表达细胞Raji细胞结合。结论 :在大肠杆菌中高效可溶性分泌表达有活性的抗CD2 0 嵌合抗体Fab片段。