自体来源树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞混合培养对原代乳腺癌细胞的杀伤作用

 目的　探讨原代乳腺癌细胞冻融抗原负荷自体来源树突状细胞（DC）与细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）细胞混合培养后对原代乳腺癌细胞杀伤活性的影响作用。方法　取对数生长期的原代乳腺癌细胞制备肿瘤抗原（Ag）,用自体外周血单个核细胞分别制备DC 和CIK细胞;用负荷Ag的DC 和CIK细胞共培养,诱导Ag-DC-CIK细胞。采用流式细胞术检测DC免疫表型,MTT法检测分离的单个核细胞（CBMC）、CIK、Ag-CIK和Ag-DC-CIK对原代乳腺癌细胞的杀伤活性。结果　外周血CBMC、CIK、Ag-CIK和Ag-DC-CIK对乳腺癌原代肿瘤细胞杀伤活性分别是（34.35±3.28）%、（45.91±2.78）%、（50.88±3.22）%、（62.10±5.94）%,实验组细胞（Ag-DC-CIK）对原代乳腺癌细胞的杀伤能力（62.10±5.94）%明显高于对照组（P＜0.01）。结论　肿瘤抗原负荷的DC 能增强CIK细胞对靶细胞的杀伤活性,为DC 的免疫治疗提供了新的思路。     

树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞抗肿瘤研究进展

细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)是一种非主要组织相容性复合体(MHC)限制性的细胞毒性T淋巴细胞.CIK用于杀伤肿瘤被认为是肿瘤过继免疫治疗的首选方案.树突状细胞(DC)在肿瘤细胞和T淋巴细胞的相互作用中起到桥梁和枢纽作用.二者共同培养后,不仅提高了CIK的增殖能力和杀伤活性,并且治疗范围广泛,对多个系统的肿瘤均具有较强的杀伤作用.     

树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞对恶性血液肿瘤患者免疫功能的影响

目的 观察应用树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞（DC-CIK细胞）治疗恶性血液肿瘤对患者外周血T淋巴细胞亚群和免疫蛋白的影响.方法 选择25例恶性血液肿瘤患者,采集外周血单个核细胞,经体外培养获得DC-CIK细胞,并将质检合格的DC-CIK细胞分4次回输给患者,分别于治疗前和治疗后3周抽取外周静脉血,检测T淋巴细胞亚群及免疫球蛋白变化情况,与30例非肿瘤患者进行比较分析,同时观察治疗过程中的不良反应.结果 25例患者DC-CIK细胞治疗后外周血中的CD3＋、CD3＋ CD8＋、CD3＋ CD16＋ CD56＋、CD3-CD16＋ CD56＋细胞比例较输注前明显增加（P＜0.05）,CD3＋ CD4＋T细胞比例无明显变化（P＞0.05）;外周血免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA）浓度无明显变化（P＞0.05）.DC-CIK细胞治疗过程中有2例出现短暂性低热,均可自行缓解.恶性血液肿瘤患者在DC-CIK细胞治疗前与非肿瘤患者比较,外周血CD3＋、CD4＋、NK及NKT细胞比例明显下降（P＜0.05）,外周血中的IgG、IgM及IgA浓度无明显变化（P＞0.05）.结论 DC-CIK细胞免疫治疗能显著提高恶性血液肿瘤患者体内的肿瘤杀伤性T细胞及其效应细胞的数量,改善恶性血液肿瘤患者免疫失衡状态,增强机体抗肿瘤免疫功能,且安全有效,为恶性血液肿瘤的治疗提供了新的选择.     

树突状细胞与细胞因子诱导杀伤细胞治疗肿瘤研究进展

树突状细胞(dendritic cells,DC)是已知的功能最强的专职抗原提呈细胞,在抗原加工提呈、抗原识别及T细胞激活中发挥重要作用.而细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineinduced killer cells,CIK)是由多种细胞因子诱导而成,对多种肿瘤细胞具有杀伤作用的细胞毒性T细胞.以DC为基础的肿瘤免疫治疗日益受到人们的重视.文章就近年DC与CIK免疫治疗肿瘤的研究进展作一综述.     

miR-155在细胞因子诱导的杀伤细胞诱导白血病细胞凋亡中的作用及其机制

目的 观察细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)对白血病细胞凋亡的影响,探讨miR-155在此过程中的作用.方法 MTT法检测CIK细胞对白血病NALM-6和Jurkat细胞的细胞毒作用,实时定量反转录PCR检测白血病细胞miR-155表达,流式细胞术检测miR-155对CIK细胞诱导白血病细胞凋亡的影响,构建包含miR-155作用位点的CEBP/β基因3'-UTR区的质粒,转染白血病细胞,双荧光素酶报告基因试剂盒检测白血病细胞CEBP/β荧光素酶活性.结果 CIK细胞对NALM-6和Jurkat细胞具有强大的细胞毒作用,且呈时间与剂量依赖性(P＜0.05),同时CIK细胞能上调NALM-6和Jurkat细胞中miR-155的表达,其中NALM-6细胞上调(2.87±0.19)倍(t=2.787,P＜0.05),Jurkat细胞上调(1.98±0.25)倍(t＝ 3.513,P＜ 0.05).另外,miR-155 mimics能促进CIK细胞对NALM-6和Jurkat细胞诱导的凋亡作用(t=4.239,P＜0.05;t=3.565,P＜0.05),而miR-155抑制剂能够拮抗此过程(t=3.772,P＜ 0.05;t=4.017,P＜ 0.05).miR-155直接作用于CEBP/β基因3'-UTR区,且CIK细胞降低白血病细胞荧光素酶活性,其中NALM-6细胞下降(42.89±2.07)％(t=3.578,P＜0.05),Jurkat细胞下降(37.02±1.95)％(t=4.393,P＜ 0.05).结论 CIK细胞通过上调miR-155促进白血病细胞凋亡,这为CIK细胞治疗白血病提供新的数据.     

细胞因子诱导的杀伤细胞对恶性肿瘤患者细胞表型的影响

目的:探讨细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells,CIK cells)治疗对恶性肿瘤患者淋巴细胞亚群的影响,对比接受CIK细胞免疫治疗前后,培养细胞表型及患者淋巴亚群的变化.方法:选取辽宁省肿瘤医院手术、放化疗治疗结束1个月以上或无法进行以上治疗,单纯接受4个周期CIK细胞免疫治疗的恶性肿瘤患者67名入组.应用流式细胞术检测分析接受4周期CIK细胞免疫治疗前后患者淋巴细胞CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD56+、CD3+PD1+亚群的变化情况.同时对各次输注细胞表型(CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+)进行检测,观察其变化.结果:患者接受4周期CIK细胞免疫治疗后,与治疗前相比,淋巴细胞CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+、CD3+CD56+亚群略有升高,但无统计学差异.CD3-CD56+、CD3+PD1+亚群无明显变化.值得注意的是,输注细胞表型与第一次培养后相比,第二次、第三次的CIK细胞CD3+CD8+、CD3+CD56+表型呈阶梯型上升,结果有统计学差异.第三次与第四次无明显变化.结论:CIK细胞免疫治疗能稳定肿瘤患者免疫状态.接受过CIK细胞回输的患者,再次抽取外周血进行培养时,可增加体内CD3+CD56+前体细胞增殖和定向分化的能力,有望得到远期获益.     

负载人结肠癌Lovo细胞总RNA抗原树突状细胞对细胞因子诱导的杀伤细胞在体外特异性杀伤的影响

目的 探讨人结肠癌Lovo细胞总RNA抗原致敏的树突状细胞(DC)对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)在体外特异性杀伤的影响.方法 利用Ficoll密度梯度离心法提取脐血单核细胞,分别诱导CIK和DC细胞,并用流式细胞仪检测其免疫表型.采用Trizol提取结肠癌Lovo细胞总RNA作为肿瘤细胞抗原,转染脐血来源的DC.实验分为3组:转染Lovo DC共培养CIK组、未转染DC共培养CIK组和单纯CIK组.靶细胞为Lovo细胞,在效靶比为50∶1和20∶1的条件下以噻唑蓝法分别检测CIK的体外杀伤活性.结果 在效靶比为20∶1时,负载Lovo RNA抗原的DC能诱导出CIK对Lovo细胞最强的细胞毒杀伤力为(76.49±4.21)%,DC+CIK组次之为(53.84±2.15)%,CIK组细胞毒性最低为(32.20±3.07)%,且两组间差异有统计学意义(P＜0.05).结论 肿瘤细胞总RNA提取方法简单,易于临床实施,其作为抗原致敏DC能强化CIK的特异性杀伤,将有很好的临床应用前景.     

细胞因子诱导的杀伤细胞治疗胃癌的研究现状

细胞因子诱导的杀伤（cytokine induced killer,CIK）细胞免疫治疗作为一种毒副作用较轻、前景良好的过继性细胞免疫治疗方法,其联合化疗对胃癌的治疗已进行了一定的研究。虽然,目前所报道的临床研究已经证实CIK细胞治疗的安全性,但尚不足以充分证明CIK细胞联合化疗治疗胃癌的有效性,因为这些试验设计方案均存在一些缺陷,如为非随机对照的临床研究、样本量较小、未明确胃癌类型、未标准化的CIK细胞制备方法和治疗方案、无用于预测CIK细胞治疗效果的特异性生物标志物等。因此,迫切需要解决这些问题方能促进CIK细胞用于胃癌临床研究的发展。     

树突状细胞疫苗联合细胞因子诱导的杀伤细胞腹腔灌注治疗恶性腹腔积液临床效果观察

目的 观察树突状细胞（DC）疫苗联合细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）腹腔灌注治疗恶性腹腔积液的安全性和有效性.方法 回顾性分析51例传统治疗失败的恶性腹腔积液患者的治疗情况.治疗组（22例）采用血细胞分离机采集外周血单个核细胞（PBMC）,经体外诱导培养成DC和CIK细胞.将DC和CIK细胞混匀后进行腹腔灌注,隔日1次,共3次;对照组（29例）仅进行姑息性穿刺排出腹腔积液及利尿处理.观察所有患者治疗前后外周血淋巴细胞亚群变化;参照WHO癌性积液疗效评价标准和常见不良反应评价标准（NCI-CTCAE v4.0）评价近期临床疗效和安全性;根据Karnofsky功能状态评分评估患者生活质量（QOL）改变.结果 治疗组外周血中CD4＋ CD25＋调节性T细胞（Treg细胞）比例升高较对照组缓慢,差异有统计学意义（P＜0.05）.治疗组有效率（RR） 40.9％（9/22）,疾病控制率（DCR） 77.3％（17/22）,对照组RR为10.3％（3/29）,DCR为27.6％（8/29）,两组差异均有统计学意义（均P＜ 0.05）.治疗组QOL改善13例（59.1％）,稳定5例（22.7％）,降低4例（18.2％）;对照组QOL改善3例（10.3％）,稳定5例（17.2％）,降低21例（72.4％）,两组差异有统计学意义（P＜0.05）.治疗组所有患者均未出现3～4级不良反应.结论 DC疫苗联合CIK细胞腹腔灌注治疗恶性腹腔积液是安全的,即使在传统治疗效果不佳或失败时也可以取得一定临床获益.     

树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养对多药耐药肿瘤细胞系的杀伤活性

目的探讨在细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)表达特异性抗原的肿瘤细胞过程中,是否存在抗原特异性杀伤。方法分离健康人骨髓获得单个核细胞,分别诱导为树突状细胞(DC)和CIK细胞,将人类乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR细胞的冻融物抗原冲击或未冲击DC与CIK细胞共培养(pulsed-DC CIK、DC CIK),CIK细胞单独培养作对照。用流式细胞仪分析细胞表型,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL-12、和IFN-γ分泌水平,用二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法测定细胞毒效应。结果DC与CIK共育后,两组DC成熟表型较共育前明显提高(P=0.003、P=0.001);pulsed- DC CIK组与DC CIK组、CIK组比较,细胞表型(CD3、CD8、CD56)明显提高(P=0.003、P= 0.011),CD3 CD56 细胞明显增多(P=0.001,P<0.001),CD3 CD8 细胞亦明显增多(P=0.002, P=0.002);CD45RA表型则明显降低(P<0.001,P=0.004)。IL-12和IFN-γ水平在pulsed-DC CIK组表达最高,分别为(254±14.5)pg/ml和(3100±286)pg/ml。对有耐药抗原表达的MCF-7/ADR细胞,pulsed-DC CIK组杀伤效应最强,pulsed-DC CIK组、DC CIK组和CIK组比较,差异均有统计学意义(pulsed-DC CIK组与DC CIK组比较,P=0.039;pulsed-DC CIK组与CIK组比较,P= 0.002;DC CIK组与CIK组比较,P=0.049);而对于无P-gp抗原表达的MCF-7细胞的杀伤效应,pulsed- DC CIK组和DC CIK组之间无明显差异,但均高于CIK组,差异有统计学意义(pulsed-DC CIK组与CIK组比较,P=0.007;DC CIK组与CIK组比较,P=0.048)。结论从人骨髓培养得到DC和CIK细胞共培养后,能促进各自特征性表面标志的表达上调,并分泌大量相关细胞因子。细胞杀伤效应的明显提高及可能的特异性细胞杀伤效应,为多药耐药肿瘤的临床生物免疫治疗提供实验基础。     

负载抗原的DC与CIK共培养对耐药乳腺癌细胞的杀伤作用

目的:观察负载抗原的树突状细胞(dendritic cell,DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cell,CIK)对高表达P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的多药耐药(multidrug resistance,MDR)人乳腺癌MCF-7/ADR细胞的杀伤作用。方法:提取健康人外周血单个核细胞,常规诱导出CIK及DC;制备MCF-7/ADR细胞冻融抗原后冲击DC,并与CIK共培养作为实验组(冻融物DC-CIK组),未负载抗原的DC与CIK共培养作为对照组(DC-CIK组),同时设单独培养的CIK组或DC组作为空白对照组。流式细胞术分析细胞的表型及P-gp表达,ELISA法测定细胞上清中IL-12、IFN-γ水平,MTT法检测对MCF-7/ADR及MCF-7细胞株的杀伤活性。结果:冻融物DC-CIK组、DC-CIK组细胞增殖活性均大于CIK组(P<0.05)。冻融物DC-CIK组对MCF-7/ADR、MCF-7细胞的杀伤活性在效靶比10∶1、20∶1、40∶1时分别为(44.29±1.39)%、(58.24±3.52)%、(68.9±2.83)%和(33.51±2.18)、(40.43±2.3)%、(44.62±1.19)%,均高于DC-CIK组及CIK组(P<0.05);冻融物DC-CIK组对MCF-7/ADR耐药细胞株的杀伤活性高于非耐药细胞株MCF7(P<0.05);而对于非耐药株MCF-7细胞的杀伤活性,冻融物DC-CIK组和DC-CIK组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:DC与CIK共培养细胞增殖活性和细胞毒活性均强于CIK,经冻融抗原冲击的DC与CIK共培养可以显著提高对MCF-7/ADR耐药细胞株的杀伤活性。     

华蟾素诱导NB4细胞凋亡及其作用机制

目的研究华蟾素(cinobufagin)对人早幼粒白血病细胞株NB4的诱导凋亡作用,并探讨可能的分子机制.方法通过细胞计数观察华蟾素对细胞的生长抑制作用,荧光染色观察细胞凋亡的形态学改变,DNA凝胶电泳观察DNA的片段化改变,流式细胞术定量分析细胞凋亡.免疫荧光结合流式细胞术检测bcl-2表达、半定量RT-PCR检测Fas和FasL的表达.结果与对照组相比,1:100～1:25浓度的华蟾素能明显抑制NB4细胞生长.经华蟾素作用后,NB4细胞出现凋亡典型的形态学改变,核浓聚、核碎裂、凋亡小体形成;DNA电泳出现凋亡特有的"梯子"条带;流式细胞术也证实凋亡的存在.在经1:100、1:50、1:25浓度的华蟾素作用2 d后,细胞凋亡率分别为12.49%、18.53%、37.76%.凋亡细胞的bcl-2的表达下调,Fas表达上调,FasL表达无变化.结论华蟾素能抑制NB4生长并诱导凋亡,可能是通过下调bcl-2的表达,增加Fas的表达来实现.     

DC-CIK过继性细胞免疫治疗对卵巢癌患者的预后及免疫功能的影响

目的:探讨自体DC-CIK细胞疗法改善卵巢癌患者的预后及免疫功能的能力。方法:回顾性分析2014年1月至2015年12月在中国医科大学附属盛京医院均接受了规范的初始治疗、达到完全缓解（CR）的卵巢癌患者90例。分析比较其基本条件、免疫指标、无瘤生存时间及不良反应。结果:经DC-CIK生物免疫治疗的患者外周血CD3+、CD4+细胞百分率,CD3+、CD8+细胞百分率及CD4+/CD8+比值均上升,NK细胞即CD16+、CD56+细胞增多,同时随着疗程数的增多,升高的更加明显（P<0.05）。一线治疗后,单纯观察组平均无瘤生存时间为15.88±2.7个月明显少于DC-CIK生物免疫治疗组的22.5±4.13个月（P=0.039）。其中使用DC-CIK生物免疫治疗疗程≥5程的平均无瘤生存时间为27.25±4.53个月明显高于DC-CIK生物免疫治疗疗程≤4程的19.69±2.81个月,两者相比差异无明显统计学意义（P=0.412）。所有患者DC-CIK细胞治疗后血常规及肝肾功能检测与治疗前及单纯观察组患者相比无明显变化,也未见明显不良反应。结论:DC-CIK免疫治疗提高卵巢癌患者的免疫反应,改善卵巢癌患者预后,未见明显不良反应。     

肺癌患者胸水来源树突状细胞增强CIK细胞的杀伤作用

肺癌是所有恶性肿瘤病死率中增长最快、危害最大的恶性肿瘤之一。由于就诊时多为晚期，即使经手术、化疗及放疗后，患者的生存质量仍难以改变，且预后极差。利用免疫效应细胞治疗作为辅助疗法，消除患者体内残留的肿瘤细胞，可改善患者的生存质量。细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）是一种新型的免疫效应细胞，具有增殖倍数高、细胞毒性强、抗瘤谱广、对化疗耐药细胞株敏感等特点，在肿瘤免疫治疗中有较大价值。DC是目前已知功能最强的抗原提呈细胞，     

术前化疗后结直肠癌组织中Fas/FasL和survivin的表达

目的探讨化疗后结直肠癌组织Fas/FasL和survivin的表达情况及两者之间的相关性。方法采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL法)和免疫组化方法,测定化疗后和未化疗两组各16例结直肠癌患者肿瘤的原位凋亡(AI)、原位增殖(KI)及survivin表达,运用流式细胞仪测定肿瘤细胞的细胞周期、Fas/FasL表达,用双抗体ELISA法检测患者血清可溶性Fas/FasL(sFas/sFasL)表达。结果化疗组结直肠癌患者肿瘤细胞的AI及Fas/FasL均较对照组高,KI、G2/M期细胞、sFas及survivin较对照组低,差别有统计学意义(P<0.05)。结论化疗通过诱导结直肠癌细胞凋亡及阻止细胞进入G2/M期从而抑制癌细胞的生长。Fas/FasL系统与结直肠癌细胞凋亡、增殖调控有关。survivin阳性表达下降程度可作为化疗有效的标志之一。     

γ-干扰素对白血病细胞Fas/FasL系统的调控及凋亡的影响

目的:探讨γ-干扰素(IFN-γ)对白血病细胞Fas/FasL表达的调控及凋亡的影响.方法:应用免疫组织化学方法、TUNEL测凋亡法、细胞培养技术,检测人髓系白血病细胞株HL-60及临床髓系白血病患者单个核细胞的Fas的表达及相关功能,并研究γ-干扰素对之的影响.结果:白血病细胞表达Fas蛋白较正常骨髓细胞低,并能致共同培养的Jurkat细胞发生凋亡;而IFN-γ能提高其Fas蛋白的表达(P＜0.01),且调节作用具有时间、剂量依赖性,并有下调白血病细胞致Jurkat细胞凋亡的能力,且能够增强白血病细胞对Fas途径介导的凋亡敏感性及增强对化疗药物阿糖胞苷的敏感性.结论:IFN-γ能通过对白血病细胞Fas/FasL系统的调控以防止其逃避免疫监视,并能增强白血病细胞对以Fas/FasL为靶标的化疗药物的敏感性.     

树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞联合化疗治疗晚期消化道肿瘤的临床疗效

目的探讨树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)联合化疗治疗晚期消化肿瘤的临床疗效及意义。方法选取2010年3月至2011年2月间收治的100例晚期消化肿瘤患者为研究对象,采用随机抽签分组方法将患者分为观察组和对照组,每组50例。观察组患者采用DC-CIK联合化疗,所有患者均于化疗前采集外周血单个核细胞(PBMC),将其体外培养产生DC-CIK细胞,化疗结束后,输回新产生的合格的DC-CIK细胞。对照组患者则单纯采用化疗,以2周为1个疗程,观察两组患者治疗效果及1、3年生存率。结果观察组患者治疗总有效率为68.0%,明显高于对照组的42.0%,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组患者疾病控制率为82.0%,明显高于对照组的56.0%,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组1、3年生存率分别为92.0%和80.0%,明显高于对照组的76.0%和54.0%,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 DC-CIK联合化疗治疗消化道晚期肿瘤患者具有显著治疗效果,值得临床推广。     

肝癌细胞通过Fas/FasL途径触发T淋巴细胞凋亡的双重阻断研究

目的通过阻断Fas/FasL介导的T细胞凋亡,建立快速制备大量激活的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的方法。方法选择FasL表达阳性的肝癌标本,分离肝癌细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL),然后在体外将两者混合,并在CD28单抗共刺激下,激活制备特异性CTL。应用可溶性Fas受体阻断肝癌细胞通过Fas/FasL途径触发激活T细胞凋亡,与对照组比较用流式细胞仪和DNA ladder Test同时检测阻断凋亡作用,通过3H掺入法和51Cr释放法了解T细胞增殖力及杀伤活性。结果流式细胞术仪检测未阻断组较阻断组和未阻断对照组凋亡率明显升高,未阻断组凋亡率达47．82％±0．13％,对照组静息性T淋巴细胞组为3．76%±0．25％,阻断组为8．22％±0．26％(P<0．01),DNA ladder显示未阻断组T淋巴细胞出现明显梯状条带,阻断组为阴性。51Cr释放法表明阻断后T淋巴细胞杀伤活性增加,较未阻断组及未阻断对照组差异有显著性(P<0．01)。3H掺入法检测证实可溶性Fas受体阻断激活T细胞凋亡后,细胞增殖明显升高,较未阻断组差异有显著性(P<0．01)。结论体外实验可获得大量激活T细胞,并可杀伤肿瘤细胞。