凝血因子FⅧA链基因第1内含子内顺式调节元件的鉴定

探讨FⅧA基因表达的分子机制.凝胶阻滞实验(EMSA)结果证明,FⅧA基因第1内含子5′区的前12碱基与转录因子结合并由此调控基因表达.FⅧA基因第1内含子第12位碱基由C突变为A(内含子1( 12)C→A)导致与转录因子结合能力降低.构建不同的荧光素酶表达质粒Luc1、Luc2、Luc3、Luc4、Luc5、Luc6,并转染U937细胞和HepG2细胞.结果显示,如果Luc5(具有最高表达活性)的内含子1( 12)由C突变为A,启动子活性显著降低.与Luc5相比,突变后的Luc5的活性分别下降了52·9%(U937,P<0·01)和47·6%(HepG2,P<0·01).将Luc5与PN3 Sp1共同转染U937细胞和HepG2细胞后,Luc5的荧光素酶活性分别提高了42·4%(U937,与Luc5单独转染比较P<0·01)和54·9%(HepG2,与Luc5单独转染比较P<0·01),而突变后的Luc5(Mut)与PN3 Sp1共同转染则没有明显的改变.表明转录因子Sp1在FXA基因表达的重要性.这些结果也表明,内含子在FⅧA基因表达过程中起重要作用,为遗传性凝血因子Ⅷ发病机理的研究提供了新的证据.     

二硫键形成促进双载体转断裂B区缺失型凝血因子Ⅷ基因

双载体共转B区缺失型凝血因子Ⅷ(BDD-FⅧ)重链和轻链基因是克服腺相关病毒载体(AAV)容量限制的一种策略, 但重链分泌的低效性产生链不均衡性,影响转基因的功效．假设重、轻链链间二硫键形成可提高双载体转BDD-FⅧ基因的功效,本文将BDD-FⅧ的重链A2区的Met662和轻链A3区的Asp1828突变为Cys．双载体培养的COS-7细胞共转染突变重链和轻链基因,Western blot显示细胞内二硫键交联的重、轻链蛋白形成,ELISA和Coatest分析细胞培养上清的BDD-FⅧ重链分泌量和生物活性,分别为(109 ± 13) μg/L和(0.65 ± 0.12) U/ml,明显高于共转野生型重链和轻链基因细胞((71 ± 11) μg/L和(0.35 ± 0.05) U/ml)．结果表明,链间二硫键形成可提高双载体转BDD-FⅧ基因的功效,为进一步动物体内运用双AAV载体转BDD-FⅧ基因提供了实验依据．     

基于蛋白质反式剪接的双载体凝血Ⅷ因子基因转移

以intein的蛋白反式剪接为工具,研究了运用双载体的真核细胞凝血Ⅷ因子（FⅧ）基因转移,通过翻译后剪接得到完整的功能性FⅧ蛋白.将B结构域大部分缺失（Δ761~1639）的人功能性FⅧ（BDD-FⅧ）cDNA于剪接所需保守残基Ser1657前断裂为重链和轻链,分别与106和48个氨基酸的mini Ssp DnaB intein的N端（IntN）和C端（IntC）编码序列融合,构建一对在质粒pcDNA3.1的强启动子CMV驱动下的真核表达载体.用脂质体共转染至293细胞和COS-7细胞,培养48h后,收集细胞上清,用ELISA检测培养上清中剪接形成的BDD-FⅧ蛋白水平,用Coatest法检测上清的功能性FⅧ生物活性,并用Western blot观察细胞内的BDD-FⅧ蛋白质剪接.结果显示,两种细胞培养上清中有较高水平的剪接BDD-FⅧ蛋白形成,分别达到（137±23）和（109±22）ng/mL,由细胞内和细胞外（培养上清）的剪接共同组成 并检测到培养上清中较高水平的FⅧ生物活性,分别为（1.05±0.16）和（0.79±0.23）IU/mL,包括细胞内、外剪接产物BDD-FⅧ共同形成 细胞总蛋白的Western blot进一步显示共转染后细胞内高效剪接形成的BDD-FⅧ蛋白.表明intein可用于双载体系统真核细胞FⅧ基因转移,并不完全依赖细胞内的剪接产生具有高FⅧ生物活性的BDD-FⅧ蛋白,为进一步在甲型血友病基因治疗研究中应用双腺相关病毒载体（AAV）转运FⅧ基因,克服AAV载体的容量限制提供了依据.     

Met662和Asp1828的Cys突变增强蛋白内含子对共表达的BDD-FVIII因子重链和轻链的剪接

本文旨在通过B区缺失型凝血因子8(BDD-FVⅢ)重、轻链间二硫键形成,改善蛋白质反式剪接效率,提高双载体转BDD FVⅢ基因功效. 将BDD-FVⅢ重链A2区的Met662和轻链A3区的Asp1828突变为Cys,用蛋白内含子融合的重链和轻链基因共转染HEK293细胞,Western印迹检测到细胞内BDD-FVⅢ剪接量的提高以及重、轻链间二硫键的形成,用ELISA和Coatest测得细胞分泌至培养上清的剪接BDD-FVⅢ的量(119±14 ng/mL)和活性(1.06±0.08 IU/mL),明显高于野生型BDD FVⅢ重链和轻链基因共转染细胞的量(81±12 ng/mL)和活性(0.70±0.15 IU/mL);混合培养的转突变重链和轻链基因细胞培养基中剪接BDD FVⅢ的量(17±5 ng/mL)和活性(0.15±0.03 IU/mL),与混合培养的转野生型重链和轻链基因细胞 (分别为21±9 ng/mL和0.18±0.05 IU/mL)相近,反映不依赖细胞机制的蛋白质反式剪接. 结果表明,重、轻链间二硫键形成通过增强蛋白质反式剪接提高双载体转BDD FVⅢ基因的功效. 为进一步运用双AAV载体动物体内转BDD-FVⅢ基因提供了实验依据.     

双载体转重链Tyr664Cys和轻链Thr1286Cys突变体BDD-FⅧ基因

用双载体转运凝血Ⅷ因子基因在甲型血友病基因治疗研究中可克服AAV毒载体容量限制,但存在重链分泌低效和链不均衡性问题。为探索重、轻链间二硫键形成对重链分泌的促进作用,该文用双载体转B结构域大部缺失型FⅧ(BDD-FVⅢ)的重链和轻链基因,将重链的Tyr664和轻链Thr1826突变为Cys,研究了HEK293细胞共转基因后的基因表达、分泌至培养上清的重链量和凝血生物活性。用Western blot检测细胞裂解液结果显示,非还原条件下有明显的二硫键交联的重、轻链蛋白;链特异性ELISA定量检测细胞分泌的重链为(125±29)ng/mL,明显高于共转野生型重链和轻链基因细胞的(75±23)ng/mL;Coatest法显示细胞分泌的凝血活性为(0.78±0.29)U/mL,也明显高于共转野生型重链和轻链基因细胞(0.34±0.12)U/mL。结果表明,重、轻链间的二硫键形成可提高双载体转FⅧ基因的功效,为进一步在动物体内转基因提供了实验依据。     

vWF-ΔPro改善基于蛋白质剪接的双载体BDD-FVIII基因转移

多聚体von Willebrand因子(vWF)的功能之一是保护凝血Ⅷ因子(FⅧ)免受蛋白水解引起的快速清除．前肽缺失突变体vWF (vWF-ΔPro)不能形成多聚体,但可以结合FⅧ蛋白．为探讨vWF-ΔPro对基于蛋白质反式剪接作用介导的双载体转FⅧ基因后连接的FⅧ蛋白的分泌和活性的影响,将vWF-ΔPro基因和融合Ssp DnaB内含肽的B结构域缺失型FⅧ(BDD-FⅧ)断裂基因共转染293细胞进行转基因的瞬时表达,用Western印迹检测了单独转染vWF-ΔPro基因细胞的vWF-ΔPro表达量和蛋白形式,并检测了其对FⅧ的结合力;用ELISA法观察分泌至培养上清中的剪接的BDD-FⅧ,并用Coatest法检测由其产生的生物活性．结果显示,vWF-ΔPro转基因细胞呈现二聚体蛋白表达形式,其结合FⅧ的能力与转野生型vWF基因细胞相近;vWF-ΔPro共转染细胞上清中剪接BDD-FⅧ蛋白浓度为198±21 ng/mL,活性为1.78±0.18 IU/mL,明显高于未转染vWF-ΔPro基因的细胞对照(91±12 ng/mL和1.05±0.13 IU/mL),与共转染野生型vWF基因细胞对照相近(221±19 ng/mL和1.95±0.22 IU/mL),表明vWF-ΔPro可显著改善内含肽剪接的BDD-FⅧ蛋白的分泌和生物活性．为vWF-ΔPro转基因的基于蛋白质剪接技术双AAV载体转BDD-FⅧ基因动物体内实验提供了依据．     

成纤维细胞生长因子受体3胞外配体结合区的重组表达及其与A型肉毒毒素重链C端的相互作用

目的:实现成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)胞外配体结合区FGFR3D23的表达与纯化,并鉴定其与A型肉毒毒素重链C端(Bo NT/AHc)的相互作用。方法:全基因合成的FGFR3D23基因片段经酶切连入p TIG(+)质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后IPTG诱导表达,获得的包含体经Ni2+柱纯化,透析复性后通过pull-down及ELISA检测纯化蛋白与Bo NT/AHc的相互作用。结果与结论:SDS-PAGE分析结果显示得到相对分子质量约27×103的蛋白特异表达条带,表达量为1.39 mg/L,包含体占73.4%;纯化和复性得到的目的蛋白纯度约96%,复性率约3%;pull-down及ELI-SA实验结果证明FGFR3D23可以与Bo NT/AHc特异性地相互作用。