LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

为构建人LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达及定位,通过基因重组的方法构建LMP3／pEGFP-N3重组真核表达载体,并通过酶切和基因测序鉴定。脂质体法转染HEK293细胞,用倒置荧光显微镜检测、分析其在HEK293细胞表达及定位。经酶切和基因测序鉴定LMP3／pEGFP-N3重组真核表达载体构建成功。转染HEK293细胞后,荧光显微镜检测显示融合蛋白仅在细胞浆中表达。说明基因重组技术可成功构建LMP3／pEGFP-N3重组体真核表达载体,重组表达的融合蛋白仅存在于细胞浆内。     

构建重组质粒pEGFP-N1-ND CyclinB1及在胃癌细胞SGC-7901中的表达

目的:构建真核表达载体pEGFP-N1-ND CyclinB1,并观察其在人胃癌细胞SGC-7901中的表达及对SGC-7901活性的影响.方法:通过RT-PCR法扩增不可降解CyclinB1(ND CyclinB1),将其插入到pEGFP-N1载体的XhoⅠ和BamHⅠ酶切位点,构建真核表达载体pEGFP-N1-ND CyclinB1,并以PCR、双酶切、测序鉴定.通过脂质体法转染胃癌细胞SGC-7901,进行荧光检测、Western blotting分析和流式细胞仪分析.结果:PCR、酶切及测序证明重组质粒pEGFP-N1-ND CyclinB1构建成功.转染胃癌细胞SGC-7901 24 h后,荧光显微镜下观察到绿色荧光.Western blotting检测到CyclinB1的表达明显增加.流式细胞仪检测重组质粒细胞组凋亡指数高于对照组,差异有显著性.结论:成功构建pEGFP-N1-ND CyclinB1荧光真核表达载体,并可在SGC-7901细胞中有效表达.     

透明质酸合成酶2真核表达载体的构建及表达

构建了透明质酸合成酶2真核表达载体,并观察其在真核细胞中的表达。利用RT-PCR法从MG63细胞总RNA中扩增,获得人透明质酸合成酶2cDNA,并克隆至真核表达载体pEGFP-N3,将经双酶切鉴定和DNA测序证实的阳性重组子命名为pEGFP-N3-HAS2。脂质体法转染HEK293细胞,用倒置荧光显微镜检测、分析其在HEK293细胞表达及定位。双酶切鉴定和DNA测序证实成功构建pEGFP-N3-HAS2真核表达载体。转染HEK293细胞后可见HAS2-EGFP融合蛋白高表达并定位于浆膜。该载体的成功构建为进一步探讨透明质酸合成酶2在治疗骨性关节炎、修复关节软骨缺损中的应用价值奠定了基础。     

人PSF真核表达载体构建及其在CHO细胞中的表达

目的是构建人PSF基因真核表达载体pEGFP-N1-PSF,并在检测其在CHO细胞株中的表达情况。应用DNA重组技术和PCR方法从人宫颈癌Hela细胞中扩增PSF基因,插入pEGFP-N1真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-N1-PSF并测序鉴定。将pEGFP-N1-PSF瞬时转染CHO细胞,通过Western blot和RT-PCR方法检测PSF的表达,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果 CHO细胞转染pEGFP-N1-PSF真核表达载体后,RT-PCR和Western blot实验发现,在RNA和蛋白水平有PSF的表达,在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP/PSF的表达。成功构建pEGFP-N1-PSF真核表达载体,证实其在CHO细胞中可以表达。     

小鼠T细胞发育相关基因RS21-C6的表达谱及其编码蛋白的细胞内定位

研究了小鼠T细胞发育相关基因RS21-C6的表达谱及其在细胞内的定位.提取小鼠8种组织及处于5个发育阶段的胸腺细胞总RNA,逆转录成cDNA后,利用RS21-C6基因特异性引物,观察了RS21-C6基因的表达;同时构建pEGFP-N3/RS21-C6重组表达载体,在激光共聚焦荧光显微镜下观察了细胞内荧光分布.RT-PCR结果表明RS21-C6基因在所检测的组织和细胞中除骨骼肌和CD4SP胸腺亚群外均有不同程度的表达.激光共聚焦荧光显微镜观察结果表明,RS21-C6-GFP(绿色荧光蛋白)融合蛋白表达在胞浆内,RS21-C6-GFP融合基因的瞬间和稳定表达均获得了相同结果.     

结核分枝杆菌HSP65-IL-2融合基因疫苗的构建及表达

构建结核分枝杆菌HSP65-IL-2融合基因疫苗,并对其在体外真核细胞中进行表达。用EcoRV和Hindm双酶切合HSP65-IL-2融合基因的pPaO-hsp65-IL-2载体,回收目的基因片断HSP65-IL-2,并将其亚克隆入同样双酶切的真核表达载体pcDNA3．1（-）中,重组质粒酶切鉴定正确后以脂质体瞬时转染COS-7细胞,并通过间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。重组真核表达质粒酶切后可获得约2067bp的融合基因HSP65-IL-2片段,间接免疫荧光检测重组质粒转染的COS-7细胞,可在细胞胞浆中看到特异性的绿色荧光。成功地构建了结核分枝杆菌HSP65-IL-2融合基因的真核表达载体,且该重组载体可在体外真核细胞中获得特异性的表达。     

LC3真核表达载体构建及其在293T细胞中自噬诱导研究

【目的】构建pEGFP-N1-LC3真核表达载体,并将其转染进人胚肾细胞293T,通过Earle's盐平衡液(Balanced salt solution,EBSS)饥饿诱导观察细胞自噬现象。【方法】RT-PCR扩增LC3基因,并将其插入pEGFP-N1真核表达载体构建重组质粒。将重组质粒转染至人胚肾细胞293T,显微镜观察、Western blot检测GFP-LC3融合蛋白表达情况。对转染细胞进行Earle's盐平衡液饥饿诱导,通过Western blot验证自噬指标,激光共聚焦显微镜观察自噬泡形成。【结果】成功构建pEGFP-N1-LC3真核表达载体,并在293T细胞中成功表达目的蛋白,在进行Earle's盐平衡液饥饿诱导后观察到自噬泡的形成,Western blot检测到LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化。【结论】本实验为研究自噬在癌细胞病理进程中的机制提供了实验素材。     

绿色荧光蛋白标记的NTE活性域表达载体的构建及表达

利用含有特定限制性内切酶识别位点的引物,通过聚合酶链式反应扩增出人神经病靶标酯酶活性域的编码序列,经T载体克隆测序正确后,双酶切回收特异片段定向插入到增强型绿色荧光表达载体pEGFP-N3中,通过酶切反应鉴定,构建了绿色荧光蛋白标记的神经病靶标酯酶活性域的融合表达载体pNEST-EGFP.采用脂质体转染的方法将其转染到人神经瘤母瘤细胞SH-SY5Y中,用荧光显微镜观察发现神经病靶标酯酶活性域分布于细胞质中,而且没有导致内质网膜的聚集,表明表达载体成功构建和表达.     

Construction of Eukaryotic Expression Vector of Human PSF and Identification of its Expression in CHO Cell Line

目的是构建人PSF基因真核表达载体pEGFP-N1-PSF,并在检测其在CHO细胞株中的表达情况.应用DNA重组技术和PCR方法从人宫颈癌Hela细胞中扩增PSF基因,插入pEGFPNL真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-N1-PSF并测序鉴定.将pEGFP-N1-PSF瞬时转染CHO细胞,通过Western blot和RT-PCR方法检测PSF的表达,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达.结果CHO细胞转染pEGFP-N1-PSF真核表达载体后,RT-PCR和Western blot实验发现,在RNA和蛋白水平有PSF的表达,在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP/PSF的表达.成功构建pEGFP-N1-PSF真核表达载体,证实其在CHO细胞中可以表达.     

人脑微血管内皮细胞ACTG1基因真核表达载体的构建及表达

为了构建人脑微血管内皮细胞ACTG1基因的真核表达载体及在HEK293细胞中的表达,本研究采用RT-PCR方法,以单增李斯特菌侵染的人脑微血管内皮细胞提取的总RNA为模板,扩增ACTG1基因片段,TA克隆后经Sal I和Eco R I双酶切、测序等鉴定重组质粒,重组质粒再经双酶切,与真核表达载体p ACGFP连接,酶切鉴定后,Lipofactamine 2000转染HEK293细胞,荧光显微镜检测绿色荧光;同时采用Western-blotting对表达产物进行了鉴定。结果表明:PCR扩增得到1128 bp的ACTG1基因片段,ACTG1-p ACGFP真核表达载体构建成功,转染24 h后,在荧光显微镜下可见绿色荧光,Western-blotting检测分析,其分子量约为68 k Da的融合蛋白,与预期的大小相符合,表明重组蛋白表达成功,本研究为单增李斯特菌与脑微血管内皮细胞c DNA文库中相互作用蛋白的筛选和鉴定奠定了基础。     

关于农业区划地图集中的统一协调问题

图集的统一协调,对图集质量有很大影响。本文是作者在编制北京市农业区划地图集的实践基础上,根据地图信息传输论的观点,对农业区划地图集的统一协调的内容及方法进行了探讨。试图总结编制这类图集的统一协调模式,以供读者编图时参考。     

圈幂补图的树宽

基于“前沿分支”的观点研究了圈幂补图的树宽，首先确定了它的树宽下界，又给出了达到此下界的标号，从而得到了它的树宽表达式。     

鸡法氏囊病及其防治

报告鸡法氏囊病的流行状况，主要症状，剖检情况及诊断，提出了综合性防治措施。     

“真空的真空”的存在性问题

许多科学家包括诺贝尔奖获得者李政道教授都预言,真空是未来物理学的一个重要研究对象.十七世纪的伽利略时代人们曾讨论过"真空"是否存在的问题.当时的学术界分成两派,一派以帕斯卡为代表,认为真空存在,另一派以笛卡尔为代表,认为真空不存在,最后实验证明"真空存在派"正确.现代研究表明,真空并非一无所有,这样就产生了一个新的问题"排除了真空物质后的空间",即"真空的真空"是否存在.本文探讨了与"真真空"有关的问题,提出了一些观测实验方法,这些方法可以帮助我们最终解答"真真空"的存在性问题.     

民间法正义观的转型

研究了国家法的抽象正义观与民间法的情理正义观,认为西方国家法的抽象正义观与东方民间法的情理正义观存在实质的不同,原因在于思维方式、超验与经验传统、政治结构的差别。在现代法治理念下,传统民间法所代表的正义观将向混合正义观转型,西方法治所代表的国家法抽象正义观是其骨架。     

接受美学的期待之路——读者接受与文学的创新

文学发展的动力之一在于创新。在接受美学诞生之前,学者们往往从作家的角度讨论文学创新问题。本文用接受美学的理论探讨文学创新的问题。笔者将文学创新的标准与读者接受相结合,就创新的三个方式与期待视野的方法论进行了初步的探讨。最后得出的结论是:读者期待视野的提高是作家作品创新的主要依据,作家在文学创作中应该充分考虑读者的接受才能做到创新。     

人-自观念演进的否定之否定

在人与自然界的关系的演进过程中,形成了与不同文明时期相适应的人-自观念。从＂天人合一＂到＂人定胜天＂再到＂和谐共生＂,这是人-自观念演进的肯定、否定、否定之否定的辩证发展过程,也是一个合乎规律的过程,它们都是时代的产物,都包含着不同程度的合理的因素,我们必须对它们进行具体的辩证的分析。     

行政机关违法设定许可的法律责任探析

对于行政许可违法的法律责任问题，人们往往是从行政许可实施违法的角度进行研究，而对于设定违法及其责任追究的探讨却相对薄弱。然而。行政许可设定一旦违法，其对相对人和社会公共利益的损害将会更大，因此，对许可设定的违法及其责任问题进行研究，以避免违法行政行为的发生，促进政府依法行政，不仅必要而且是非常有意义的。     

曲面"侧"概念的"参照物"理解法

曲面“侧”是一个重要而难以理解的概念,本文对曲面“侧”概念的讲授方法进行了探讨,给出了曲面“侧”概念的“参照物”理解法,通过实践证明,效果良好。