Cx43基因敲除胎鼠心脏近端流出道隔心肌化过程中的关键基因

 目的 研究Cx43基因纯合敲除（Cx43-/-）小鼠胚胎心脏近端流出道组织中基因表达谱的改变,筛选可能导致Cx43-/-小鼠流出道梗阻的关键基因。方法 以胎龄（embryonic day,ED）14.5的Cx43-/-和野生型（Cx43+/+）鼠胚心脏近端流出道部分为研究对象,分别提取总RNA,逆转录成cDNA,并在体外转录为cRNA,同时进行生物素标记及片段化,再与Affymetrix-430 2.0基因芯片进行杂交。杂交信号经扫描后,应用相关生物信息软件分析基因表达情况。结果 与Cx43+/+组相比,Cx43-/-组中表达上调2倍以上的基因共有143个,表达下调2倍以上的基因有235个。其中表达差异的基因参与转录调控、细胞周期、细胞黏附、细胞活动和细胞骨架的信号通路等主要生理过程。进一步筛查表达差异1.5倍以上的基因发现,与圆锥动脉干畸形相关的TGFβ/BMP信号通路上的多个基因以及Ssr1、Ptk2、Bmp6等基因在Cx43-/-组有明显变化。对这些基因进行荧光定量PCR验证,结果与基因芯片一致（P<0.05）。结论 利用基因芯片技术初步筛选出与Cx43-/-鼠胚心脏近端流出道发育有关的多个基因,并经荧光定量PCR验证。其中TGFβ/BMP信号通路上的多个基因以及Ssr1、Ptk2、Bmp6等基因可能与Cx43-/-小鼠流出道梗阻的发生有关。     

连接蛋白40、45在连接蛋白43基因敲除小鼠胚胎心脏的时空表达

目的 检测连接蛋白(Cx)40、45在Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏的时空表达.方法 选取Cx43基因敲除胎鼠,通过PCR方法鉴定其基因型,以Cx43基因敲除胎鼠纯合子作为研究对象,野生型为对照组,获取胎龄10.5、11.5、12.5、13.5、14.5、15.5 d纯合子及野生型各2只胎鼠,免疫组化检测Cx40、Cx45在心脏各部位的表达,SCIM显微图像分析系统对染色强度进行定量分析.结果 (1)野生型小鼠心室原始小梁网在胎龄10.5 d就已经有Cx40表达(A值为8.6),随后在心房、心室、小梁网、房室间隔和主、肺动脉壁表达逐日增加,胎龄14.5 d在心室部位达到高峰(A值为94.8),然后逐渐减少;Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏发育中Cx40在各部位的时空表达趋势与野生型相似,胎龄10.5 d在肌小梁A值为7.9,胎龄14.5 d心室部位为75.8.纯合基因敲除型胎鼠Cx40的表达量明显弱于野生型.(2)野生型小鼠肌小梁部在胎龄10.5 d出现Cx45的表达(A值为20.0),随后在房室各部位相继表达,胎龄12.5 d在心房部位达到高峰(A值为49.6),然后表达逐渐减少;Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏发育中Cx45在各部位的时空表达趋势与野生型相似,胎龄10.5 d在肌小梁A值为17.8,胎龄12.5 d心房部位为31.5.纯合基因敲除型胎鼠Cx45的表达量明显弱于野生型.结论 Cx40和Cx45在Cx43基因敲除小鼠纯合子胎龄10.5～15.5 d这一心脏分隔、瓣膜发育的关键时期表达异常,可能与Cx43基因敲除小鼠心脏的异常发育有关.     

扩张型心肌病患者心肌Cx43基因的表达

目的探讨晚期扩张型心肌病(DCM)患者心肌连接蛋白43(Cx43)基因表达水平及其意义。方法 DCM病例及标本是2002～2003年华中科技大学同济医学院附属同济医院对4例晚期DCM患者进行心脏移植手术切除心脏的心肌;其中男2例、女2例,年龄分别为14、44、45和55岁。对照组4例为同期颅脑损伤和毒品中毒致死者,均为男性,年龄分别为24、29、30和37岁;死因为颅脑损伤3例、毒品中毒1例。每例心脏进行常规病理学检查并取材后,应用逆转录PCR技术定量检测左心室心肌Cx43基因表达水平,并进行比较分析。结果 DCM患者心肌Cx43基因定量检测结果为(0.188±0.167),对照组为(0.440±0.096),两组比较差异有统计学意义(P=0.025)。结论晚期DCM患者心肌Cx43基因表达水平下降,这种心肌Cx43基因表达水平下降可能与DCM患者发生心衰、心律失常和猝死有关。     

Cx43基因剔除小鼠心脏锥干部的异常发育

目的探讨Cx43基因缺陷小鼠心脏锥干部发育异常。方法选用胚胎（embryonic day,E）11．5d至出生后1dC57／BL6小鼠作为研究对象,根据基因型分为Cx43基因剔除纯合子（Cx43-／-）、杂合子（Cx43＋／-）及野生型（Cx43＋／＋）,采用聚合酶链反应方法鉴定基因型。免疫组化法测定横纹肌肌动蛋白α-SCA、平滑肌肌动蛋白α-SMA、神经嵴细胞的标志物AP-2α的表达;原位杂交方法检测AP-2α mRNA的表达。结果Cx43-/-出生后24h内即死亡。大体解剖见明显的右室流出道圆锥部异常膨隆。HE染色示右心室流出道壁大量异常小梁状组织增生突起,右室流出道腔明显狭窄。Cx43＋／-无明显异常。Cx43-／-近端流出道隔中央区域α-SCA的表达明显滞后。Cx43＋／-与Cx43-／-小鼠右室流出道与Cx43＋／＋比较可见比较强的α-SMA的表达,主要位于右侧锥干部的异常增生部位。Cx43-/-小鼠在E13．5流出道隔AP-2α蛋白及其mRNA水平表达均增多,且表达位置异常。结论Cx43 KO小鼠以右室流出道异常增生引起的梗阻性畸形为主要特征。Cx43 KO小鼠胚胎期近端流出道隔心肌化迟滞。Cx43 KO小鼠锥干部α-SMA的表达不能正常消退,心肌细胞发育不成熟。神经嵴细胞的发育异常可能参与了Cx43基因缺陷小鼠锥干部畸形的发病机制。     

连接蛋白43基因敲除小鼠胚胎心脏流出道组织中转录因子的表达及意义

目的 研究连接蛋白43（Cx43）基因敲除小鼠胚胎心脏近端流出道组织中转录因子的改变,从分子水平探讨Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏近端流出道发育异常的原因。方法 以胎龄13．5d和14．5d的Cx43基因敲除、Cx43杂合子和Cx43野生型鼠胚心脏近端流出道部分为研究对象。分别提取总RNA,反转录成cDNA;并在体外转录为cRNA,同时进行生物素标记及片段化;再与Affymetrix 4302．0小鼠全基因组芯片进行杂交。杂交信号经扫描后,应用相关生物信息软件分析基因表达情况。用实时定量逆转录（RT）PCR的方法对基因芯片筛选出的与心脏发育相关的部分转录因子进行验证。结果 与Cx43野生型组相比,Cx43基因敲除组表达差异的基因中,有6个是与心脏发育相关的转录因子。实时定量RT—PCR验证了其中3个基因：Soxll、Foxpl和Tbx20。在胎龄13．5d,Cx43基因敲除鼠胚Sox11、Foxp1的表达量均明显低于Cx43野生型组（4．76±0．19 vs 5．34±0．25,5．08±0．28 vs 5．64±0．15,均P〈0．01）;Tbx20在各组间差异不明显。胎龄14．5d,各基因Sox11、Foxp1以及Tbx20的表达量在基因敲除组均明显低于Cx43野生型组（4．71±0．27 vs 5．00±0．19,5．25±0．31 vs 5．77±0．16,7．05±0．17 vs 7．43±0．25,均P〈0．05）。其变化趋势与基因芯片结果基本一致。结论 心脏特异性的转录因子Foxp1、Sox11和Tbx20等的表达异常可能与Cx43基因敲除小鼠流出道的异常发育有关。     

Connexin43基因缺陷新生小鼠心脏组织病理学研究

目的观察不同程度Connefin43基因缺陷对新生小鼠心脏发育的影响。方法采用Cx43基因敲除(Cx43 KO)和CMV43^CT两种Cx43基因缺陷的小鼠模型,聚合酶链反应鉴定基因型。然后将新生小鼠心脏分离固定,HE染色观察心脏的形态结构。普通C57BL6／SJ小鼠作为对照。结果所有11只纯合型Cx43 KO小鼠生后1d内均死亡,心脏表现为严重右室流出道梗阻。在20只纯合型CMV43^CT新生小鼠中,有12只生后2d内死亡,其心脏不仅表现有右室流出道梗阻,还出现了房间隔缺损、室间隔缺损等其他心脏畸形;而另外8只未见心脏异常。所有杂合型Cx43 KO和CMV43^CT基因缺陷的小鼠生后均存活,心脏病理学检测未见异常。结论Cx43基因缺陷与心脏发育异常有密切的关系,但不同类型和不同程度的Cx43基因功能缺失对心脏发育的影响也不尽相同。     

Cx43基因敲除鼠胚心脏近端流出道组织中Galpha13信号通路基因的差异表达

目的研究两种常用麻醉剂戊巴比妥钠和氨基甲酸乙酯对小鼠海马CA1区神经元电活动的影响,探讨在麻醉剂作用前后,小鼠海马脑区场电位和神经元放电变化的活动规律。方法运用多通道在体记录技术,分别在5只雄性C57BL小鼠双侧海马CA1区植入12组金属电极,并记录麻醉过程中海马CA1区单个神经元的放电活动以及相应脑区场电位的活动状况,并加以分析。结果(1)戊巴比妥钠和氨基甲酸乙酯麻醉作用过程中,小鼠海马CA1区脑电场电位变化有明显特征。(2)海马CA1区神经元在不同麻醉剂作用下放电频率变化具有规律性。结论小鼠海马CA1区脑电场电位在不同麻醉剂作用下有不同的变化规律,不同类型的神经元在不同麻醉剂的作用下其放电频率的变化也有所不同,提示不同麻醉剂对海马神经元的电活动有不同的作用机制。     

心肌连接蛋白Cx43在冠心病心肌梗死病例中的表达

目的:观察冠心病猝死伴心肌梗死时缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)的分布特征,探讨Cx43在冠心病伴心肌梗死的变化规律及其诊断意义。方法:运用免疫组化和图象分析技术,观察实验组冠心病猝死伴心肌梗死者心室肌梗死区、梗死区边缘和非梗死区Cx43分布情况。结果:冠心病猝死伴心肌梗死患者中不同心肌部位的缝隙连接蛋白Cx43阳性表达差异性较大,部分梗死中心区Cx43已完全消失,而部分梗死中心区Cx43有极少部分蛋白发生了重新分布;在梗死边缘带绝大部分Cx43已消失,只有极少数Cx43分布于心肌细胞侧-侧相接处;在非梗死处心肌基本正常,但细胞闰盘的Cx43阳性严重崩解破坏,而重新分布于细胞侧-侧相接处。结论:冠心病猝死伴心肌梗死时心肌梗死病灶及其邻近区域Cx43的数量及分布的高度不均一性是发生猝死性心律失常的结构基础,同时表明在诊断冠心病猝死伴心肌梗死时,脱磷酸化Cx43具有非常重要的诊断价值。     

骨折愈合过程中骨形态发生蛋白1,2,3基因的动态表达

目的　通过观察骨折愈合过程中三种 BMP(1,2 ,3)基因表达量的动态变化 ,明确此三种 BMP是否参与正常骨折愈合过程 ,以及作用时限 .方法　将 48只新西兰兔左前肢桡骨中段制成骨折模型 ,术后随机分为 6个时间组 ,分别于术后1,2 ,3,4,6 ,8wk在骨折处取材 ,分别用 BMP1,2 ,3c DNA作探针进行打点杂交 ,检测 BMP(1,2 ,3) m RNA的表达水平 ,对侧正常桡骨中段作为对照 .结果　 BMP 1,2 ,3三种基因在骨折愈合早期的表达均明显增高 ,峰值位于术后 2 wk,表达量分别为 191,2 85 ,2 13ng· g- 1 ,而正常对照侧分别为 32 ,6 5 ,6 0 ng· g- 1 .结论　 BMP 1,2 ,3均参与骨折的修复过程 ,主要在愈合早期发挥作用     

Gsα在肥厚心肌中的表达及敲除后对心脏发育的影响

目的 通过主动脉缩窄术(transverse aortic constriction,TAC)建立压力超负荷诱导心肌肥厚的小鼠模型,检测肥厚心肌组织中Gsα表达变化,同时构建诱导性心肌特异性Gsα缺失小鼠,观察Gsα缺失对幼鼠心肌发育的影响.方法 10只健康雄性C57BL/6小鼠,按随机数字表法分为手术组(TAC组,n...     

Downregulation of Rho associated coiled-coil forming protein kinase 1 in the process of delayed myocardialization of cardiac proximal outflow tract septum in connexin 43 knockout mice embryo

Background  The connexin43 knockout (Cx43 KO) mouse dies at birth with an enlarged conotruncal region, which leads to the obstruction of the right outflow tract (OFT). Since myocardialization of the proximal OFT septum is one of the key events during heart development, we investigated the process in the Cx43 KO embryo hearts. Rho associated coiled-coil forming protein kinase 1 (ROCK1), is a recently found key molecule to regulate the myocardialization of OFT, but its spatiotemporal expression pattern during myocardialization remains unknown. The objective of this study was to investigate the differentially expressed pattern of ROCK1 between Cx43 KO and wild type embryo hearts, and its relationship with the delayed myocardialization in Cx43 KO embryo hearts.

Methods  Using immunohistochemistry, the processes of myocardiolization were investigated both in Cx43 KO and wild type embryo hearts. The differentially expressed pattern of ROCK1 between Cx43 KO and wildtype embryo hearts was evaluated both at the mRNA and protein level by real-time RT-PCR and immunohistochemistry.

Results  The expression of α-sarcomeric actin (α-SCA) in the proximal OFT septum of Cx43 KO embryos was delayed. Meanwhile, it was shown that the downregulation of ROCK1 coincided with delayed myocardialization. The expression of ROCK1 protein was mainly limited to the proximal outflow tract septum from embryo day (E) E11.5 to E15.5. Its expression pattern was similar with that of α-SCA. Real-time RT-PCR found that the expression level of Rock-1 mRNA began at a low level on E11.5 and reached peak at E13.5 and E14.5.

Conclusions  ROCK1 may have an important role in the process of myocardialization of the proximal OFT septum. Downregulation of ROCK1 is likely to contribute to the aberrant myocardialization in Cx43 KO embryo hearts.

     

CON43蛋白及mRNA在子宫内膜异位症中表达及意义

目的:探讨间隙连接蛋白CON43mRNA及蛋白在子宫内膜异位症中的表达及意义.方法:对20例子宫内膜异位症内膜用免疫组化法检测CON43蛋白的表达,用RT-PCR检测其mRNA表达,并与21例其他良性疾病子宫的内膜进行比较.结果:CON43蛋白主要在内膜腺上皮细胞浆中表达,内异症组中CON43蛋白表达较对照组显著降低;且内异症组中CON43mRNA较对照组显著降低.结论:子宫内膜异位症中间隙连接蛋白CON43在mRNA水平和蛋白水平较对照组显著降低,可能是导致内膜上皮细胞间的物质和信号传递减低或缺失,内膜细胞在它处游走、粘附的重要原因.     

人重组骨形成蛋白2作用下人牙周膜细胞Osterix的表达变化

目的 观察人重组骨形成蛋白2(rhBMP-2)作用下,人牙周膜细胞内Osterix(Osx)mRNA和蛋白的表达变化,初步探讨牙周膜细胞成骨分化过程中BMP-2与Osx的信号传递途径.方法 组织块法培养人牙周膜细胞至3代.用含rhBMP-2的培养液,按照不同浓度、不同时间分组进行培养,后采用实时定量反转录(Real-time RT)-PCR和Western印迹法分别检测各组细胞Osx mRNA和蛋白表达变化.选用SB203580抑制细胞p38磷酸化,检测rhBMP-2诱导过程中磷酸化p38(pp38)蛋白、Osx mRNA表达及细胞矿化反应变化.结果 在rhBMP-2持续作用下,人牙周膜细胞内Osx mRNA表达明显升高并具有时效性;Osx蛋白表达从无到有,并逐渐增强.当rhBMP-2浓度≤200μg/L时,Osx mRNA和蛋白表达呈现为剂量依赖性增强;当rhBMP-2＞ 200 μg/L时,Osx表达趋于平缓.在p38抑制剂SB203580干扰下,rhBMP-2对p-p38及Osx的诱导增强作用被显著抑制(OsxmRNA表达:0.378±0.034比0.134±0.027,Osx蛋白表达:0.353±0.024比0.155±0.031,均P＜0.01),矿化结节形成亦相对较少且滞后.结论 BMP-2对Osx具有显著正向调控作用,p38途径是此信号传递过程中的一个重要环节,BMP-2/p38/Osx通路可能是牙周膜细胞成骨分化过程中的一条重要信号通路.     

骨形成蛋白在胫骨截骨快速延长成骨过程中的表达及意义

目的:探讨快速延长成骨过程中骨形成蛋白(BMP)的表达及意义. 方法: 制作兔胫骨截骨快速延长动物模型,分别于延长第5, 10, 15, 20, 30和40日在延长区取材,以抗骨形成蛋白单克隆抗体(BMP-McAb)行SP法免疫组化染色光镜观察. 结果: 在骨延长的整个过程中均有BMP的表达,不同时相BMP表达的部位不同. 除炎症细胞、类骨样组织及骨小梁外,几乎所有细胞及组织均有BMP存在. 间充质细胞、软骨细胞、成骨细胞、骨细胞、骨髓细胞BMP呈高表达. 结论: BMP在骨延长成骨过程中发挥着重要作用. BMP表达量不足可能是导致快速骨延长骨不连接的重要因素.     

新生猪缺氧后心肌连接蛋白Cx43表达的变化

目的探讨新生猪缺氧后心肌连接蛋白Cx43 mRNA和蛋白含量的变化。方法对照组(C组):新生猪6头,未吸入低氧;缺氧组(H组):新生猪6头,吸入低氧(FiO2=0.1)维持1 h。于缺氧结束后5 h,免疫荧光染色检测心肌组织细胞缝隙连接蛋白Cx43蛋白的表达,实时荧光定量逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)检测心肌组织Cx43 mRNA的表达。结果H组心肌组织Cx43蛋白的表达显著低于C组(P<0.01),但两组心肌组织Cx43 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论缺氧可导致心肌Cx43蛋白的表达或分布发生变化。     

间隙连接蛋白connexin43基因在真核细胞中的表达

目的：构建携带间隙连接蛋白connexin43 cDNA的真核表达载体,建立connexin43蛋白高表达细胞株。方法：connexin43 cDNA在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体pEN4,转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞,用甲氨喋呤（MTX）筛选得到connexin43基因高表达细胞。结果：酶切电泳结果显示载体pED4-Cx43按设计构建。经MTX筛选得到不同抗性的CHO细胞,免疫组织化学方法显示有connexin43蛋白的表达,但表达量有限。细胞间染料传递实验证实不同MTX抗性的CHO细胞间传递小相对分子质量物质的能力有差异。结论：利用载体pED4可以使connexin43基因在真核细胞内表达。