IL-1β对人牙周膜纤维细胞ALP活性的影响

本实验中作者定量研究了人基因重组型IL—1对人体牙膜纤维细胞活性的影响,目的在于探讨IL-1β在尖周病,牙周病修复过程中的作用。结果显示,该细胞经IL-1β作用后,ALP活性显著低于空白对照组,随IL-1β作用浓度加大,ALP活性降低更力口显著。表明,IL-1β对人牙周膜衔纤维细胞的ALP活性有显著抑制效应,在尖周,牙周病变修复过程中可能具有阻碍硬组织钙化的作用。     

IL-1β对人牙周膜纤维细胞DNA合成功能的影响

作者研究了人基因重组型IL-1β对人牙周膜纤维细胞DNA合成功能的影响,发现牙周膜纤维细胞经IL-1β作用后,DNA合成量显著增多,随着IL-1β作用浓度的加大该细胞DNA合成的量随之逐渐增加。本结果表明,IL-1β能促进牙周膜纤维细胞的DNA合成,其促进作用有显著地浓度效应。     

IL-1β对人牙周膜纤维细胞的c-myc基因表达的调节

作者在研究了IL-1β对人牙周膜纤维细胞(humen periodontal ligament fi broblast,HPLF)DNA合成功能调节作用的基础上,采用核酸杂交,分子探针技术,动态观察了IL-1β(100u/ml)对该细胞的c-myc基因表达的影响,以期从基因水平探讨IL-1β促进人牙周膜纤维细胞DNA合成的作用机理以及IL-1β与尖周病、牙周病发病、修复的相互关系。结果发现,HPLF经IL-1β处理后,c-mgc基因表达信号显著增强。表明IL-1β具有促进HPLF的c-myc基因表达的作用;IL-1β诱导HPLF的DNA合成可能主要作用于细胞分裂的GO/G_1期;IL-1β在尖周病,牙周病的纤维化愈合过程中可能起着一定的积极效应。     

周期性张应力作用下Hippo-YAP信号通路调控人牙周膜细胞自噬

目的 探究周期性张应力（CTS）作用下人牙周膜细胞（hPDLCs）自噬激活的分子机制。方法 分离培养正常牙周组织的hPDLCs,利用Forcel四点弯曲细胞加力仪对hPDLCs加载张应力模拟正畸牙移动过程中正畸力诱导的张力侧hPDLCs自噬,利用XMU-MP-1抑制Hippo信号通路探究Hippo-YAP信号通路在张应力激活hPDLCs自噬中的作用。采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测hPDLCs自噬相关基因（Beclin-1、LC3、p62）的表达;采用蛋白免疫印迹（Western blot）检测hPDLCs自噬相关蛋白（Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62）及Hippo-YAP通路相关蛋白（active-YAP、p-YAP）的表达;采用免疫荧光染色定位hPDLCs自噬相关蛋白（LC3-Ⅱ、p62）及Hippo-YAP通路相关蛋白（active-YAP）。结果 CTS激活hPDLCs的自噬,自噬相关因子表达随加力时间的延长呈先升高后降低的趋势,30 min自噬开始,3 h达到高峰,随后出现下调（P<0.05）;CTS促进active-YAP蛋白表达增加...     

饥饿条件下活性氧通过PINK1/Parkin通路调控人牙周膜细胞的线粒体自噬

目的 探究人牙周膜细胞（hPDLC）在饥饿条件下活性氧（ROS）与PINK1/Parkin通路介导hPDLC线粒体自噬的具体机制。 方法 分离培养正常牙周组织的hPDLSC,利用Earle’s平衡盐溶液（EBSS）模拟饥饿环境诱导hPDLC线粒体自噬,利用N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）抑制ROS生成以探讨ROS在hPDLC线粒体自噬的作用,利用环孢素A（CsA）抑制PINK1/Parkin通路以研究ROS与PINK1/Parkin通路在饥饿条件下激活hPDLC中的作用。采用流式细胞术及JC-1线粒体膜电位检测试剂盒,检测线粒体膜电位;采用透射电镜观察线粒体自噬体的生成及线粒体形态变化;采用线粒体红色荧光探针定位线粒体,溶酶体绿色荧光探针定位溶酶体;采用DCFH-DA ROS荧光探针检测ROS生成强度;采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测细胞中线粒体自噬基因（Tomm20、Timm23）及PINK1/Parkin通路的表达水平,采用蛋白质印迹 （Western blot）检测细胞中线粒体自噬蛋白（Tomm20、Timm23）及PINK1/Parkin通路蛋白表达水平。 结果 EBSS饥饿作用30 min后,诱导激活hPDLC线粒体自噬的作用最强,ROS表达增加,且线粒体自噬相关基因（Tomm20、Timm23）下调（P<0.001）,PINK1/Parkin通路表达上调（P<0.001）。NAC抑制ROS的产生后,自噬被抑制,同时Tomm20、Timm23表达上调（P<0.001,P<0.05）,PINK1/Parkin通路表达下调（P<0.001,P<0.05）。而当CsA抑制PINK1/Parkin通路表达时（P<0.05,P<0.05）,自噬被逆转,同时Tomm20、Timm23表达上调（P<0.001,P<0.01）。 结论 ROS在饥饿条件下主要通过PINK1/Parkin通路增强hPDLC线粒体自噬。     

IL-21通过Notch信号调控人牙周膜细胞RANKL表达和增殖的研究

目的:观察IL-21对人牙周膜成纤维细胞RANKL/OPG的表达以及增殖活性的影响,以及Notch信号通路在其中的作用,探讨IL-21在根尖周炎骨破坏中的作用机制。方法:使用不同浓度(0、10、50、100 μg/L)的IL-21作用于人牙周膜成纤维细胞,并选择最佳刺激浓度IL-21(50 μg/L)处理人牙周膜成纤维细胞,观察不同的时间点(0、12、24 h),通过实时定量PCR和ELISA的方法检测细胞中RANKL/OPG的表达水平。同时使用实时定量PCR和Western-blot检测IL-21对人牙周膜成纤维细胞Notch1表达水平的影响。运用Notch信号的阻断剂GSI(5 μmol/L)预处理人牙周膜成纤维细胞后,再检测IL-21对人牙周膜成纤维细胞RANKL/OPG的表达水平的影响。CCK8法测定各个实验组细胞增殖活性。结果:IL-21可显著提高人牙周膜成纤维细胞RANKL的表达水平,对OPG的表达无显著影响。IL-21显著抑制人牙周膜成纤维细胞的增殖活性。结论:IL-21通过Notch信号通路上调人牙周膜成纤维细胞的RANKL表达,抑制其增殖活性。     

机械激活性离子通道压电蛋白Piezo1通过Notch信号通路介导牙周膜干细胞成骨分化作用机制研究

目的探究机械激活性离子通道压电蛋白Piezo1通过Notch信号通路介导人牙周膜干细胞(h PDLSC)成骨分化作用机制。方法选取自2016年1月1日—2018年1月1日就诊于北京儿童医院正畸科的8～14岁儿童因阻生而拔出的年轻恒牙的牙周膜组织为细胞来源,采用酶消化法对hPDLSC进行提取。采用免疫组织化学染色法检测角蛋白、波形蛋白的表达和流式细胞术对hPDLSC的标志物CD146和STRO-1进行鉴定。构建和筛选siRNA-Piezo1基因干扰载体和Piezo1基因过表达质粒。应用Flexcell 4000T机械牵张应力仪器构建体外牵张力学hPDLSC细胞模型。实验分成5组:siRNA干扰组、过表达组、空白对照组、牵张应力组和阴性对照组。荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测Piezo1、Notch1和成骨基因碱性磷酸酶(ALP)、Runt相关基因2(Runx2)、骨钙素(OCN)和骨涎蛋白(BSP)的表达。Western blot检测成骨标志蛋白ALP和Runx2的表达。Fluo-3 AM探针检测细胞内钙离子含量。结果 h PDLSC波形蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性。流式细胞仪...     

长链非编码RNA AWPPH通过调控Notch信号通路对人牙周膜细胞增殖和成骨向分化的影响

目的：探讨长链非编码RNA(lncRNA)AWPPH通过调控Notch信号通路对人牙周膜细胞增殖和成骨向分化的影响及分子机制。方法：体外培养人牙周膜细胞,并进行成骨分化诱导,使用定量即时聚合酶链锁反应（qRT-PCR）实验检测第0、3、7、14天细胞AWPPH表达水平。将人牙周膜细胞分为空白对照组（NC）、空载体组（vector）、AWPPH过表达组（AWPPH）和过表达AWPPH+通路抑制剂组（AWPPH+DAPT）。qRT-PCR实验检测AWPPH表达水平;噻唑蓝（MTT）、克隆实验检测细胞增殖情况。蛋白质免疫印迹（Western blot）实验检测碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OPN）、骨钙素（OCN）、Notch1和Hes1蛋白表达。采用SPSS 21.0软件包对数据进行统计学分析。结果：牙周膜细胞成骨分化第0、3、7、14天,AWPPH表达水平逐渐降低。过表达AWPPH可增加牙周膜细胞吸光度（A）值、克隆细胞数目,上调ALP、OPN、OCN、Notch1和Hes1蛋白表达。加入通路抑制剂DAPT后,细胞A值、克隆细胞数目降低,Notch1、Hes1、ALP、OPN和OCN蛋...     

IL-1β对人牙周膜成纤维细胞OPG、RANKL mRNA表达的影响

目的:以体外培养的人牙周膜成纤维细胞(HPDLF)为研究对象,观察不同浓度的白细胞介素-1β(IL-1β)对人牙周膜成纤维细胞(HPDLF)中骨保护素(OPG)、核因子κB受体活化剂配体(RANKL)mR-NA表达的影响。方法:组织块法体外原代培养HPDLF并鉴定,以第5代HPDLF作为实验靶细胞,分别用不同浓度(0、0.01、0.1、1、10、100 ng/mL)的IL-1β进行干预,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HPDLF中OPG、RANKL mRNA的表达。结果:IL-1β在0.01～10 ng/mL浓度范围内能明显上调HPDLF中OPG mRNA的表达(P<0.05),并在0.1 ng/mL时上调作用达到最大(P<0.05)。此后,随着IL-1β浓度的增加,OPG mRNA的表达量逐渐减少。IL-1β在0.01～100 ng/mL浓度范围内均可明显上调HPDLF中RANKL、RANKL/OPGmRNA的表达(P<0.05),且呈剂量依赖性,即随着IL-1β浓度增加,HPDLF中RANKL、RANKL/OPG mRNA的表达也逐渐增加,各浓度组两两比较除10 ng/mL与100 ng/mL相比无显著性差异外,其余各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:IL-1β可促进HPDLF中RANKL mRNA的表达,上调RANKL/OPG mRNA的比值。     

炎性牙周膜干细胞通过调控巨噬细胞内质网应激介导白介素-1β分泌的研究

目的:探讨炎性牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cell,PDLSC）对巨噬细胞分泌白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）的影响及其机制。方法:使用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激PDLSC模拟炎性环境。收集健康PDLSC培养基和模拟炎性环境条...     

脂多糖和白细胞介素-1β对人牙周膜细胞中诱导型一氧化氮合酶表达的影响

目的 观察脂多糖(LPS)和白细胞介素-1β(IL-1β)对人牙周膜细胞(hPDLCs)表达诱导型一氧化氮合酶(iGNOS)和一氧化氮(NO)的影响.方法 应用LPS和IL-1β刺激hPDLCs后,通过实时定量PCR检测iNOS基因的表达情况,收集细胞上清液,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定诱导后细胞中iNOS的含量...     

TP对脂多糖介导人牙周膜成纤维细胞细胞间黏附分子-1表达的影响

目的: 检测人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,HPDLF)在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)介导下细胞间黏附分子-1﹙intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1﹚的表达,探讨TP(tea polyphenols,TP)对其表达的影响。方法: HPDLF采用改良组织块法体外培养,将HPDLF随机分成LPS组、TP100组、TP200组,用酶联免疫吸附试验法(enzyme linked immuosorbent,ELISA)检测不同浓度TP对LPS介导下HPDLF分泌ICAM-1的活性。实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time PCR)检测ICAM-1 mRNA的表达。结果: 在LPS干预下,不同时间不同浓度的TP影响下均可抑制ICAM-1分泌,其活性降低,与LPS组比较差异有统计学意义(P<0.05);且ICAM-1 mRNA表达水平显著降低,与LPS组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论: TP对ICAM-1的抑制作用明显,100 μg/mL TP对其的抑制作用更显著,提示TP的抗炎机制可能与抑制ICAM-1有关。     

脂多糖和白细胞介素-1β对人牙周膜细胞中诱导型一氧化氮合酶表达的影响

目的观察脂多糖(LPS)和白细胞介素-1β(IL-1β)对人牙周膜细胞(hPDLCs)表达诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和一氧化氮(NO)的影响。方法应用LPS和IL-1β刺激hPDLCs后,通过实时定量PCR检测iNOS基因的表达情况,收集细胞上清液,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定诱导后细胞中iNOS的含量变化,采用硝酸还原酶法检测NO的表达水平。结果未受刺激的hPDLCs仅能产生微量的iNOS和NO;LPS和IL-1β刺激hPDLCs后,检测到iNOS、iNOS mRNA及NO的含量随着时间和质量浓度的增加而显著增加(P<0.05),在相同时间或相同质量浓度的条件下,IL-1β单独刺激或与LPS联合刺激hPDLCs产生iNOS及NO的能力强于LPS单独刺激(P<0.05)。结论 LPS和IL-1β刺激hPDLCs可以增加iNOS和NO的表达,为动物实验中牙周局部注射LPS和IL-1β诱导iNOS和NO表达奠定实验基础。     

人参皂苷Rg1通过Akt/eNOS信号调控尼古丁胁迫下人牙周膜细胞的增殖和迁移

目的:探讨人参皂苷Rg1对尼古丁胁迫下的人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,HPDLCs)增殖和迁移的影响及分子机制.方法:采用组织块法分离培养HPDLCs,尼古丁(500 ng/mL)胁迫培养细胞7d.第3天分别进行人参皂苷Rg1 (0.01 μmol/L)处理、人参皂苷Rg1与PI3K抑制剂LY294002 (0.5 μmol/L)共处理、人参皂苷Rg1与Akt抑制剂Tricirbine(5μmol/L)共处理、人参皂苷Rg1与eNOS抑制剂L-NAME(1 mmol/L)共处理(Rg1+L-NAME组),持续处理至第7天.采用MTT法和Transwell法检测各处理组HPDLCs活力变化和细胞迁移率,并使用实时定量PCR与Western印迹法检测PI3K/Akt/eNOS信号蛋白变化,采用SPSS20.0软件包对数据进行统计学分析.结果:尼古丁抑制HPDLCs的增殖和迁移并显著上调PI3K表达,抑制Akt和eNOS表达;人参皂苷Rg1减缓尼古丁对细胞增殖和迁移抑制作用以及尼古丁对Akt和eNOS表达的抑制作用;Trieirbine与L-NAME衰减人参皂苷Rg1对尼古丁的抑制作用.结论:人参皂苷Rg1通过Akt/eNOS信号调控尼古丁胁迫下HPDLCs的增殖和迁移.     

miR-30a在雷帕霉素刺激人炎症牙周膜干细胞后的表达情况及其与Beclin1基因的靶向调控作用的研究

目的:研究雷帕霉素对人牙周膜干细胞中miR-30a的表达的影响,并验证其与Beclin1的靶向调控关系,探讨miR-30a与自噬途径在牙周膜干细胞的炎症作用机制。方法:分离培养人牙周膜干细胞,并分别进行50 μg/L雷帕霉素作用2 h,10 nmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用12 h,收集细胞,提取总RNA;应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-30a的表达水平;应用qRT-PCR、Western blot及双荧光素酶报告系统验证miR-30a与Beclin1的相互作用关系。结果:雷帕霉素刺激细胞后,细胞内的miR-30a的表达升高;qRT-PCR、Western blot及双荧光素酶报告系统证实,miR-30a对Beclin1的mRNA及蛋白均有抑制,且与Beclin1的3’UTR具有靶向抑制作用。结论:miR-30a可靶向抑制自噬相关基因Beclin1的表达,并参与人牙周膜干细胞的细胞自噬过程。     

热刺激对人牙周膜细胞NLRP3/Caspase-1信号通路调控影响的初步探索

目的    初步探索热刺激状态下,正常及炎症人牙周膜细胞（PDLCs）内NOD样受体蛋白3（NLRP3）/半胱天冬酶1（Caspase-1）信号通路的调控表达变化。方法    使用三磷酸腺苷（ATP）和脂多糖（LPS）制备炎症PDLCs模型,分别以45℃、5%CO2条件和37℃、5%CO2条件培养正常和炎症PDLCs,CCK8法检测细胞光密度（OD450）值。根据细胞刺激条件,分为3个实验组（ATP+LPS组、热刺激组、ATP+LPS+热刺激组）和1个对照组,采用荧光实时定量PCR（qRT-PCR）检测各组热休克RNA-1（HSR1）、热休克转录因子1（HSF-1）、NLRP3、Caspase-1、白介素（IL）-1β、IL-18的表达水平。结果    ①正常PDLCs活性检测结果显示,随着培养时间的延长,37℃培养条件下细胞OD450值逐渐增加,45℃培养条件下细胞OD450值逐渐降低（F = 36.309,P < 0.05）;炎症PDLCs活性检测结果显示,随着培养时间的延长,2种温度培养条件下细胞OD450值均逐渐降低（F = 23.353,P < 0.05）;且不同培养时间的2种温度培养条件下细胞OD450值比较,差异均有统计学意义（均P < 0.05）;随着培养时间的延长此差异越明显（均P < 0.05）。②各组测量指标mRNA相对表达量总的比较,差异均有统计学意义（均P < 0.05）。3个实验组各测量指标mRNA相对表达量分别与对照组比较,差异均有统计学意义（均P < 0.05）。且与ATP+LPS组比较,热刺激组和ATP+LPS+热刺激组的HSR1和HSF-1 mRNA相对表达量增高,NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA相对表达量降低,差异均有统计学意义（均P < 0.05）。结论    HSR1可能负反馈调节着NLRP3/Caspase-1炎症小体通路,正常和炎症PDLCs抵抗热刺激时的免疫防御反应能力均减弱。     

TGF-β1对炎症状态下人牙周膜成纤维细胞的调控作用

目的 探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对在牙龈卟啉单胞菌来源脂多糖（lipopolysaccharide from Porphyromonas gingivalis,Pg-LPS）刺激模拟炎症状态下的人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament fibroblasts,hPDLFs）的调控作用。方法 获取hPDLFs并进行免疫组化鉴定,通过qRT-PCR与CCK-8确定Pg-LPS的刺激浓度。将hPDLFs分成4组：空白对照组,单纯100μg/mL Pg-LPS;低浓度组,1 ng/mL TGF-β1+100μg/mL Pg-LPS;中浓度组,10 ng/mL TGF-β1+100μg/mL Pg-LPS;高浓度组100 ng/mL TGF-β1+100μg/mL Pg-LPS。CCK-8检测细胞增殖情况;划痕实验与Transwell小室实验检测hPDLFs细胞迁移能力;流式细胞术检测hPDLFs的细胞周期;qRT-PCR检测hPDLFs的转录因子叉头盒p3(forkhead/winged h...     

DZIP1通过影响Wnt/β-catenin信号通路促进口腔鳞状细胞癌增殖、迁移和侵袭

目的 探究DZIP1通过Wnt/β-catenin信号通路对口腔鳞状细胞癌增殖、迁移和侵袭的影响.方法 实时荧光定量PCR和Western blot检测DZIP1和Wnt/β-catenin信号通路相关基因mRNA表达和蛋白表达,CCK-8检测细胞活力,克隆形成实验检测口腔鳞状细胞癌(oral squamous cel...