盐碱土耐盐碱细菌筛选及其植物促生能力研究

  目的  为寻找耐盐碱促生细菌资源。  方法  采用传统定向筛选培养基培养、摇瓶培养和16S rDNA鉴定的方法,自盐碱土筛选细菌并对其促生特性进行测定。  结果  筛选得到具有促生特性的细菌14株;其中,不动杆菌属6株,肠杆菌属3株,假单胞菌属5株。在筛选出的14株细菌,均具有解钾能力,培养液速效钾含量与对照12.86 ± 0.30 mg L?相比增加16.24 ~ 36.21 mg L?1;12株细菌具有溶磷能力,培养液磷含量对照组为0.8 ± 0.1 mg L?1,接种细菌菌株的为59.1 ~ 233.2 mg L?1,培养基pH值由6.86 ± 0.34下降至4.06 ~ 5.69,线性相关分析表明溶磷培养液磷含量与培养液pH值呈负相关;7株细菌具有产植物生长激素吲哚乙酸（IAA）能力,在底物色氨酸（L-Trp）浓度为500 mg L?1时产IAA能力为5.57 ~ 21.11 mg L?1·OD₆₀₀;9株细菌具有产铁载体能力,能力最强的Su值达到95%。14株细菌均能在pH值为8、NaCl浓度为0.5 mol L?1的培养液中生长;有4株能在NaCl浓度为1.5 mol L?1培养基中生长,且B1421生长良好;有5株细菌可在pH为10的培养基中生长,为B2222生长最为良好。  结论  松嫩平原盐碱土中存在具有不同促生能力的细菌,能够耐受高pH值和较高NaCl含量的胁迫,是可供以耐盐碱植物利用改良盐碱土的菌株资源。     

一株耐镉细菌的分离鉴定及其吸附条件的优化

从镉污染场地筛选分离得到一株耐镉细菌F7,经过形态学观察以及16S r DNA同源性对比分析,鉴定菌株F7属于芽孢杆菌(Bacillus),最大耐Cd~(2+)浓度为50 mg/L。实验研究了Cd~(2+)初始浓度、pH及投菌量对菌株吸附Cd~(2+)的影响,利用FTIR探究菌株吸附的机理。结果表明:菌株F7在Cd~(2+)初始浓度为1.0 mg/L、投菌量为1.0 g/L、pH为6.1时,对Cd~(2+)的吸附率达到93.9%;吸附符合Langumir模型,最大吸附容量为1.83 mg/g。对比分析吸附前后的红外光谱图,发现菌株F7表面的官能团羟基、胺基、烷基、蛋白酰胺Ⅱ带及磷酸基团在吸附过程中起主要作用。     

山西矿区复垦土壤中解磷细菌的筛选及鉴定

【目的】矿区复垦土壤贫瘠、 有效磷含量低。解磷细菌能够将有机磷和难溶性无机磷转化为可溶性磷,促进植物对磷素的利用。因此筛选和鉴定具有解磷能力的菌株,可为解决矿区生态恢复使用的微生物肥料提供菌种资源。【方法】采用平板分离法初筛菌株,得到D/d1.5的菌株,然后以磷酸钙为磷源,通过液体发酵试验复筛菌株,挑选出解磷率高于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)As1.223的菌株。以磷矿粉和卵磷脂为磷源,液体发酵试验测定菌株的解磷能力及磷酸酶活性。进行菌株的生长试验以测定菌株温度适宜性、 耐盐性及耐酸碱性。通过形态学、 基因序列分析及脂肪酸组成分析综合进行菌株鉴定。 菌落形态观察用营养琼脂平板培养基培养;菌体形态即细胞形态及其大小采用扫描电镜观察;基因序列分析采用16S rDNA序列测定,基因在线比对采用EzTaxon数据库;使用美国MIDI公司的Sherolock全自动细菌鉴定系统对菌株进行脂肪酸组成分析。【结果】利用无机磷和有机磷平板培养基,从山西省矿区复垦区土壤样品中筛选出19株解磷微生物,其中D/d1.5的有7株。在以磷酸钙为磷源的液体培养试验中,4株菌的解磷率高于巨大芽孢杆菌As1.223,解磷率为7.89%～12.61%,最高的为菌株Y14。4株菌对磷矿粉的解磷率为0.81%～1.21%,最高的为菌株Y14。在以卵磷脂为磷源的液体培养试验中,4株菌的解磷率与酸性磷酸酶活性分别为1.79%～3.07%和24.3～28.4U/L,均高于巨大芽孢杆菌As1.223; 碱性磷酸酶活性为11.9～50.2U/L;菌株Y14的解磷率与磷酸酶活性均最高。4株菌均有较强的环境适应能力,以Y14的适应性最强。H22、 Y11和Y34与假单胞菌属(Pseudomonas sp.)同源性在99%以上,Y14与泛菌属(Pantoea sp.)有99.79%的同源性; H22、 Y11和Y34的细胞脂肪酸组成特征峰与假单胞菌属(Pseudomonas sp.)相一致,Y14与泛菌属(Pantoea sp.)相一致;H22、 Y11和Y34被鉴定为假单胞菌(Pseudomonas sp.),Y14为泛菌属(Pantoea sp.)。【结论】分离、 筛选到4株高效解磷菌,对于磷酸钙和卵磷脂的解磷率均高于巨大芽孢杆菌As1.223。4株菌分别隶属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)和泛菌属(Pantoea sp.)。菌株Y14无机磷与有机磷平板的D/d值分别为3.28与1.59,降解磷酸钙、 磷矿粉、 卵磷脂的解磷率分别为12.61%、 1.21%、 3.07%,酸性与碱性磷酸酶活性分别为28.4 U/L和50.2 U/L,均为4株菌里最高的,且环境适应能力最强,生长温度为20～60℃,能耐受pH 4～11的酸碱梯度和2%～7%的盐分梯度,Y14被鉴定为泛菌属(Pantoea sp.)。4株菌均具有良好的解磷能力及较强的环境适应能力,可望进一步研发成为微生物肥料生产菌种。综合D/d值、 解磷率、 磷酸酶活性和生长试验,本试验最终确定适合山西矿区复垦农田推广的高效解磷菌菌株为Y14。     

土壤富硒细菌的筛选、鉴定

从广西不同富硒区土壤中分离出32株耐硒细菌,通过优化加硒时间、培养时间及加硒浓度进行富硒试验,筛选获得4株富硒能力较强的细菌,进一步通过对4株细菌16S rDNA序列分析及系统发育树分析明确了各菌株的种属关系。经鉴定,YLB1-6为Bacillus cereus,TXB1-10为Sinomonas sp.,TXB2-5为Bacillus thuringiensis,GPB1-5为Achromobacter denitrificans。在最适加硒时间、培养时间及适宜加硒浓度条件下,各菌株的硒转化率分别为:YLB1-674.22%,TXB1-1066.05%,TXB2-555.31%,GPB1-563.30%。各菌株处理能显著提高土壤可交换态硒含量,对土壤硒起到较强活化作用。土壤富硒细菌为硒转化提供更多的高效微生物载体,并为富硒产品开发研究提供技术支持。     

尼古丁降解菌L1的分离鉴定与降解特性分析

通过对分离于烟草叶片的154株具有降解尼古丁细菌菌株筛选，获得能高效降解尼古丁的L1菌株。通过形态观察，16S rDNA序列分析和生理生化测定将其鉴定为Bacillus simplex。菌落生长密度测定和高压液相色谱分析表明， L1菌株最适生长尼古丁浓度为1g/L，随着菌落密度增加，尼古丁降解效率逐渐升高，36 h最高降解率达到75.0%。而低尼古丁含量不利于L1菌株的生长，过高尼古丁含量对L1菌株的生长和降解效率具有反馈抑制作用。菌株L1降解尼古丁过程中无色素产生，说明其尼古丁代谢途径有别于节杆菌。     

烟草根表可培养细菌群落组成及典型菌群的促生特性研究

植物微生物组是维护植物生长发育、提升抗逆防病的重要调控因素。为发挥植物微生物促进烟草生长、改善烟草根区微生态功能作用，本研究从烟草根表分离筛选可培养细菌组，并对不同菌株的促生能力进行测定。结果表明：①从烟草根表分离并鉴定出可培养菌株310株，隶属于31个属，其中主要为芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)；②对比分析发现假单胞菌属、芽孢杆菌属、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)和成对杆菌属(Dyadobacter)为4种供试土壤烟草根表共有的细菌类群；③对进一步筛选得到的16株菌株进行促生能力的测定，发现6株菌具有固氮能力，5株菌产铁载体，4株菌可溶解无机磷，4株菌产IAA；④盆栽试验验证16株菌株的促生效果，其中37.5% 的菌株对烟草生长具有显著促进作用，烟草株高、总鲜物质量和地下部干物质量分别比对照提高35.1%、27.9% 和30.7%。总之，从烟草根表分离获得多种具有促生能力的菌株，为未来构建促进烟草健康生长的复合菌剂提供了理论基础。     

微生物絮凝剂的菌种分离筛选及其产生条件的选择

本研究采用根瘤菌选择性培养基和稀释平板法,从广西大学校园罗汉松和相思树植物根瘤中总共分离出20株菌落光滑型菌株,并分别对其发酵物作絮凝试验。研究结果表明,从罗汉松根瘤中筛选出一株絮凝率较高的菌株,暂编号为P2。对P2进行形态学观察结果表明:其菌落圆形、凸起、光滑、无色透明,其细胞杆状、菌体大小为0.5×(1～2)μm,该类细菌为革兰氏阴性细菌、有糖被、无芽孢,周生鞭毛;测序分析表明其16S rDNA序列与Rhizobium sp. DV816S rDNA(DQ873665.1)同源性达98%以上;生长和产絮凝剂最佳条件如下:配方为甘露醇10%,K2HPO4 0.3%,酵母膏0.03%,NaCl 0.5%,(NH4)2SO4 0.01%,脲0.03%液体培养基中,30℃,起始pH为7.0,转速为200r/min条件下培养发酵72h,产生的絮凝剂可使浓度为5000mg/L高岭土悬浮液在20min内絮凝率最高为92%。     

一株高效解磷细菌的筛选、鉴定及其溶磷能力的研究

从武汉市黄陂区长期种植的蔬菜大棚作物根际分离筛选出多株解磷细菌,经过多次筛选纯化获得一株性状稳定的高效解磷细菌P1。根据生理生化特征和16S rDNA序列分析,鉴定菌株P1为根瘤菌属(Ensifer)。研究了不同发酵条件对P1菌株解磷能力的影响,确定了菌株P1的最佳培养条件为发酵时间7 d、初始pH值8、接种量2%,在该条件下菌株P1溶解磷酸三钙的量为443.11 mg/L。试验还发现菌株P1的溶磷量与培养液的pH值呈极显著负相关性。     

玉米和大豆根内生拮抗细菌筛选鉴定及生防能力评价

为获得对植物真菌病害有稳定作用效果的生防细菌,采用平板对峙培养法从大豆和玉米根部内生细菌中筛选获得12株菌株,这些细菌对大豆立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、大豆尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.glycine)和番茄枯萎病菌(Fusarium oxgsporum f.sp.lycopersici)均具有明显拮抗作用。16S rRNA基因鉴定表明12株内生拮抗细菌分别属于芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas)。选取5株细菌进行盆栽接种试验,结果表明,供试细菌均对大豆根腐病具有一定的防治效果,其中,菌株J1和J2防效分别达到20.4%和32.1%。     

土壤耐硒菌株筛选及其硒活化能力评价研究

  目的  从湖北省恩施市双河镇新塘乡渔塘坝硒矿床采集矿渣、淤泥、农田土壤,从中筛选分离出耐硒菌株,并对筛选出菌株的活化土壤硒的能力进行评价。  方法  采用稀释涂布平板法和平板划线法分离、筛选出耐受亚硒酸钠浓度较高的菌株,根据菌株形态学特征和用分子生物学方法对其进行分类鉴定,再将分离得到的耐硒菌株分别接种于酸性富硒赤红壤中进行培养,通过测定培养后土壤中的硒含量评价两菌株活化土壤硒的能力。  结果  筛选出了细菌B-1和真菌B-2两耐硒菌株;细菌B-1被鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）,其可耐亚硒酸钠浓度为17000 μg mL?1,在温度20 ~ 35 ℃、pH 5 ~ 9、盐浓度0 ~ 3%条件下可正常生长;真菌B-2被鉴定为聚多曲霉（Aspergillus sydowii）,该菌株可耐亚硒酸钠浓度为6000 μg mL?1,在温度25 ~ 30 ℃、pH 4 ~ 7、盐浓度2% ~ 5%条件下可正常生长。添加两耐硒菌株培养后土壤的可溶态硒和可交换态硒含量均显著提高。  结论  筛选出具有较高的硒耐受性和较强的活化酸性富硒土壤中硒的能力的菌株,可为富硒土壤资源开发利用提供生物种质资源和技术手段,对富硒微生物肥料研发、富硒农产品生产和硒污染土壤环境修复也有重要意义。     

产ACC脱氨酶植物根际促生菌的筛选及其对修复植物高羊茅生长的影响

以1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)为唯一氮源,从石油污染的土壤中分离得到一株具有ACC脱氨酶活性的菌株D5A.该菌在以ACC为唯一氮源条件下,其ACC脱氨酶比活力为0.084 U/mg.另外,D5A还具有产生吲哚乙酸(IAA)、耐盐以及溶磷的特性.在液体培养条件下该菌株产IAA高达112 mg/L,在90 g/kg盐含量的培养基中仍能够正常生长且具有较强的溶解矿物磷能力.同时该菌对酸碱具有良好的适应性,在初始pH4～10的LB培养基中生长良好.种子发芽试验表明在3 g/kg和6 g/kg浓度NaC1的逆境条件下,该菌株能显著提高高羊茅种子的发芽率和芽长.最后,通过对其进行生理生化特性和16S rDNA序列分析,该菌株初步鉴定为克雷伯氏菌(Klebsiellasp.).     

堆肥作为微生物菌剂载体的研究

以自然风干的堆肥为载体,吸附3株功能芽胞细菌液体菌剂制成不同生物肥料,通过不同时间取样比较堆肥、有机无机肥和生物有机肥以及生物复混肥中功能芽胞细菌和普通微生物数量以及pH等指标变化,探讨堆肥作为载体生产生物肥料的可行性。研究结果表明,经过自然风干的堆肥与蛭石比较,吸附液体微生物菌剂后无论外观、手感还是功能芽胞细菌死亡率,差异均不大。含水量小于15%堆肥吸附液体菌剂比例为6%比较合适,吸附比例高时,生物肥料含水量和pH较高,影响保存效果。生物有机肥和生物复混肥保存6个月时,3株功能芽胞细菌总数分别为0.59×108 CFU.g-1和0.38×108 CFU.g-1,依然可达到农业行业标准要求。生物有机肥中功能芽胞细菌数量最高,生物复混肥集合了三大肥料优点,堆肥中普通微生物数量和多样性最高。完全腐熟的堆肥经过自然风干后可作为微生物菌剂载体。     

生物表面活性剂产生菌的筛选及其发酵条件的初步优化

以石油为 C 源,经过富集培养从石油污染土壤中筛选出 15 株具有较强产生物表面活性剂能力的菌株.其中菌株 BS-5 产生物表面活性剂的能力最强,该菌发酵液的表面张力可达 27.3 mN/m(空白发酵液表面张力为 54.5 mN/m).通过红外光谱分析发现该菌产生的生物表面活性剂为糖脂类物质.另外,通过正交试验对该菌的培养基条件进行初步优化,结果以植物油 10 g/L、MgSO4 0.2 g/L、K2HPO4 1.0 g/L、KH2PO4 1.0 g/L、蛋白胨 1.0 g/L、FeSO4 0.05 g/L、CaCl2 0.02 g/L、初始 pH 值 7.5 为最佳.通过16S rDNA 测序结果表明该菌为铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa).     

降解亚硝酸盐和生物胺乳杆菌筛选及其改善鱼肉香肠品质效果

为了筛选出优良亚硝酸盐和生物胺的降解植物乳杆菌,并研究在鱼肉发酵香肠中的应用。该文主要考察了19株植物乳杆菌亚硝酸盐和生物胺的降解活性及相关基因的携带情况,从中筛选出优良菌株,并研究其对鱼肉香肠发酵过程中各种亚硝胺、生物胺、腐败微生物的抑制作用和对其他理化指标的影响。试验结果表明,L.plantarum CP3对亚硝酸盐和生物胺的降解能力最强,分别达到95%和77%,PCR结果显示此菌株中含有亚硝酸盐降解(假定蛋白(hypothetical protein,HP)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)、一氧化还原酶(Oxidoreductase,ORD))和生物胺降解的相关基因(multicopper oxidases,suf I),且不含生物胺生成相关基因(hdc,tdc,odc)。GC-MS测定结果显示L.plantarum CP3对发酵香肠中4种亚硝胺-二乙基亚硝胺(N-nitrosodiethylamine,NDEA),二甲基亚硝胺(N-nitrosodimethylamine,NDMA),亚硝基吗啉(N-nitrosomorpholine,NMOR)和甲基乙基亚硝胺(N-nitrosomethylamine,NMEA)的生成都具有显著的抑制作用,联合接种L.saki M4可以协同提高亚硝胺的降解能力。并且,与对照组相比,接种L.plantarum CP3+L.saki M4的鱼肉香肠,发酵48 h后腐胺、尸胺和酪胺的含量分别降低了76.83%,93.33%和88%。另外,接种乳酸菌处理组香肠中的肠杆菌、假单胞菌等腐败菌及pH值、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)和挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)的含量显著低于对照组。该研究结果体现了L.plantarum CP3作为香肠等肉制品发酵剂的良好开发应用前景。     

环状芽孢杆菌乳糖酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质分析

摘要: 将环状芽孢杆菌(Bacillus circulans )中的乳糖酶基因在大肠杆菌(Escherichia coli )中进行了高效表达, 并测定了表达的乳糖酶的基本酶学性质。结果表明, 表达的乳糖酶有生物学活性, 但与来源于环状芽孢杆菌的原始酶相比, 其酶促反应的最适pH、最适温度、Km值, 以及酶的pH稳定性和温度稳定性等酶学性质均有较大变化。表达的乳糖酶最适pH为5.0, 低于原始酶的pH 6.5; 最适温度为37 ℃, 而原始酶为55 ℃; 其耐酸性、耐热性及对金属离子的抗性等方面比原酶有所提高; 而且表达的乳糖酶Km比原始酶小285倍、Vmax比原始酶大5.4倍，表明经大肠杆菌表达的乳糖酶有较高的底物亲和力，酶促反应效率更高。从乳糖酶的单位表达量来看, 原始酶在环状芽孢杆菌的表达量为20.98 U/mL，而在大肠杆菌中的表达量提高到33.102 U/mL。     

水稻穗期活体植株对潮霉素的敏感性分析及突变体选育

携带潮霉素磷酸转移酶基因(HPT)的转基因作物细胞和组织对抗生素潮霉素具有一定耐性,是作物尤其是单子叶作物遗传转化中常用的选择基因。本研究旨在建立一种活体植株潮霉素抗性快速鉴别技术,用于转基因育种和相关研究。在始穗期前后,用不同浓度潮霉素B溶液(25～100mg/L)喷洒常规及转基因水稻植株,考察叶片和谷粒的中毒症状。发现常规水稻在高于50mg/L的潮霉素溶液处理后,叶片出现褐色斑点,稻穗部分谷粒颖壳呈黄褐色的中毒症状,叶片斑点和黄褐色谷粒的数量均随剂量增大而增加。经100mg/L潮霉素处理后,籼稻品种嘉优99和C10剑叶每平方厘米平均斑点数目为21.1和19.2个,穗上黄褐色谷粒比例分别达27.6%和23.5%;粳稻品种嘉优5号和R5叶片中毒斑点数为11.8和10.7个,黄褐色谷粒比例分别为11.2%和11.9%,表明2份籼稻材料较2份粳稻材料对潮霉素更为敏感。在上述浓度范围内,携带HPT的转Bt基因水稻克螟稻1号均未出现中毒症状。对γ射线诱变处理克暝稻的M2群体(共12万株)穗期喷施100mg/L的潮霉素B溶液,从中筛选到42株潮霉素敏感型突变体,组织化学法分析表明这些植株具有β-葡萄糖苷酸酶GUS活性。对能够取到较嫩叶片的14个单株采用离体叶片法进行抗虫性鉴定,证明这些植株对二化螟仍然表现高抗。上述结果表明,在始穗期喷施100mg/L潮霉素溶液,潮霉素敏感植株可出现明显、直观的中毒症状,可以在活体植株水平上有效鉴别植株是否携带HPT,可用于育种中转基因植株的筛选或转基因安全评估中植株的鉴别。     

复合菌群的构建及其对石油污染土壤修复的研究

从石油污染土壤中富集分离、筛选出3株高效降解石油的微生物菌株,通过生理生化特性研究及16SrRNA基因序列分析,确定3株菌均属于红球菌属（Rhodococcus sp）,研究和比较了它们与实验室保存的4株菌（分别属于Gordonia sp,Comamonas sp,Pesudomonas sp）降解石油的能力。这7株菌株对石油的不同组分具有不同的降解能力,对7株菌进行不同的组合用以研究复合菌群对石油的降解。结果表明,由两株Rhodococcus sp,一株Gordonia sp和一株Pesudomonas sp组成的复合菌群D,降解石油的能力超过任何单一菌株和其他组合菌群。混合菌群D在5d的培养中能降解70.3%的石油总量和71.4%的芳香化合物。混合菌群D能降解99.8%的C13-19烷烃,92.6%的C20-26烷烃,82.2%的C27-32烷烃以及90.2%的植烷。在实验室模拟条件下,对土壤中石油的降解率达到50%以上。降解土壤中石油的最适温度为10～30℃、pH值为6.5～9.5,接种量需要在106CFU·g-1以上。     

E.coli谷氨酸脱羧酶高产菌株选育及发酵条件研究

以普通大肠杆菌(E. coli)为出发菌株,以L-谷氨酸、溴甲酚绿(pH3.8~5.4)为筛选及指示剂,经亚硝基胍(NTG)、UV诱变处理,得到了L-谷氨酸脱羧酶活性变异菌株,其L-谷氨酸脱羧酶（GAD）活性大幅度提高,比出发菌株酶活性提高了2.22倍。优化实验显示：pH值、发酵时间、诱导剂L-谷氨酸、硫酸镁对GAD产酶有较大影响。通过对产酶发酵培养基中几种成份单因素变动及正交优化实验,对该菌株产GAD的诱导剂L-谷氨酸、营养要求和发酵条件进行了研究,优化后的发酵培养基组成为牛肉膏5 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化钠3 g/L,L-谷氨酸0.5 g/L,葡萄糖1.5 g/L,磷酸二氢钾2 g/L,硫酸镁0.7 g/L。发酵条件是：pH6.8,接种菌龄20h,发酵时间20h。在优化条件下突变菌株GAD活性可达6790.7U,是出发菌株的2.76倍。