p53在胃肠肿瘤的表达及预后意义的研究

p53蛋白是反映细胞增殖活性的重要指标,与胃肠肿瘤的发生发展密切相关。结合病理形态学观察,检测p53蛋白的表达,能更客观、准确地判断胃肠肿瘤的恶性程度和预后。对胃肠肿瘤的诊断和预后有较高的临床实用价值。     

78例大肠癌Cox-2,p53及C-erbB-2表达分析

目的探讨人大肠癌COX-2、p53、C-erbB-2表达及其与与临床病理特征的关系。方法应用S-P免疫组化方法,观察78例大肠癌中COX-2、p53、C-erbB-2的表达情况。结果Cox-2,p53及C-erbB-2阳性表达率在大肠癌分别为82.1%、67.9%、61.5%。在TNMⅢ Ⅳ期患者阳性表达率分别显著高于TNMⅠ Ⅱ期(P<0.05)。Cox-2及p53的表达率在肿瘤有淋巴结转移病例中分别显著高于肿瘤无淋巴结转移病例(P<0.05)。结论大肠癌的Cox-2,p53及C-erbB-2的表达与TNM分期和疾病进展等相关。三者联合检测可为大肠癌的恶性程度及预后的判断提供有效证据。     

P53蛋白的原核表达及纯化

目的构建P53基因重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化。方法以pBabe-P53R质粒为模板,PCR扩增P53基因全序列,克隆至pGEX-4T-1载体中,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-P53,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经不同配比的去垢剂复性后,用GlutathioneSepharose4Bgel亲和层析纯化。结果重组原核表达质粒pGEX-4T-1-P53经双酶切鉴定,表明构建正确。表达的GST-P53融合蛋白相对分子质量约80000,IPTG诱导时间以1h为宜。1%TritonX-100和1mmol/LEDTA为蛋白复性的最佳去垢剂。纯化的GST-P53融合蛋白可与羊抗人GST抗体和鼠抗人P53抗体发生特异性反应。500ml菌液可获得1mg纯化蛋白。结论已成功构建了P53基因重组原核表达质粒,表达并纯化了GST-P53融合蛋白,为研究NIRF与P53基因之间的相互关系奠定了基础。     

沉默E6相关蛋白对人乳头瘤病毒阴性宫颈癌细胞中p53蛋白表达水平的影响

目的 探讨沉默E6相关蛋白(E6-associated protein,E6AP)对人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)阴性宫颈癌细胞(C33A)中p53蛋白表达水平的影响。方法 在LipofectamineTM2000转染试剂的介导下,将特异性沉默E6AP的siRNA序列(siE6AP)及沉默对照无序siRNA序列(siControl)分别转染C33A细胞。Western blot法检测siRNA对E6AP的沉默效果及细胞中p53和cleaved-caspase-3蛋白的表达水平。结果 siE6AP组C33A细胞中E6AP蛋白表达水平显著低于siControl组(t=-4.597,P<0.05)。siE6AP组C33A细胞中p53和cleaved-caspase-3蛋白表达水平均显著高于siControl组(t分别为4.533和7.099,P均<0.05)。结论 沉默E6AP可显著提高C33A细胞中p53蛋白的表达水平,表明沉默E6AP可能恢复C33A细胞中p53的活性和功能。     

Kozak序列引导的人p53基因重组智能腺病毒载体的构建与表达

目的构建Kozak序列引导的人p53(khp53)基因重组智能腺病毒载体rAdMH-khp53,并检测p53基因的表达。方法将带有Kozak序列的p53基因克隆到重组腺病毒穿梭载体中,再利用AdMaxTMHi-IQ系统,获得重组腺病毒,检测病毒滴度,并进一步感染Saos-2细胞,利用RT-PCR及Western blot检测p53基因的表达。结果khp53基因成功克隆到腺病毒载体中,重组腺病毒滴度为1.63×108IU/ml,RT-PCR方法检测到p53基因的转录产物,Western blot检测到p53基因在Saos-2细胞中的高水平表达。结论已成功构建了带有Kozak序列的重组腺病毒载体rAdMH-khp53,并高效表达人p53基因。     

离子交换介质内蛋白置换行为的观测与解析

以肌醇六磷酸钠(PAS)为置换剂研究了绿色荧光蛋白(eGFP)在Q Sepharose HP离子交换色谱(IEC)介质上的置换行为。置换色谱结果表明,不同浓度PAS下eGFP均可形成稳定的置换列并成功分离。利用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)技术对eGFP在离子交换色谱介质内吸附动力学的观测发现,eGFP在IEC介质内的吸附是由表面扩散和孔扩散共同作用的复杂行为。置换过程中不同时刻的CLSM图像显示,eGFP置换不仅取决于置换剂的亲和力,也与置换剂与介质的结合过程相关;介质内荧光强度的分析表明,eGFP置换首先发生在介质的外层,PAS浓度的降低导致置换速率下降。这与置换色谱的结果相吻合。CLSM不仅为蛋白置换动力学的研究提供了一种直观观测技术,CLSM结果也确认了蛋白质置换过程的复杂性。     

P53、Bcl-2蛋白在锯齿状腺瘤的表达及临床意义

目的探讨P53、Bcl-2在锯齿状腺瘤中的表达和临床意义。方法收集增生性息肉20例,锯齿状腺瘤20例,普通腺瘤20例标本,做免疫组化P53、Bcl-2。结果Bcl-2在普通息肉中,锯齿状腺瘤腺隐窝底部与上部,阳性率与增生性息肉是相同的,中部与增生性息肉相同但低于普通腺瘤(P<0.01),P53阳性表达在锯齿状腺瘤和普通腺瘤中无明显不同,增生性息肉表达较低(P<0.05)。结论锯齿状腺瘤具有细胞明显增生的免疫组化特征,是一种相对独立的直结肠肿瘤。     

氨氯地平对小鼠肝癌H_(22)细胞细胞周期及相关蛋白表达的影响

目的探讨氨氯地平对小鼠肝癌H22细胞细胞周期及相关蛋白表达的影响。方法用不同浓度的氨氯地平作用小鼠肝癌H22细胞,采用MTT法检测细胞的增殖水平,流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况,免疫组化及RT-PCR法检测细胞周期蛋白CyclinB1和肿瘤抑制基因p53在蛋白水平和基因水平的表达。结果氨氯地平(1.75×10-3、3.5×10-3、7×10-3、14×10-3、28×10-3mg/ml)作用24、36、48h,均可抑制细胞增殖,作用48h的半数抑制浓度(IC50)为13.4μmol/L;氨氯地平对小鼠肝癌H22细胞细胞周期G2期具有阻滞作用且可使细胞发生凋亡;氨氯地平作用后的小鼠肝癌H22细胞周期蛋白CyclinB1的表达明显降低,p53表达明显增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论氨氯地平能显著抑制小鼠肝癌H22细胞增殖,并通过下调G2期周期蛋白CyclinB1水平和上调肿瘤抑制基因p53的表达而达到抗肿瘤效果。     

缺氧诱导因子-1α、胰岛素样生长因子ⅡmRNA结合蛋白3、增殖细胞核抗原和P53蛋白在反流性食管炎、Barrett食管及食管腺癌组织中的表达

目的观察缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、胰岛素样生长因子Ⅱm RNA结合蛋白3(insulin-like growth factor-Ⅱm RNA-binding protein 3,IBMP3)、增殖细胞核抗原(proliferating cellnuclear antigen,PCNA)和P53蛋白在反流性食管炎(ruflex esophagitis,RE)、barrett食管(Barrette esophagus,BE)、食管腺癌(esophageal edenocarcinoma,EAC)组织中的表达情况,分析HIF-1α、IMP3、PCNA和P53的表达在EAC发生过程中的意义。方法采用免疫组化法,检测50份RE、100份BE和100份EAC样本中HIF-1α、IMP3、PCNA和P53蛋白的表达,并取无反酸、烧心等症状,无免疫疾病、感染疾病病史及胃镜下食管下段黏膜无明显病变的功能性消化不良患者样本30份作为对照。结果 HIF-1α蛋白在RE、BE和EAC组中阳性率分别为14%、54%和92%,与对照组相比,差异有统计学意义(P均0.05);P53蛋白在RE、BE和EAC组中阳性率分别为8%、31%和84%,EAC和BE组与对照组相比,差异有统计学意义(P均0.01);IMP3蛋白在RE、BE和EAC组中阳性率分别为10%、45%和74%,EAC和BE组与对照组相比,差异有统计学意义(P均0.01);PCNA蛋白在RE、BE和EAC组中阳性率分别为22%、47%和74%,EAC和BE组与对照组相比,差异有统计学意义(P均0.01);EAC与BE组及BE与RE组比较,HIF-1α、P53、IMP3、PCNA蛋白的表达差异有统计学意义(P均0.01),4种蛋白在RE、BE和EAC组中的表达逐渐增强。HIF-1α表达与IMP3、P53、PCNA表达均呈正相关(P0.01)。结论 HIF-1α、IMP3、PCNA和P53蛋白的表达与BE、EAC的发生发展密切相关,可用作监测BE、EAC早期发生的指标,为今后BE及EAC的治疗提供新的途径。