高产壳聚糖酶菌株的筛选和发酵产酶条件研究

为探讨专一性地降解甲壳质或壳聚糖的甲壳质酶或壳聚糖酶 ,从采集的土样中分离到 4株产壳聚糖酶能力较强的菌株 ,经摇瓶复筛 ,菌株YJ0 2产酶能力最强。对其发酵产酶条件的研究结果表明其产酶最适培养基组分为 (% ,w/v) :粉末壳聚糖 2 .0 ,葡萄糖 0 .1,NH4NO3 1.0 ,酵母提取物 0 .5 ,K2 HPO40 .0 7,KH2 PO40 .0 3 ,NaCl0 .5 ,MgSO4·7H2 O 0 .0 5 ,起始 pH 6.0。最适产酶培养条件是 :5 0 0mL三角烧瓶装瓶量为 15 0mL ,2 .0 % (v/v)接种量 ,3 0℃ ,15 0r/min培养 72h。在最适产酶培养条件下 ,72h时菌株YJ0 2发酵液中壳聚糖酶活力可达到 17.0 4U/mL。     

壳聚糖酶高产菌株的筛选和发酵条件的研究

从采集的土样中分离到1株产壳聚糖酶能力较强的菌株OU01,并对OU01进行了16S rDNA序列、形态及生理生化鉴定分析。16S rDNA序列分析表明该菌属于微杆菌属;该菌的形态特征与生理生化鉴定结果表明该菌与Microbacteriumsp.的相似性最高;因此将其初步鉴定为微杆菌属(Microbacterium)。同时对该菌的发酵条件进行了初步研究:该菌的最适培养基组成为(g/L):chitosan 10,(NH4)2SO420,MgSO4.7H2O 1.3,K2HPO4.3H2O 1.4,Glucose 1,Yeast extract 3,NaCl 5,起始pH=6.30。最适发酵温度为30℃,最佳发酵时间为96 h,在上述最优条件下,该菌株产酶达到118 U/mL。Microbacteri-umsp.OU01菌株为壳聚糖酶的研究和应用提供了新的来源。     

两株琼胶酶高产细菌的筛选和鉴定

从海洋环境中筛选得到两株琼胶酶的高产菌株，通过形态观察和生理生化反应，确定它们属于弧菌属，通过BIOLOG细菌鉴定系统鉴定，并同弧菌属标准菌株分析比较，确定上方宝剑两株菌都是塔式弧菌（Vibrio tubiashii)，这两株菌在碳源利用方面存在差别。     

产甲壳素酶菌株的发酵条件、酶的分离纯化及酶学性质研究

利用甲壳素为唯一碳源从土壤中筛选得到1株产甲壳素酶活力较高的菌株HD002,初步鉴定其为Massilia属。确定菌株产甲壳素酶的最适培养基组成为(g/L):(NH4)2SO45,K2HPO40.7,KH2PO40.3,MgSO4.7H2O 1,胶体甲壳素10;最适产酶培养条件为:培养基起始pH值6.0,培养时间192 h,发酵液酶活力达1.314 U/mL。采用70%饱和度硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose F.F阴离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析对该甲壳素酶进行纯化,SDS-PAGE证明达到电泳纯。该甲壳素酶的分子量为60.2 kDa,最适反应温度为55℃,最适反应pH值为5.0,Cu2+和Fe3+对酶活力有明显的抑制作用,Ca2+和Na+对酶活力有明显的促进作用。     

一种产血纤维蛋白溶酶菌株的筛选及液体发酵条件的选择

主要进行了产生纤维蛋白溶酶菌株的筛选培养和液体发酵条件的优化等方面的研究工作。结果表明，该菌为一种短杆状菌，革兰氏染色为阴性，具有对血纤维蛋白的产酶依赖性。用此菌作为菌种进行发酵产酶的最适条件为：碳源，木糖１．５％，氮源，血纤维蛋白１．７５％；发酵液初始ＰＨ７．４；接种量５％；发酵时间２４h。     

产甲壳素酶菌株HD001的发酵条件研究及酶的分离纯化

通过对降解甲壳素菌株 HD001 的发酵条件研究,确定了其产甲壳素酶最适培养基组分为 ( w/v ):( NH4 ) 2SO4 2.0%, NaCl 0.5%, K2HPO4 0.07%, KH2P O4 0.03%, MgSO4·7H2O 0.05% 以及葡萄糖 0.1%、酵母粉 0.3% 和胶体甲壳素 1.5%;最适产酶培养条件为:培养基起始 pH 值 6.0,培养温度 30 ℃,培养时间 120 h,发酵液酶活力达 376.2 U/mL.采用硫酸铵分级盐析、DEAE-纤维素离子交换层析、Sephacryl S-100 凝胶过滤层析对该酶进行纯化后,SDS-PAGE电泳显示单一条带,其相对分子质量约为 85.7 kDa.     

杂交鲟(Sturgeon cartilage)软骨中硫酸软骨素的提取方法及分析鉴定

采用稀碱浸提、蛋白酶水解与三氯乙酸沉淀相结合脱蛋白的工艺,对杂交鲟软骨提取琉酸软骨素的方法进行了较系统的研究。综合考察各种影响因素,设计了正交试验对提取工艺参数进行了优化,并对产品的质量指标进行了检验。结果表明,最佳提取工艺参数为:碱提取时料液比为1:2.0,碱浓度为4%,碱提温度为40℃;胰蛋白酶的酶解温度为55℃,酶量为2%,酶解时间为10h,制备的硫酸软骨素为白色粉末,得率为28.9%,纯度为92.3%,蛋白质含量为2.59%,各项质量指标完全符合标准要求。与目前已报道的其他软骨素制备工艺相比较,该方法具有工艺简便,提取率高,产品纯度高的特点。光谱分析法结构鉴定结果表明它是一种软骨素肽,其主要成分为硫酸软骨素C。     

一株高效褐藻酸降解菌的筛选、鉴定及其发酵条件的优化

以褐藻酸钠为唯一碳源,从腐烂海带中筛选得到褐藻酸钠降解能力较强的菌株H4,经生理生化和16S rDNA序列分析鉴定该菌株属于交替单胞菌属(Alteromonas)。对菌株H4的发酵条件优化研究表明,H4的较优培养基组成为(w/v):褐藻酸钠0.6%、酵母粉0.5%、蛋白胨0.25%、NaCl 3%;较优培养条件为:培养温度28℃,初始pH7.5,接种量1.5%(v/v),培养时间48 h。Fe3+对交替单胞菌H4的产酶有明显的促进作用,这在其他褐藻酸裂解酶生产菌株中未见报道,而Cu2+对褐藻酸裂解酶的抑制作用高达45.78%。在优化后的培养条件下,粗酶液酶活达到146.45 U/mL,较优化前提高了39.4%。     

适应海南热带海洋环境产脂肪酶菌株的筛选及产酶条件研究

从海南热带海水中分离筛选得到10株产脂肪酶菌,其中菌株LD-1302产脂肪酶活性最高。根据16S r DNA序列分析和生理生化试验结果,鉴定该菌为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis。对该菌株的产酶条件进行优化,在p H 8、温度37℃、盐度32的条件下,经橄榄油诱导,起始浓度为3.75×105CFU/m L的LD-1302摇瓶发酵48 h时产脂肪酶活最高,脂肪酶活可达(34.97±1.45)U/m L。     

产过氧化氢酶菌株CE-1 的筛选与鉴定

经过含H2O2的平板初筛和摇瓶发酵复筛,从保存的水样中筛选到一株过氧化氢酶高产菌株CE-1,其所产过氧化氢酶活性和比活分别为1 356.2 U/mL和3 401 U/mg。菌株CE-1为革兰氏阴性杆状细菌,根据其形态特征、16S rRNA基因序列系统进化树分析和生理生化特性,以及属内不同种间性状差异等因素的综合分析,将菌株CE-1鉴定为气单胞属(Aeromonas)细菌。     

一种AHL降解菌株的高效筛选方法

酰化高丝氨酸内酯化合物(acyl-homoserine lactone,AHL)是革兰氏阴性细菌(G-)群体感应的信号分子。本文建立1种从环境微生物中高效地筛选AHL降解菌株的方法。首先利用AHL作为唯一能源对环境微生物进行初筛,再利用顶层琼脂法和报告菌株Chromobacterium violaceumATCC 12472、Agrobacterium tumefaciensA136等进行复筛,共筛选得到21株具有AHL降解活性的菌株。对其中活性最高的菌株A11进行初步的菌种鉴定,通过形态观察、16S ribosomal RNA(16S rDNA)基因分析最终确定为假单胞菌属细菌Pseudomonassp.A11。     

一株产琼胶酶海洋细菌的分离与鉴定

为获得琼胶酶活性高产菌株,对采集的海水样品进行了产酶微生物的分离、筛选和鉴定。经过平板培养预筛和两次摇瓶培养筛选,从浙江省舟山市普陀区近海海水样品中分离到一株琼胶酶产生菌G-5,该菌株液体培养产酶活力可达到413.8 U/mL。G-5菌株的菌落呈乳白色、半透明、表面湿润;菌体革兰氏染色阴性,大小0.58~0.69 μm1.50~2.26 μm;光学显微镜下呈短杆状,略有弧形。G-5菌株的16S rDNA序列与NCBI数据库中15个弧菌属（Vibrio）菌株的16S rDNA有98%的同源性,可以确定G-5菌株是一株弧菌（Vibrio sp.）。     

海洋石油降解菌的筛选鉴定及其功能基因研究

以石油原油为唯一碳源,从中国海洋大学海洋微生物菌种库15株菌中筛选到5株石油降解菌。16SrRNA基因测序结果表明,WH072、WH069、WH303、ZXM008和ZXM183分别为耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、除烃海杆状菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)、弯曲芽孢杆菌(B.flexus)、普里兹湾假交替单胞菌(Pseudoalteromonas prydzensis)和嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。其中对石油降解率最高的为WH072(高达36.4%),其次是WH069(20.0%)。对这5株菌检测已报道的石油烃降解酶基因,结果在WH072和WH069中均检测到了alkB、P450和almA3种功能基因。根据功能基因编码的氨基酸序列构建系统发育树并分析其各自的进化关系,发现P450基因在一定程度上具有种属特异性。对本研究首次报道的高效石油降解菌耐盐芽孢杆菌WH072,采用高效热不对称性交错PCR(hiTAIL-PCR)方法,成功获得了这3种功能基因的全长序列,其中alkB与已知同源基因序列相似性较低,其结构和功能有待进一步研究。     

产自两株海洋真菌的三种鞘脂类的结构测定

3种鞘脂类代谢产物N-2’-羟基十六碳酰基-1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-9-甲基-4E,8E-十八碳二烯-1-醇(A)、N-2’-羟基-3’E-十八碳烯酰基-1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-9-甲基-4E,8E-十八碳二烯-1-醇(B)和N-十六碳酰基二氢鞘氨醇(C)分别产生于来源于中国南海的2株海洋真菌(菌株编号为1924和3893),通过2DNMR、MS等方法测定了它们的结构。这是首次从南海红树内生真菌分离得到的3种鞘脂类代谢产物。     

利用ITS-5.8S rDNA序列对2株海洋亚历山大藻进行的分子鉴定

扩增2株分离自青岛胶州湾、从形态上初步确定为亚历山大藻属(Alexandrium sp. qd2, Alexandrium sp. qd3)的5.8S 核糖体基因(5.8S rDNA), 转录单元内间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS) 序列、部分18S rDNA和28S rDNA序列.通过blastn比对、系统进化树以及遗传距离分析将A.sp.qd2和A.sp.qd3鉴定为A.catenella,且属于A.catenella 的不同株型.     

产杀虫活性物质海洋放线菌的筛选和初步鉴定

从浙江宁波海域的滩涂泥样中分离到54株海洋放线菌,用卤虫液体测定法进行了杀虫活性菌株的筛选,结果显示多株放线菌具有较高的杀虫活性,菌株XS902,XS904,BL803,BL807对卤虫的ID50高达100以上。同时研究了XS904活性菌株的形态培养特征和生理生化特征,初步鉴定该菌株属于链霉菌属。     

3株海洋来源微生物代谢产物及其抗肿瘤活性

从3株海洋微生物发酵物的抗肿瘤活性部位分离鉴定了放线菌内酯素(1)、2-吡咯酸(2)、5,7,4'-三羟基异黄酮(3)、7,4'-二羟基异黄酮(4)、环(脯-甘)二肽(5)、N-甲酰基-星形孢菌素(6)、过氧化麦角甾醇(7)、6,9-环氧麦角甾-7,22-二烯-3-醇(8)等8个化合物。这些化合物分别产自2株放线菌L39-3(1和2)、L20-1d1(3~6)和1株真菌LJW-110(7和8)。抗肿瘤活性初步测试结果表明,除2和5以外对K562细胞均有不同程度抑制作用,在100μg/mL浓度下的抑制率约在32%~66%范围之内。     

4株长牡蛎(Crassostrea gigas)致病性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)鉴定及其毒力基因检测

为明确江苏连云港养殖长牡蛎大规模死亡病因,对分离自长牡蛎的4株病原菌开展了致病性、表型特征、分子特征等研究,结果表明4株病原菌均具致病性,4株病原菌ML1、ML2、ML3、ML4对长牡蛎的半数致死量LD50分别为2.8×105、1.1×105、1.8×105和1.6×105 CFU/mL;4株病原菌均为呈短杆状革兰氏阴性细菌,氧化酶阳性,还原硝酸盐,能利用甘露醇、纤维二糖,形态及理化特性结果表明4株分离菌与弧菌属的哈维氏弧菌亲缘关系最近;16SrRNA、gyrB、rpoA基因同源性检索及系统发育学分析结果表明4株分离菌与GenBank数据库中哈维氏弧菌的基因序列相似性最高且在系统发育树中聚为1个分支;根据4株分离菌的致病性、表型与分子特征,表明引起长牡蛎大规模死亡的病原为哈维氏弧菌。为进一步明确分离菌株毒力基因的携带情况,检测了分离鉴定的4株病原菌的9种毒力基因,结果表明,4株病原菌均可检测到luxR、toxR、vhhA和vhhB 4种毒力基因,扩增片段大小分别为679bp、390bp、1324bp和216bp,其他5种毒力基因未检测到,且分离鉴定的4株病原哈维氏弧菌携带相同的毒力基因,这些毒力基因可作为检测致病性哈维氏弧菌的分子标记。     

龙须菜果孢子的紫外诱变及优势突变体的筛选

用紫外线辐射处理野生型龙须菜果孢子体放散刚附着的果孢子,并通过耐高温的筛选,初步获得了2株具有耐高温,生长快速等优良性状的四分孢子体突变株,命名为BZT-11和BZT-18,将其与981和野生型藻株进行了比较分析。结果显示,这2株突变体在实验室内和海上的日平均生长速率为均明显高于981和野生型藻株。在热胁迫时间内,BZT-11和BZT-18的丙二醛(MDA)含量均明显低于野生型,超氧化物歧化酶(SOD)活性明显高于野生型;而在整个胁迫过程中2株突变体与981藻株的MDA含量和SOD活性水平差异不显著。经过4h的热激后,藻株BZT-11和BZT-18的hsp70基因表达水平也显著高于野生型。这些结果进一步证明了该2株突变藻体的耐高温优势。本研究提供了耐高温突变体的筛选技术。     

南极海洋低温萘降解菌的筛选、鉴定及其降解特性研究

对从南极地区采集的嗜冷菌NJ41和NJ289的对萘降解特性进行初步研究.确定其最适的培养条件,并在最适培养条件下测定菌株的生长曲线和萘降解曲线.经分子鉴定,NJ41属于动球菌属(Planococcus sp.)、NJ289属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.).实验表明:这2株嗜冷菌均可在以萘等芳香烃为唯一碳源的无机盐培养基中生长,并能够在低温环境(0～10℃)中高效地降解芳香烃;10℃,120 r/min,10 d时,NJ41对于萘的降解能力最高达48.8%,NJ289可达43.5%;温度对降解能力有很大的影响,NJ41和NJ289均在10℃时,具有最高的降解能力,温度升高降解能力下降,NJ41在超过25℃时则基本不具有降解能力,而NJ289在超过20℃时就不具备降解能力.