白缘(鱼央)微卫星分子标记的筛选

用磁珠-生物素标记的微卫星探针(ACA)15与白缘缺(Leiobagrus marginatus)基因组酶切片段杂交,捕获含有微卫星序列的DNA片段,连接到T载体中,构建富集微卫星序列的小片段插入文库,再用γ-32P标记的探针进行二次筛选,获得阳性克隆785个,对其中的140个克隆进行了测序,获得完整的微卫星序列132个．用引物设计软件Primer Premier 5．0设计引物64对．对其中的20对引物进行了多态性检测,筛选到稳定扩增的标记13对,用此13对微卫星引物分析了缺属白缘缺(L．marginalus)、拟缘缺(L．marginatoides)(大、小各1种)、黑尾缺(L．nigricauda)共4个群体的遗传多样性,其中10对微卫星引物在种内或种间表现出多态性．     

磁珠富集法筛选池蝶蚌微卫星分子标记

通过磁珠富集的方法分离池蝶蚌(Hyriopsis Schlegelii)的微卫星分子标记。将池蝶蚌基因组DNA酶切,连接Brown接头,采用PCR技术富集,与探针杂交后杂交复合物结合到包被有链霉亲和素的磁珠上,再将这些片段洗脱,PCR扩增,克隆构建含有微卫星片段的"基因组文库",所得到的阳性克隆进行测序。从所获得的212个阳性克隆中选取110个进行测序,其中54.5%含有微卫星序列,80%的重复序列重复数在10以上,微卫星序列中21.4%为完美型。除探针中使用的AC、AG等重复单元外,还观察到CT、GA、ATG等重复序列。设计获得60对微卫星引物,合成其中的30对经PCR筛选,结果有10对引物扩增出多态性条带。该实验表明:磁珠富集法是获得池蝶蚌微卫星分子标记的一种有效的方法,同时,制备出的微卫星标记可为今后研究池蝶蚌分子遗传多样性提供有用的遗传标记。     

卵形鲳鲹微卫星分子标记的筛选

本研究通过生物素与链霉素的强亲和性原理,采用生物素-磁珠吸附微卫星富集法筛选卵形鲳鲹的微卫星分子标记序列.从201个菌落中挑选出152个阳性克隆进行测序,成功测序137个,微卫星含量达到90.13%,共得到131个重复次数在6次以上的微卫星DNA序列,除生物素探针中使用的CA重复外,还得到TG、TC、GA、ATTT的重复序列.其中完美型85个,占64.9%;非完美型36个,占27.5%;混合型10个,占7.6%.利用PrimerPremier5.0设计引物90对,挑选其中的60对引物进行合成和PCR筛选,结果显示,35对引物可扩增出特异性条带.筛选的卵形鲳鲹微卫星分子标记具有多态性,可用于遗传多样性分析.     

三种倒刺鲃的RAPD种质鉴定

利用33个随机引物研究了光倒刺鲃（Spinibarbus hollandi Oshima）、中华倒刺鲃（S．sinensis Bleeker）和倒刺鲃（S．denticulatus donticulatus Oshima）基因组DNA（RAPD）多态性和种质分子标记。33个随机引物总共扩增得到473条带，多态性片段为365条，占总带的77．2％。其中16个引物共扩增出95个特异性片段，长度主要在200-1500bp，光倒刺鲃特有的为23个、中华倒刺鲃特有的为20个、倒刺鲃特有的为28个，这些特异性片段可作为三种倒刺鲃的分子遗传标记。多态性研究表明，种内相似系数分别为：光倒刺鲃0．6507，倒刺鲃0．6975，中华倒刺鲃0．8180。种间遗传距离分别为，中华倒刺鲃和倒刺鲃0．4915：中华倒刺鲃与光倒刺鲃0．6217；倒刺鲃与光倒刺鲃0．6455。     

菜茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）cbn1和cao突变基因的对比分析及CAO基因的分子定位

用电击法将带有CAO基因片段的Psp109-E8质粒转入到莱茵衣藻cbnl-48mt^＋基因突变株中后．转化子中出现了叶绿素b的恢复性表达，初步验证了丧失合成叶绿素b能力的cbn1和cao突变基因具有等位性的属性；将1641-1b（cbn1-43mt^＋）和CC-1354（cbn1-48mt^＋）突变株分别与CBS5（cao5mt^-）突变株的分离子CBS5-c1和CBS5-c5进行杂交．并通过随机分析方法分离获得1842个减数分裂后代分离子．经检测其中均没有发现有野生性表型的分离子．初步证明cbn1和cao4突变基因问有着非常紧密的连锁性；从上述杂交系分离获得的50多个四分子中也没有检测发现显示野生性表型的分离子．进一步证明了cbn1和cao突变基因具有等位性的属性；根据CAO基因的DNA序列，从5＇-端和3’-端设计两个探针，分别与莱茵衣藻核基因组I号染色体上GBP1和RB47分子标记之间的21个BAC克隆进行的点杂交实验结果显示．该两个探针序列与21号BAC克隆（莱茵衣藻BAC文库序列号33e2）片段均有同源区的特性，此项DNA杂交实验初步证明．CAO基因的位点是在cbml突 变基因左右两侧的GBP1和RB47两个分子标记之间的33e2 BAC克隆片段区．     

水稻抗稻瘟病、绿叶蝉和黄萎病基因BAC克隆的物理定位

植物单拷贝短序列的染色体原位杂交的检出率一直很低．水稻ＢＡＣ克隆作为一种大容量载体的基因组克隆因其独特的优点已被应用于水稻基因组研究．用生物素标记了两个水稻ＢＡＣ克隆，这两个克隆分别含与抗稻瘟病基因Ｐｉ－５（ｔ）、抗稻绿叶蝉基因Ｇｌｈ和抗稻黄萎病基因ＲＴＳＶ在连锁图中等位的ｃＤＮＡ标记ＲＺ５６５和ＲＺ２６２，并用其进行了水稻染色体原位杂交．它们分别被定位在水稻第四染色体长臂距着丝粒百分距离４０％和短臂１００％处．由于供杂交ＢＡＣ克隆含与３种抗病基因等位的标记，因此这些克隆的位置也就是供测抗病基因的位置．杂交检出率由迄今沿用的质粒克隆探针杂交的１０％以下提高到了４６．８％和５９．２％．检出染色体的号数与遗传图确定的染色体相符，证实了用ＢＡＣ克隆进行染色体原位杂交的优越性，为广泛利用水稻ＢＡＣ克隆进行单拷贝小片段基因的定位打下了基础．     

西藏近缘野生大麦RAPD和ISSR分子标记的遗传多样性

采用随机扩增多态性分析（RAPD）和简单序列重复区间分析（ISSR）分子标记对110份青藏高原近缘野生大麦材料进行了遗传多样性分析．分别选取30条RAPD引物和10条ISSR引物进行PCR分析．结果表明30条RAPD引物共扩增出195条带，其中多态性位点比率为93．33％；10条ISSR引物共扩增出93条带，其中多态性位点比率为98．92％；研究证明ISSR标记能检测出比RAPD标记更多的遗传多态性．利用POPGNEN32软件对RAPD和ISSR结果进行遗传一致性系数分析，表明各居群的遗传相似性较高．利用算术平均的非加权成对分组法（UPGMA法）对RAPD标记和ISSR标记结果构建西藏近缘野生大麦聚类树状图，可将7个供试大麦居群聚为2组：一组包含所有来自西藏的居群，在ISSR树状图中阿里地区除外；而青海地区的聚为另外一组．结果表明，西藏地区近缘野生大麦具有较高的遗传多样性，为进一步证明西藏是大麦的起源中心之一的理论积累了有益的资料．     

浙贝母4品种及5种贝母遗传多样性的RAPD分析

通过RAPD技术对浙贝母的多子、宽叶、狭叶（浙贝1号）和岭下4个品种和贝母属的浙贝母、川贝母、皖贝母、东贝母、伊贝母5个种的遗传多样性进行了分析,并对预筛选得到的9种多态性丰富的引物进行了RAPD扩增,得到了57条清晰可辨的扩增片段,其中48条多态性谱带,占总谱带数的84．21％．研究结果表明：4个品种之间,多子贝母与其他3个品种间遗传分化较大;5个贝母种之间的相似性系数为0．2105～0．8492,其中东贝母与浙贝母亲缘关系最近,伊贝母与其他贝母亲缘关系最远;筛选到的分子标记对于浙贝母不同品种和贝母不同种的鉴别具有重要的意义．     

依据RAPD片段克隆而建立的团头鲂PCR鉴定法

通过对团头鲂RAPD片段的克隆、Southern杂交筛选和DNA序列分析,设计出3对PCR引物：M1F／M1R、M3F／M3R和M5F／M5R,这3对引物分别扩增出约1．00、1．15、0．56kb的DNA主带;HaeⅢ能将前两个片段酶民两个几乎相等或相似的小片段。经部分团头鲂群体和其它12种鱼DNAPCR验,除三角鲂外,这3对引物具有很强的团头鲂特羿性,重复性100％,可以用于除三角钫以外的团头鲂的分子标记或分子鉴定。     

乌龟线粒体细胞色素b基因片段的初步研究

于2004年3月从浙江省级中华草龟良种场采集5只乌龟（Chinemys reevesii）．参照鱼类的线粒体细胞色素b基因序列设计合成1对引物，扩增了乌龟的细胞色素b基因片段，并对扩增产物进行序列测定分析．结果在5个个体中都获得序列相同的细胞色素b基因片段，长度为408bp，其中A、T、G、C含量分别为125bp（30．6％）、113bp（27、7％）、51bp（12．5％）、119bp（29．2％），与其他水生动物相同基因片段碱基序列含量相似．     

中国西藏与中东地区近缘野生大麦遗传多样性的SSR标记分析

应用简单重复序列（SSR）标记方法对90个近缘野生大麦样本进行了遗传多样性分析，其中包括45份中国西藏近缘野生大麦样本和45份中东地区近缘野生大麦样本．从大麦的7个连锁群中选取27对引物用于PCR扩增，结果有11对引物扩增出有效多态性片段．11对引物共检测到126个等位变异位点，每对引物检测到5～22个SSR等位变异位点，平均每对引物检测到11．45个等位变异位点．中国西藏近缘野生大麦比中东地区近缘野生大麦平均每对引物多检测出2个位点．SSR结果采用NTSYS软件进行相似性系数计算，POPGNEN32软件进行遗传多样性系数计算，算术平均的非加权成对分组法（UPGMA法）构建聚类树状图，结果表明中国西藏近缘野生大麦样本比中东地区近缘野生大麦样本具有更高的遗传多样性，这为大麦的东方起源学说提供了新的佐证．     

外显子拼接法合成真菌灵芝漆酶基因cDNA

为真菌漆酶基因cDNA的克隆提供了一种简便快速的新方法．从含有内含子的灵芝漆酶基因出发，采用外显子拼接PCR方法，合成了灵芝漆酶的cDNA．设计了10对引物分别经PCR扩增该基因的10个外显子，引物设计使前一个外显子的下游引物与下一个外显子的上游引物都有一段同源匹配序列，然后通过两两片段混合作为模板PCR扩增得到两两拼接的外显子片段，再将得到的5个片段前两个混合，后3个混合分别作为模板扩增获得拼接好的外显子1～4大片段和外显子5～10大片段，最后将这两个大片段混合作为模板扩增得到拼接好的全长cDNA序列．与常规方法相比，该方法既避免了RNA的操作，又不用摸索酶表达的条件，可以和基因组步行技术结合快速获得真菌漆酶基因的cDNA．     

利用RAPD分子标记在我国杂交水稻主要恢复系的DNA多态性研究

用258个RAPD引物分析了我国杂交水稻35个主要恢复系,其中42个引物具有多态性,从中筛选出13个RAPD引物,可检测出重演性较好的多态性片段93条,能够有效地区分所有供试的恢复系材料,聚类分析显示：在GS＝0．57附近,可将35个恢复系材料聚为4类,大部分材料的遗传相似系数在0．80以上,表明我国杂交水稻恢复资源比较丰富,但其遗传差异较小,遗传背景比较单一,从而在很大程度上限制了我国水稻杂种优劣的利用。     

稻属核糖体DNA的限制性片段长度多态性

对稻属13个种和Porteresiacoaretata、Leersiaperrieri及Leersiatisseranti共42份材料进行了核糖体RNA基因（rDNA）的间隔序列长度多态性（RFLP）的分析．共发现20种的间隔序列长度变异类型,其中有些类型具有种的特异性．中国药用野生稻的rDNA变异程度很小,疣粒野生稻的rDNA有变异．Leersiaperrieri和Leersiatisseranti的BamHI酶切转录区片段长度为3．90kb,与稻属的3．80kb．不同．     

中国珍稀濒危特有蕨类植物--云贵水韭的遗传多样性

采用随机扩增的多态性DNA（RAPD）方法对云贵水韭现存于贵州平坝境内的惟一的自然居群46个样晶进行厂DNA多态性分析．从60个随机引物中l筛选出12个有效引物，共产生95条DNA片段，其巾59条具有遗传多忿性，多态化点百分率（PPB）为62．1％．与其他蕨类植物相比，云贵水韭居群内存仵较高水平的遗传多样性，较高水甲的遗传多样性，一方面可能足由丁遗传变异长期积累的结果，同时也可能是近期生境的破坏还没有较严晕地到使其遗传多样性丧失．随符居群规模的减小，云贵水韭的遗传多样性将会逐渐丧失，建议用现存于平坝居群的云贵水北材料对其居群进行了恢复重建．     

寒兰转录组SSR信息分析及其分子标记开发

寒兰(Cymbidium kanran)是中国传统名花,其观赏与经济价值极高。简单重复序列(simple sequence repeats,SSR),又名微卫星标记,有多态性高,非共显性等优势。基于转录组数据对SSR标记的开发具有经济效能高等优点,通过高通量测序平台对寒兰EST-SSR标记进行开发,了解其在转录组序列中的分布类型及特性,为寒兰的SSR多样性的分析及遗传图谱构建奠定基础。通过MISA程序筛选寒兰转录组测序得到的68699条unigene(序列总长60.06 Mb),并分析了其SSR位点分布情况,获得了9837个SSR位点,在总unigene的比例为14.32%,平均每6.25kb出现1个SSR。SSR位点中二核苷酸重复频率达到最高,占55.22%,其中AG/CT高达38.83%;接下来为三、单核苷酸重复,频率依次为25.37%和14.49%。利用Primer3共设计出6017对SSR引物。随机选取141对引物进行PCR扩增,有79对引物扩增得到的条带清晰可重复,15对在15个不同地区寒兰中表现出多态性。结果表明,本研究中设计的SSR引物在寒兰遗传多样性分析中具有较高的适用性,可用于寒兰的遗传研究。     

长江中国胭脂鱼群体的遗传分化

研究采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR—RFLP）技术，分析了长江上、中游的宜宾、万州、宜昌和武汉金口4个江段的中国胭脂鱼群体的遗传结构．用13个限制性内切酶分析了4个群体线粒体DNAND-5／6片段的限制性片段长度多态性，发现Nci Ⅰ的酶切类型多态性是表现中国胭脂鱼遗传多样性的特异性标志．根据其酶切图谱显示的群体之间存在的多态性，计算出遗传距离和核酸序列差异程度．分析表明，长江宜宾江段的中国胭脂鱼群体与其他3群体产生了明显的歧化现象，长江中、下游群体间的基因交流好于上游群体，中国胭脂鱼群体内遗传结构比较单一，其群体的遗传多样性程度有进一步减退的可能性．     

5种体色瓯江彩鲤线粒体COⅡ基因的序列差异和遗传标记研究

利用PCR方法扩增获得瓯江彩鲤（Cyprinus carpio var．color）线粒体DNA的COⅡ基因,测定该基因片段序列．分析了瓯江彩鲤“全红”、“粉玉”、“粉花”、“麻花”和“大花”共20只个体的序列核苷酸位点差异和遗传多态性．结果表明,“大花”和“全红”遗传多样性最为丰富,“粉花”的遗传多样性相对贫乏．在长度为604bp的基因片段中,共检测到9个多态性核苷酸位点（占1．49%）,20只个体具有4种基因型,5种体色各自的平均核苷酸位点差异分别为0．38％、0．2％、0、0．13％和0．47％．UPGMA分子系统聚类树显示,“粉花”、“麻花”和“粉玉”的遗传关系接近;“全红”相对独立成一支,与其他4种体色瓯江彩鲤的遗传关系较远．COⅡ基因可以作为区分三分支群体的遗传标记．     

5种体色瓯江彩鲤线粒体COII基因的序列差异和遗传标记研究

利用PCR方法扩增获得瓯江彩鲤（Cyprinus carpio var．color）线粒体DNA的COⅡ基因,测定该基因片段序列．分析了瓯江彩鲤“全红”、“粉玉”、“粉花”、“麻花”和“大花”共20只个体的序列核苷酸位点差异和遗传多态性．结果表明,“大花”和“全红”遗传多样性最为丰富,“粉花”的遗传多样性相对贫乏．在长度为604bp的基因片段中,共检测到9个多态性核苷酸位点（占1．49%）,20只个体具有4种基因型,5种体色各自的平均核苷酸位点差异分别为0．38％、0．2％、0、0．13％和0．47％．UPGMA分子系统聚类树显示,“粉花”、“麻花”和“粉玉”的遗传关系接近;“全红”相对独立成一支,与其他4种体色瓯江彩鲤的遗传关系较远．COⅡ基因可以作为区分三分支群体的遗传标记．     

菊花EST-SSR标记的开发与应用

从NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库下载7 259条菊花相关表达序列标签(EST)序列,经去除冗余序列拼接后得到3 784条Uni-ESTs,总长度为2 088.6kb.用MISA软件查找其简单重复序列(SSR)位点,共获得407个SSR位点,分布于355条EST上,出现的频率为10.76%.在搜索到的EST-SSR中,三核苷酸重复类型占主导地位,所占比例为47.42%.共观察到76种重复基元,出现最多的重复基元是A/T和ACC/GGT,其次为ATC/ATG,AAC/GTT,AC/GT,AAT/ATT.根据搜索结果随机设计了24对菊花EST-SSR引物,对14个菊花品种进行PCR扩增,发现有12对引物有较清晰且稳定的扩增产物(其中10对引物的产物存在多态性),共检出37个位点(其中多态性位点32个),平均每对引物可扩增出3.2条多态性片段.遗传相似性分析显示,14个品种的遗传相似系数在0.61～0.84之间,平均相似系数为0.67.