金属镉应答新基因TEF-1β的致癌力鉴定

目的 前期研究已发现金属镉应答新基因TEF-1β转染NIH3T3细胞可致其编码蛋白质表达升高而引起细胞转化。本研究的目的是对TEF-1β基因转化NIH3T3细胞的致癌能力和致瘤性进行鉴定。方法软琼脂集落形成试验和裸鼠成瘤实验。结果所有4株不同的TEF-1β转染发生转化的NIH3T3细胞在软琼脂培养中均显示锚非依赖性生长能力，形成明显的细胞集落。而非转化对照细胞在软琼脂上则无生长能力。转化细胞和对照细胞分别给裸鼠皮下注射(每组4只，5组共20只)，1周后，转化细胞组的绝大部分裸鼠下背部皮下开始出现肿瘤，4周后所有4种不同转化细胞株接种的裸鼠全部长出大小不等的肿瘤，但非转化对照细胞于第5周后仍无一只裸鼠出现肿瘤。提示TEF-1β转基因转化细胞属恶性转化细胞，具有明显的致癌能力和致瘤作用。结论根据本研究结果及前期发现，可以认为新发现的TEF-1β是一个镉应答原癌基因。     

TIF3镉应答基因的致癌性

[目的 ]前期研究发现 ,镉相关新基因TIF3 (基因文库添码 :AF2 710 72 )转染NIH3T3细胞可致其编码蛋白质表达升高而引起细胞转化。本研究的目的是对TIF3基因转化NIH3T3细胞的致癌能力和致瘤性进行鉴定。 [方法 ]软琼脂集落形成试验和裸鼠成瘤试验。 [结果 ]所有 4株不同的TIF3转染的NIH3T3细胞在软琼脂培养中均显示锚非依赖性生长能力 ,形成明显的细胞集落。而非转化对照细胞在软琼脂上则无生长能力。转化细胞和对照细胞分别给裸鼠皮下注射 (每组 4只 ) ,4周后所有接种转化细胞的裸鼠全部长出大小不等的肿瘤 ,但非转化的对照细胞于第 5周后仍无 1只裸鼠出现肿瘤。提示TIF3转基因转化细胞属恶性转化细胞 ,具有一定的致癌能力和致瘤作用。 [结论 ]根据本研究结果及前期发现 ,可以认为新发现的TIF3是一个镉应答原癌基因     

反义TIF3逆转镉转化BALB/c-3T3细胞的致癌性

为探讨反义TIF3能否逆转镉转化细胞的致癌性 ,用磷酸钙介导转染法和G418细胞筛选技术 ,建立CdCl2 转化BALB c 3T3细胞反义TIF3稳定表达系统 ,再用软琼脂检测和裸鼠致瘤试验对这些转基因细胞的致癌性逆转情况进行鉴定。结果显示CdCl2 转化BALB c 3T3细胞中反义TIF3表达可逆转这些细胞的转化表型 ,与非转染细胞和载体转染对照细胞比较 ,转染反义TIF3的镉转化细胞在软琼脂上所形成的锚非依赖性生长集落减少 2 5 %～ 70 %。转染反义TIF3基因的镉转化细胞可延迟裸鼠出现肿瘤的时间 ,而且这些肿瘤的大小显著变小 ,肿瘤重量平均下降 5 0 8%～ 5 5 1%。提示反义TIF3mRNA表达可逆转镉转化细胞的致癌性 ;应用反义TIF3阻断TIF3癌基因表达对镉诱发的肿瘤可能有治疗价值     

镉应答癌基因蛋白对细胞原癌基因表达的影响

目的探讨镉应答癌基因蛋白(TEF-1δ编码蛋白)对多种不同细胞肿瘤相关基因表达的影响，以阐明镉的分子致癌机制。方法应用TEF-1δ基因真核细胞稳定表达系统和Western blot检测技术，用各种单克隆抗体检测细胞肿瘤相关基因蛋白的表达情况。结果相对于载体转染中国地鼠卵巢细胞(CHO)对照细胞，在4株具有高效稳定表达TEF-1δ编码蛋白质的CHO细胞系中均有细胞原癌基因C-fos高表达，其编码蛋白(55kDa)含量均明显高于对照组。同样，4株高效稳定表达TEF-1δ编码蛋白质的CHO系均具有相对较高的细胞周期调控基因Cyclln D1(编码蛋白36kDa)的表达。其余肿瘤相关基因蛋白如pan-ras，c-myc，c-jun，MDM2，ODC，p16，p53的表达在TEF-1δ转基因细胞与对照细胞之间未见明显差别。结论镉应答原癌基因TEF-1δ的超额表达可调高细胞原癌基因c-fos和细胞周期调控基因Cyclin Dl的表达，这可能是镉应答原癌基因TEF-1δ的分子致癌机制。     

氯化镉诱发人支气管上皮细胞系恶性转化

目的研究氯化镉诱发SV40 LargeT抗原永生化的人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化作用。方法体外用不同浓度氯化镉多次处理16HBE细胞,软琼脂集落形成和裸鼠成瘤试验鉴定转化细胞的恶性度。结果细胞培养至35代,发现氯化镉可诱导16HBE恶性转化。转化细胞排列紊乱、重叠生长,在软琼脂中的集落形成率显著高于对照组(P<0.01),并呈时间—剂量依赖关系;转化细胞在裸鼠体内成瘤,组织学证实为低分化鳞状细胞癌。结论氯化镉有较强的诱导16HBE恶性转化能力;该转化模型为镉致癌机制的分子水平提供了理想的研究系统。     

NiCl2诱导人支气管上皮细胞系恶性转化的研究

目的 建立NiCl2诱导永生化人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化的模型，为下一步关于镍化合物致癌的分子机制的研究提供相应的恶性转化细胞。方法 通过克隆形成率实验确定NiCl2诱导16HBE细胞转化浓度后，对16HBE细胞进行分阶段多次染毒，每隔20d染毒1次，每次染毒24h。染毒12次后，通过软琼脂集落形成试验和裸鼠体内致瘤试验鉴定细胞恶性转化程度。结果 经NiCl2多次处理，16HBE细胞至75代时，细胞生长速度加快，排列紊乱，失去接触抑制，出现复层生长，并可在软琼脂上生长，且呈剂量一反应关系，但在第75代之前的细胞则不能在软琼脂上生长。转化细胞在裸鼠体内成瘤，病理组织学证实为低分化鳞状细胞癌。结论NiCl2具有使16HBE细胞发生恶性转化的能力。     

石英诱发人支气管上皮细胞恶性转化模型的建立

目的 研究石英诱发永生化的人支气管上皮细胞系(16HBE)的恶性转化作用.方法 用新研磨的浓度为300 mg/L的石英染毒16HBE细胞共10次,软琼脂集落形成实验和裸鼠成瘤实验鉴定转化细胞的恶性程度.结果 细胞培养至35代,发现石英可以诱导16HBE发生恶性转化.转化细胞排列紊乱,重叠生长,在软琼脂中的集落形成率显著高于对照组(P<0.01);转化细胞在裸鼠体内成瘤.结论 石英具有较强的诱导16HBE恶性转化能力.     

硫酸镍对永生化人支气管上皮细胞系的恶性转化研究

目的 建立硫酸镍(NiSO4)对永生化人支气管上皮细胞系(16HBE)的恶性转化模型，为下一步关于镍化合物致癌的分子机制的研究提供相应的恶性转化细胞。方法 通过克隆形成率实验确定NiSO4对16HBE细胞转化浓度后，对16HBE细胞进行分阶段多次染毒：每隔20d染毒一次，每次染毒24h。染毒12次后，通过软琼脂集落形成实验和棵鼠体内致瘤实验鉴定细胞恶性转化程度。结果 经NiSO4多次处理16HBE细胞至75代时，细胞生长速度加快，排列紊乱，失去接触抑制，出现复层生长，并可在软琼脂上生长，且呈剂量反应关系，但在第75代之前的细胞则不能在软琼脂上生长。转化细胞在裸鼠体内形成瘤，病理组织学证实为低分化鳞状细胞瘤。结论 NiSO4具有使16HBE细胞发生恶性转化的能力。     

对苯二胺氧化产物的细胞恶性转化研究

目的：探讨氧化型染发剂潜在的致癌危险性。方法：以NIH3T3细胞株建立体外细胞转化系统，以氧化型染发剂的主要成分对苯二胺与双氧水混合后的氧化产物作为受试物，观察其对细胞的转化作用。结果：在试验剂量(0．8、0．4、0．2、0．1μg／ml)范围内，对苯二胺氧化产物均能诱导NIH3T3细胞发生转化，并呈现良好的剂量-反应关系。转化细胞能够在软琼脂中生长，并具有恶性特征。结论：对苯二胺氧化产物具有诱导NIH3T3细胞恶性转化的作用，提示氧化型染发剂对机体有潜在的致癌危险性。     

甲基丙烯酸环氧丙酯致人支气管上皮细胞恶性转化研究

目的 研究潜在致癌化学物甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)诱发人支气管上皮细胞恶性转化的作用.方法 分别采用1、2、4、8μg/ml浓度的GMA多次处理人支气管上皮细胞(16HBE),连续动态地观察细胞形态学的改变,通过刀豆凝集素A(conA)试验、软琼脂集落形成试验、电镜扫描和裸鼠体内致瘤性试验观察细胞的恶性转化表型,并运用免疫化学方法对细胞和肿瘤组织来源特性进行鉴定.试验同时设二甲基亚砜(DMSO)溶剂对照组和三甲基胆蒽(MCA)阳性对照组.结果 1～8 μg/ml浓度范围的GMA多次攻击可使16HBE细胞发生恶性转化,转化率随染毒剂量的增加而升高,其中8μg/ml染毒组的转化率(8.48×10-6)与对照组(4.5×10-7)相比差异有统计学意义(P<0.01).转化细胞失去接触抑制呈交错重叠生长并能在软琼脂上形成集落,各剂量组的集落形成率随染毒剂量的增加而升高,其中2、4、8μg/ml染毒组的集落形成率分别为1.20‰、2.35‰和5.70‰,与溶剂对照组(0.30‰)相比差异有统计学意义(P<0.01).转化细胞对conA的凝集敏感性增加,扫描电镜下细胞表面微绒毛增多、变粗、变长.将转化细胞接种于裸鼠皮下可形成肿块,经病理组织学检查诊断为鳞状上皮细胞癌.16HBE细胞和肿块组织经免疫组织化学检测角蛋白呈阳性表达.结论GMA可在体外诱发16HBE细胞发生恶性转化.     

Rap2b基因表达对NIH3T3细胞集落形成及细胞伤口愈合能力的影响

目的了解Rap2b基因对NIH3T3细胞集落形成及细胞伤口愈合能力的影响,为探讨该基因在人肺癌发生中的作用提供实验依据。方法以人肺CDNA为模板克隆出Rap2b基因片段,构建pcDNA3.1-Rap2b真核表达载体,稳定转染NIH3T3细胞,利用集落形成试验和细胞伤口愈合试验,观察细胞集落形成及细胞伤口愈合能力的改变。结果与转染空质粒的细胞对比,转染pcDNA3.1-Rap2b质粒的细胞集落形成数目明显增加(P0.01),损伤修复愈合增快。结论 Rap2b基因表达可显著增加NIH3T3细胞集落形成,并增快该细胞的损伤愈合速度。提示Rap2b基因表达可能具有促进NIH3T3细胞增殖和恶性转化功能。     

叶绿酸对反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘抗细胞转化活性的影响

目的研究叶绿酸对反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘(反式-BPDE)诱发的SV40 large T抗原永生化的人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化的抑制作用.方法在反式- BPDE诱导的细胞转化整个过程中,分别加入浓度为10、50和100 μmol/L的叶绿酸,应用刀豆凝集素(ConA)凝集实验、软琼脂集落形成实验和裸鼠成瘤实验进行细胞恶性度鉴定.结果细胞培养至25代,发现叶绿酸和反式-BPDE共处理组细胞与反式-BPDE单独处理组细胞相比,前者ConA凝集时间延长;叶绿酸和反式-BPDE共处理组细胞在软琼脂中集落形成率分别为7.4‰、11.4‰和14.4‰,明显低于反式-BPDE单独处理组(19.6‰),且有剂量反应关系;各处理组细胞均能在裸鼠体内成瘤,叶绿酸和BPDE共处理组在裸鼠体内生长的肿瘤体积分别为(0.43±0.13) cm3、(0.22±0.04) cm3、(0.10±0.06) cm3,明显小于BPDE单独处理组的(1.71±0.37)cm3,并有剂量依赖关系,肿瘤组织经病理学证实为低分化鳞状细胞癌.结论体外试验显示叶绿酸具有一定的抗细胞恶变能力.     

镍冶炼烟尘致NIH3T3细胞形态转化作用的实验研究

目的　研究镍冶炼工人接触烟尘的生物学效应。方法　以来自我国两家镍冶炼厂的镍冶炼烟尘为受试物 ,处理小鼠NIH3T3细胞 ,观察细胞吞噬活性、毒性和转化活性 ,预测镍冶炼烟尘的致癌危险性。结果　 (1)两种镍冶炼烟尘均可被NIH3T3细胞吞噬 ,两样品在 10 0 .0 0 0 μg/ml剂量的吞噬率分别为6 9 .0 %、39.0 % ,2 0 0 .0 0 0 μg/ml剂量的吞噬率分别为 78.0 %、4 7.0 % ,差异均有显著性 (P <0 .0 1)。剂量为12 .5 0 0～ 10 0 .0 0 0 μg/ml时 ,两样品的相对克隆形成率分别为 71.1%～ 3.9%和 84 .4 %～9.1%。两种镍冶炼烟尘以克隆形成率表示的细胞毒性与Ni2 O3 接近 ,高于TiO2 ,而低于阳性对照物N 甲基 N’ 硝基 N 亚硝基胍 (MNNG)。 (2 )MNNG、Ni2 O3 和两份镍冶炼烟尘均可诱发NIH3T3细胞发生形态转化 ,两种镍冶炼烟尘在 12 .5 0 0～ 5 0 .0 0 0 μg/ml范围内的转化率分别为 1.9%～ 3.6 %和 0 .9%～ 2 .5 %。 (3)MNNG和镍冶炼烟尘处理的NIH3T3细胞均可与刀豆素A(ConA)发生凝集反应 ,并能在软琼脂培养基中形成集落 ,验证了转化克隆的可靠性。结论　镍冶炼烟尘具有细胞转化活性 ,为镍冶炼烟尘的致癌危险性以及镍冶炼工肺癌的病因学研究提供了新的实验室证据。     

甲基丙烯酸环氧丙酯对BALB/c 3T3细胞恶性转化的实验研究

利用建立的 BALB/c 3T3细胞转化系统进行甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)的细胞转化和裸鼠诱癌的实验研究。实验结果表明:GMA 可诱导 BALB/c 3T3细胞形态转化,并呈剂量-反应关系;从转化灶分离扩增细胞,经电镜扫描观察到转化细胞表面形态改变,可被植物凝集素 ConA凝集,并在半固体琼脂生长,在同品系裸鼠皮下形成了肿瘤,病理组织检查结果为分化程度较低的纤维肉瘤。GMA 有很强的诱导细胞恶性转化的能力,提示 GMA 有潜在的致癌危险性。     

PP2Ac去甲基化在BaP诱导HBE细胞恶性转化中的作用

目的探讨蛋白磷酸酶2A催化亚基(PP2Ac)去甲基化在苯并(a)芘(benzo[a]pyrene,BaP)诱导人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial,HBE)恶性转化中的变化及可能作用。方法用40μmol/L BaP处理人支气管上皮细胞,每周一次,共15周,构建BaP诱导的HBE细胞恶性转化模型,采用软琼脂试验和裸鼠成瘤试验鉴定恶性转化是否构建成功,使用蛋白免疫印迹(Western blot)分析比较恶性转化细胞和同期对照组细胞中PP2Ac去甲基化及其调节蛋白表达变化。结果软琼脂试验和裸鼠成瘤试验结果显示,经BaP处理后的细胞能在软琼脂中形成细胞集落,接种BaP诱导转化细胞的裸鼠可见肿块,说明恶性转化成功。蛋白免疫印迹(Western blot)检测蛋白表达发现,经BaP诱导恶性转化的HBE细胞和经100μmol/L BaP单次刺激24 h的HBE细胞与正常HBE细胞相比,总PP2Ac表达均无差异,亮氨酸羧基甲基转移酶1(LCMT1)表达均明显下降,蛋白磷酸酶甲基酯酶1(PME-1)和PP2Ac去甲基化(Dem-PP2Ac)表达均明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论 PP2Ac去甲基化在BaP诱导细胞恶性转化中发挥作用,可能通过增强PP2Ac去甲基化促进BaP致肺癌发生。     

长期砷暴露诱导人膀胱上皮细胞恶性转化的研究

目的构建低浓度长期亚砷酸钠(NaAsO_2)诱导人膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)恶性转化模型,研究低浓度长期砷暴露对SV-HUC-1恶性转化过程的影响。方法 0和0. 5μmol/L NaAsO_2分别长期处理SV-HUC-1至40周(约80代,10个月),观察暴露组及对照组细胞在培养至10、20、30和40周时形态,四氮唑盐比色(MTT)验证细胞增殖速率;划痕实验、Transwell细胞迁移实验验证细胞迁移能力;软琼脂集落形成实验观察细胞肿瘤形成能力。结果随NaAsO_2处理时间的延长,细胞由连接紧密的扁平多变形状向松散的长梭型转变; 0. 5μmol/L NaAsO_2处理至20周后,细胞活力显著增强,与处理10周时比较差异有统计学意义(P0. 01);划痕愈合实验显示,砷暴露20周后,划痕愈合面积显著大于10周(P0. 01); Transwell细胞迁移侵袭能力30周时显著高于10周(P0. 01);软琼脂集落形成实验显示,砷暴露30周后软琼脂上出现大量明显的锚定生长集落,20、30、40周组集落形成数量分别为10周组的1. 85、9. 79和15. 36倍(P0. 01),未经砷暴露组各代数有极少集落,且体积小,故忽略不计。结论 0. 5μmol/LNaAsO_2长期处理的SV-HUC-1可逐渐恶转,在砷处理20～30周时已初具恶性表型,40周后细胞恶性转化。     

苯并(a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘诱发人支气管上皮细胞恶性转化

以不同浓度的苯并 (a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘 (BPDE)多次处理人支气管上皮细胞 16HBE ,并观察转化细胞的恶性特征。发现BPDE可诱导 16HBE细胞恶性转化 ,形成转化灶。转化灶细胞失去接触抑制 ,排列紊乱 ,无方向性 ,交叉重叠生长。转化的细胞可在软琼脂上生长 ,各浓度处理组细胞集落形成率均显著高于对照组 ,有良好的剂量—反应关系。经BPDE处理的细胞在裸鼠体内成瘤 ,病理学诊断为鳞状细胞癌。本实验以反式BPDE成功地诱发了人支气管上皮细胞恶性转化 ,为后期进一步研究其致癌的分子机制、寻找致癌相关基因提供了理想的生物学材料。     

镉相关新基因TIF3的蛋白表达与细胞转化功能研究

目的：探讨TIF3基因在镉细胞转化和致癌过程中的重要作用。方法：用细胞转染，Western blot，以及细胞转化等技术与方法，对克隆化基因TIF3的生物学功能进行研究。结果：TIF3cDNA以pcDNA3.1/V5-His-TOPO为表达载体所转染的CHO细胞和猴肾OCS1细胞均可表达分子量为36000的TIF3编码蛋白质，而非转染和单纯载体转染的对照细胞则无此蛋白表达；此外，TIF3cDNA转染NIH3T3细胞可导致TIF3蛋白质超额表达，并与细胞转化密切相关。结论：镉的细胞转化和致癌作用至少部分是因TIF3基因的高表达所致。     

癌基因高表达人上皮细胞转化模型的构建及应用

目的 构建癌基因高表达人支气管上皮细胞模型并应用于致癌物诱导细胞恶性转化活性的检测.方法 在永生化人支气管上皮细胞株16HBE中依次导入人端粒酶催化亚基(hTERT)、癌基因H-RasV12或c-Myc或空白载体,构建细胞株16HBETR、16HBETM和16HBETV.检测所构建细胞株的生物学特性如细胞形态、细胞生长、染色体畸变等指标.用已知致癌物硫酸镍(NiSO4)和二氢二醇环氧苯并(a)芘(BPDE)多次染毒,利用软琼脂试验及荷瘤试验检测化学物诱导细胞转化的活性.结果 经过端粒酶活性测定以及蛋白印迹验证上述转基因16HBE细胞株均构建成功.癌基因H-Ras和c-Myc的表达分别使细胞的增殖加速30.3%和10.4%,但是细胞染色体的畸变率没有发生改变.癌基因高表达细胞株只在软琼脂中形成少数背景克隆,但不能在裸鼠皮下形成肿瘤.BPDE诱导16HBETR、16HBETM细胞发生恶性转化的间期分别为5周、11周,比对照组细胞16HBETV的20周分别提前了15周和9周;而硫酸镍诱导16HBETR、16HBETM细胞转化的间期分别为11周、14周.比对照组细胞的32周分别提前了21周和18周.结论 癌基因高表达的细胞转化模型可大大缩短试验间期,有望应用于环境致癌物的筛查及化学致癌机制的研究.     

微囊藻毒素-LR诱导的恶性转化肝细胞miRNA表达谱的变化

目的构建微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)诱导的人永生化肝细胞株(WRL68细胞)恶性转化模型,检测mi RNA表达谱,寻找差异表达的mi RNA。方法用10 nmol/L MC-LR对WRL68细胞进行连续染毒至第25代,进行软琼脂集落形成实验及裸鼠成瘤实验。通过mi RNA芯片技术检测和分析对照WRL68细胞和恶性转化细胞的mi RNA表达谱;采用实时荧光定量PCR对芯片结果加以验证;应用Target Scan在线软件预测mi RNA可能调控的靶基因。结果第25代MC-LR染毒组细胞在软琼脂中可以形成集落,能在裸鼠皮下形成肿瘤。芯片检测分析显示,表达差异显著的mi RNA有54个,表达上调有35个,表达下调有19个。实时荧光定量PCR结果显示,hsa-mi R-140-3p、hsa-mi R-19b-1-5p、hsami R-203a和hsa-mi R-494均下调(P0.05),与芯片检测结果趋势一致。以生物信息学技术分析mi R-494可能调控的靶基因,结果预测到3个与肿瘤相关的潜在靶基因,分别是肿瘤坏死因子受体相关因子3(TNF receptor-associated factor 3,TRAF3)、微管相关肿瘤抑制基因(microtubule associated tumor suppressor 1,MTUS1)和结肠癌转移相关基因(metastasis associated in colon cancer 1,MACC1)。结论 MC-LR诱导肝细胞恶性转化过程中可引起mi RNA表达谱发生显著改变,差异表达的mi RNA可能在肝细胞恶性转化过程中起着重要作用。