Cilp基因对斑马鱼肌间骨和脊椎发育的影响

为阐明cilp基因在斑马鱼椎骨和肌间骨发育中的作用,利用CRISPR/Cas9建立了斑马鱼cilp基因敲除纯合突变系（cilp-/-）,对其进行了骨骼表型的观察,并进一步采用qRT-PCR分析了14个骨骼发育相关基因在突变体胚胎发育阶段和成鱼骨骼中的表达水平变化。结果显示,与野生型斑马鱼相比,90 dph（days post hatched）cilp-/-斑马鱼的肌间骨数量显著减少了10.27%（P<0.05）,而肌间骨的长度无明显变化;同时突变体斑马鱼中椎骨发生异常融合及髓棘缺失。qRT-PCR结果显示,与野生型相比,col1a1a、sp7、smad4a和smad5基因在胚胎发育的整个时期都存在显著的差异（P<0.01）;在突变体成鱼尾部骨骼组织中bmp2a、bmp2b、smad5、sp7、runx2a、runx2b和bglap基因的表达量均显著低于野生型,表明cilp基因敲除导致了BMPs和SMADs家族基因的表达水平下降,并下调了下游的成骨细胞发育相关基因的表达量,推测cilp功能缺失可能通过抑制BMPs信号通路,影响成骨细胞分化和骨形成,从而导致了肌间骨数量的减少和脊椎骨异常融合。     

利用CRISPR/Cas9敲除斑马鱼细胞周期蛋白M2(CNNM2)基因

细胞周期蛋白M2(CNNM2)是参与体内镁离子平衡的重要候选基因,本实验采用的CRISPR/Cas9 系统是最近几年发展起来的一类新型的基因打靶技术。在斑马鱼CNNM2基因的一号外显子处选取打靶位点,构建sgRNA表达载体。随后将体外转录的sgRNA和Cas9 mRNA混合物分别以约30pg和300pg的剂量显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中实现对目的靶基因CNNM2的敲除。24h-48h后PCR产物回收,限制性酶切法初步检测基因打靶情况,最后进行测序分析确定突变类型。为进一步验证突变的稳定遗传性,选择了具有敲除效率F0与野生型斑马鱼进行外交,对获得的F1进行逐一剪尾,提取DNA进行PCR和测序分析。结果显示F0和F1均获得了不同程度插入,缺失和移码突变类型,且F0突变效率为88%。本研究获得了能稳定遗传的CNNM2基因敲除斑马鱼个体,并为将来进一步研究CNNM2基因和机体镁离子稳态之间的关系打下了基础。     

ucp2基因敲除斑马鱼的模型建立 及其铝暴露神经毒性相关研究

利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼ucp2基因,研究ucp2基因在铝致斑马鱼痴呆中的作用.针对斑马鱼ucp2基因设计并制备gRNA,通过显微注射技术将gRNA与Cas9-mRNA混合注入斑马鱼单细胞胚胎中,利用酶切和基因测序筛选出发生突变的F0代斑马鱼,与野生型斑马鱼杂交得到F1代斑马鱼杂合子,分析其突变类型,将突变类型一致的斑马鱼杂合子杂交,获得F2代.在酸性AlCl3中暴露F2代斑马鱼胚胎,暴露组的斑马鱼个体行为出现异常,移动距离、移动速度和移动频率皆显著下降(P＜0.01),体内活性氧(ROS)水平显著升高(P＜0.01);其中KO+AlC13组导致的异常更为明显,psen1、psen2、tnf-α和il-1 β mRNA转录水平显著上调(P＜0.01).ucp2在铝致斑马鱼痴呆中起到重要作用,可能是其关键的治疗预防靶点.     

利用CRISPR/Cas9构建斑马鱼tbx20基因突变体及其功能分析

转录因子TBX20在脊椎动物心脏的腔室发育和维护中起至关重要的作用。利用CRISPR/Cas9系统成功制备了斑马鱼tbx20突变鱼系,T7E1检测结果显示F_0敲除效率平均为42. 1%,测序分析F_1中突变种质遗传效率为36. 7%。F_2突变体中观察到心脏突变表型:48 hpf,心包腔肿大,静脉窦瘀血,环化异常,心脏结构变形; 3 dpf,心脏畸形拉伸成线状结构。原位杂交和qRT-PCR结果显示,突变体中vmhc表达上调,amhc和myl7表达下调。成功制备了斑马鱼tbx20突变体,结果表明tbx20纯合突变体心脏畸形,环化受到影响,为深入探究tbx20在早期心脏腔室分化过程中的作用奠定了基础。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在真菌中的应用

CRISPR/Cas系统是一种新型基因编辑技术,因为它制作成本低廉、操作过程简单、快捷且易于掌握的特点,迅速地在动物、植物和微生物等多种生物中成功实现了基因组定点修饰。简述了Ⅱ型CRISPR/Cas系统的结构、作用机理,对CRISPR/Cas9在真菌基因组编辑中的应用进展进行了概述,并对该技术存在的问题及应用前景进行了展望。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在真菌中的应用

CRISPR/Cas系统是一种新型基因编辑技术,因为它制作成本低廉、操作过程简单、快捷且易于掌握的特点,迅速地在动物、植物和微生物等多种生物中成功实现了基因组定点修饰。简述了Ⅱ型CRISPR/Cas系统的结构、作用机理,对CRISPR/Cas9在真菌基因组编辑中的应用进展进行了概述,并对该技术存在的问题及应用前景进行了展望。     

CRISPR/Cas9介导基因组编辑技术在植物基因中的研究进展

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术是在DNA双链的特定位置形成双链断裂,然后通过同源重组或非同源末端连接方式进行修复,造成基因组碱基局部缺失或插入而引起基因突变,它具有操作简单、突变效率高等优势。笔者归纳了CRISPR/Cas9系统的基本结构、分类及其在植物基因中的研究进展和未来的发展方向。     

运用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼前肾表达基因的敲除研究

CRISPR/Cas9是目前最热门的基因编辑技术,是进行基因敲除的有效手段.斑马鱼是一种常用的研究脊椎动物器官发育的模式生物,本实验选取10个斑马鱼前肾表达基因atp1a1a1,atp1a1a.2,atp1a1a.3,atp1a1a.4,atp1a1a.5,pkd2,aqp3a,bmper,isl2a和tbx2a,运用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除以研究肾脏发育.经过三代筛选,每个基因获得了至少一种移码突变.突变体的初步表型分析显示,10个基因中只有atp1a1a.2和pkd2基因突变可以导致斑马鱼胚胎发育缺陷,隐性致死,这与已经报道的突变体或基因敲降结果类似.上述结果表明CRISPR/Cas9基因编辑技术可在斑马鱼中高效地进行基因敲除,获得的突变体为以后深入研究斑马鱼前肾发育提供了重要材料.     

CRISPR/Cas9基因编辑技术综述

CRISPR/Cas9首次在细菌中被发现,是适应性免疫系统的一部分,现已广泛用于工程改造基因组中激活或抑制基因表达.同时,CRISPR/Cas9有望通过提供一种有效的技术来剖析癌症发生的机制,确定药物开发的靶标,并可能为基于细胞的疗法提供支撑以加速癌症的研究.对CRISPR/Cas9技术的发展历史和应用范围做了概述及展...     

基因编辑系统CRISPR/Cas9在作物基因工程育种中的应用

作为传统基因工程育种技术,转基因技术在作物分子育种工作中由于其自身的技术原因存在一定的局限性。而基因编辑技术的出现为作物的遗传改良和基因功能的研究提供了新的思路与途径,目前,应用最为广泛的基因编辑技术是CRISPR/Cas9系统,其主要由sg RNA和Cas9蛋白组成,Cas9蛋白在sg RNA的引导下对目标基因进行编辑。简要介绍了基因编辑技术的发展历程以及CRISPR/Cas9系统的结构组成、工作机制、技术优势及其在作物基因工程育种中的应用进展,这可为开展这一领域工作的研究提供有益参考。     

唇鱼骨肌间小骨的骨化过程

利用整体骨骼染色的方法,对唇(Hemibarbuslabeo)早期发育阶段肌间小骨的形态发生进行观察,结果表明:在受精后35 d(dpf)之前,除了肌间小骨,唇所有其它骨骼均已骨化完成。肌间小骨在35 dpf(相应的体长为23.67 cm)开始在尾部区域骨化,髓弓小骨首先出现在尾部的第37～41肌节之间,脉弓小骨首先出现在尾部的39～40肌节之间,然后依次往前;到62 dpf(相应的体长为30.03cm)肌间小骨骨化全部完成。骨化过程中,唇肌间小骨是从简单的I型,到卜型,再到Y型,再分化为各种复杂形态。唇肌间小骨出现的时机和形态形成规律与其它鲤科鱼类相似,提示鲤科各亚科鱼类肌间小骨的骨化过程可能受同样的遗传机制控制。研究亮点:目前关于鲤科鱼类肌间小骨骨化模式的研究仅限于鲢亚科的鲢和模式动物斑马鱼,通过比较其它亚科鱼类肌间小骨的骨化模式,有助于探讨鲤科鱼类肌间小骨骨化模式的保守性。本文发现亚科唇的肌间小骨骨化模式与鲢非常相似,提示鲤科肌间小骨的骨化过程可能受同样的遗传机制控制。     

紫光对斑马鱼皮肤黑色素细胞数量及相关基因表达的影响

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建感紫光短波视蛋白(short-wave-sensitive 1,sws1)基因缺失的斑马鱼突变品系sws1^-/-。检测紫光照射后野生型AB品系和sws1^-/-突变品系在背腹皮肤中黑色素细胞的数量、黑色素合成相关基因pomc和asip、视黄酸合成相关基因raldh2和raldh3的表达量。结果显示:在紫光照射60和100 d后,sws1^-/-斑马鱼背部皮肤黑色素细胞数量显著少于野生型斑马鱼(P<0.05);实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测发现,pomc基因在紫光照射100 d的sws1^-/-斑马鱼背部皮肤中的表达量显著低于野生型,raldh2在紫光照射100 d的sws1^-/-斑马鱼背部皮肤中的表达量显著低于野生型。研究表明,紫光可能通过SWS1影响背部皮肤raldh2的表达从而影响视黄酸的合成,再通过影响pomc的表达调控黑色素细胞的形成。研究结果为分析紫光基因调控鱼类皮肤黑色素细胞形成的分子机制提供了基础。     

日本鳗鲡肌间小骨的骨化过程

利用形态解剖和整体骨骼染色的方法,对日本鳗鲡(Anguilla japonica)成鱼肌间小骨的形态、分布,以及早期发育阶段肌间小骨的形态发生和骨化过程进行观察。结果表明:在玻璃鳗阶段,日本鳗鲡的主轴骨骼和附肢骨骼均已骨化完全,但肌间小骨并未出现。在鳗线阶段,体长5.2 cm以上的日本鳗鲡椎体小骨、髓弓小骨和脉弓小骨均已出现。其肌间小骨的骨化顺序不同于其他鲤科鱼类从尾部向前依次骨化,而是从头部向尾部依次骨化。这提示鱼类肌间小骨的骨化可能与其不同的游泳方式有关,为今后研究肌间小骨发生的分子机制提供了形态学基础。     

黄河鲤肌间骨发育的形态学观察

采用整体骨骼染色、形态学解剖的方法,对黄河鲤(Cyprinus carpio haematopterus)仔稚鱼肌间骨的形态发生及成鱼肌间骨数目、形态、分布进行研究。结果显示,黄河鲤14 dpf(day post fertilization,体长11.29mm)肌间骨首先在尾部出现,此时其他骨骼包括主轴骨及附肢骨均已骨化完全。伴随鱼体生长,肌间骨由尾向头依次骨化,26 dpf(体长15.60 mm)肌间骨骨化全部完成。黄河鲤肌间骨数在93~104之间,平均为98根;鱼体一侧髓弓小骨平均为34枚,脉弓小骨平均为15枚。黄河鲤肌间骨存在7种形态:"I"形、"卜"形、"Y"形、一端多叉形、两端两分叉形、两端多叉形和树枝形,越靠近鱼体前端肌间骨形态越复杂。研究结果为今后揭示黄河鲤肌间骨骨化的分子机制,培育少肌间骨甚至无肌间骨的黄河鲤提供了形态学基础。     

红麻miR394基因的克隆及CRISPR/Cas9载体构建

为探明miRNA在红麻中的功能,以红麻基因组DNA为模板,根据红麻microRNA(miRNA)高通量测序数据结果,克隆红麻miR394前体基因序列,并构建CRISPR/Cas9载体。结果表明红麻miR394前体基因序列大小为175bp,用Mfold在线软件分析,其前体序列能形成稳定的二级结构。根据红麻miR394前体基因序列,设计合适的CRISPR/Cas9靶标序列,利用改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统,以AtU3b和AtU6-29质粒为模板,使用Overlapping PCR法构建AtU3b-sgRNA和AtU6-29-sgRNA表达盒,使用Golden Gate Cloning方法成功把靶标AtU3b-sgRNA和AtU6-29-sgRNA表达盒构建到pYLCRISPR/Cas9载体中,并将构建好的载体命名为pCas9-miR394。分离红麻叶片原生质体,将pCas9-miR394载体转入红麻叶片原生质体中进行瞬时表达,测序结果表明:2个靶点Target site 1(T1)和Target site 2(T2)处都发生碱基突变,表明pCas9-miR394载体在红麻原生质体中具有靶向切割的活性。     

CRISPR/Cas9系统研究进展及应用

CRISPR/Cas9是目前应用广泛的基因组编辑工具,该系统利用一段RNA引导Cas9核酸酶可对多种细胞及动植物基因组实现特定位点的切割和修饰,具有操作简单、作用高效等优点。Ago是另一类核酸内切酶,具有良好的应用潜力。从CRISPR/Cas9的发展现状、结构基础、作用机制、改进后的基因编辑机制及基因编辑技术的应用等方面进行了综述,讨论其存在的问题,并提出相应对策。     

eIF5A基因敲除MARC-145多克隆细胞系的建立及其对PRRSV增殖的影响

旨在利用CRISPR/Cas9系统构建敲除真核翻译起始因子5A(Eukaryotic translation initiation factor 5A,eIF5A)的MARC-145多克隆细胞系,并验证该细胞系对PRRSV感染的影响。针对eIF5A基因构建并筛选成功获得重组慢病毒,用重组慢病毒感染MARC-145细胞,嘌呤霉素及有限稀释法进行筛选,获得敲除eIF5A的MARC-145多克隆细胞系。对构建细胞系进行活力检测,T7E1核酸内切酶、Real-time PCR以及Western blot验证eIF5A体外敲除效率,病毒增殖试验验证该细胞系对PRRSV复制的影响。结果表明：1)细胞活性检测结果显示敲除eIF5A基因对细胞活性无显著影响;2)通过T7E1核酸内切酶、Real-time PCR以及Western blot表明eIF5A表达显著降低,并将此细胞系命名为MARC-145-△eIF5A细胞系;3)使用PRRSV HN07-1感染MARC-145-△eIF5A,体外试验证明敲除eIF5A对PRRSV的增殖有抑制作用。综上,本研究成功构建eIF5A基因敲除的MARC-145多克...