致倦库蚊几丁质酶家族基因的鉴定与分析

利用生物信息学方法鉴定致倦库蚊23条几丁质酶基因,并对它们进行命名、分组,以及基因结构、蛋白结构域、蛋白理化特性和系统发育分析,随后使用q PCR方法检测Cq Cht10在致倦库蚊生长各时期的相对表达量。结果表明,致倦库蚊几丁质酶基因长度为1 360~19 218 bp,蛋白长度为353~2 681 aa,分子量为39.557~279.503 k D,等电点为4.76~8.69。它们属于GH18家族,每条几丁质酶包含信号肽区域、催化结构域、几丁质结合域和连接区域,但包含的数量不同。此外,每条几丁质酶的催化结构域均包含保守序列FDGXDLDWEYP。本研究将致倦库蚊几丁质酶划分为12组,组Ⅰ~组Ⅶ沿用早期研究的分组标准,此外将组Ⅷ更名为组Ⅸ,再新增4个分组。Cq Cht10的q PCR实验结果显示,该基因在Ⅱ龄~Ⅳ龄幼虫期呈高表达,在蛹期和成虫期呈低表达,而在卵期和Ⅰ龄幼虫期呈微量表达,此外在雌蚊和雄蚊中无显著差异表达,提示该基因与致倦库蚊的蜕皮相关,且与性别关联不大。本研究的分析结果能够为致倦库蚊几丁质酶基因的功能研究提供有价值的信息。     

应用气相色谱法鉴别淡色库蚊与致倦库蚊

从70年代以来,应用气相色谱法分析医学昆虫表皮烃类碳的波形,能有效地鉴别复组的亲缘种类(sibling species),包括蚊、蚋、釆釆蝇等重要传病媒介,已成为昆虫的化学分类法(Carlson, 1984; Phillips & Milligan, 1986)。本文试用气相色谱法鉴别尖音库蚊(Culex pipiens Complex)的淡色库蚊(Culex pipiens pallens)北京株、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)的武汉株和广州株。     

致倦库蚊发育与温度的关系

以实验种种的研究资料为基础，构造了致倦库蚊未成熟期的发育与温度关系的模型，找到了其发育的最适温度和最高、最低临界温度。     

一株新的人肾癌原代细胞系的建立及其生物学特性鉴定

目的:取肾癌病人标本建立一株新的人肾癌细胞系,初步对该细胞系进行鉴定,为进一步的肾癌基础研究提供实验模型.方法:2008-2009年间共采集20例肾癌新鲜手术标本,于手术后1 h内将每例标本切取四块0.5cm× 0.5 cm× 0.5 cm组织块,分别包埋于2只裸鼠的右后肢皮下及背部皮下,连续传代3次,取移植瘤体外培养,记录细胞株的生长曲线,测定细胞集落形成率,对细胞进行DNA含量测定,进行染色体分析及病理学检查.结果:其中1只裸鼠皮下移植瘤生长,继续传代,肿瘤生长速度明显加快.取移植瘤标本体外培养得到肾癌细胞系XJG-9201.形态结构,分化程度与原发瘤一致,染色体众数为65.细胞群体倍增时间为38.2h,细胞周期分析G1期62.7%,G2期11.2%,S1期25.3%,集落形成率为70%.结论:肾癌细胞系XJG-9201与原发癌保持相同的生物学特性,体外连续传代1年以上传115代.细胞形态不变,生长周期恒定,已成为一个稳定的细胞系.     

致倦库蚊吸血量的观察

蚊的吸血量是蚊生态习性的一个重要方面。致倦库蚊(Culex pipiens quinquefasciatus)分布于全世界热带及亚热带,在我国则分布北纬33°以南广大地区,是我国班氏丝虫病的主要传播媒介之一,且与乙型脑炎的传播有关。为此对其吸血量进行了初步实验观察。1 材料和方法试验所用的致倦库蚊蚊株采自武汉市区,经实验室驯化饲养近2年。饲养条件为温度22     

致倦库蚊产卵习性的研究

在建立致倦库蚊(Culex pipiens quinquefasciatus)实验种群后,我们对其产卵习性进行了初步研究,现报道如下。养蚊室温度22±2℃,相对湿度71±10%,光照时间14小时/天(8AM—10PM)。取6小时内蛹化的蛹78、63和96只进行试验。成蚊饲以10%蜂蜜和10%葡萄糖水,以小白鼠每晚喂血,每天定时观察成蚊死亡,产卵等,直至最后一只成蚊死亡为止。按前述方法〔1〕计算每雌每3天的产雌数即为其生殖力。三组蛹的羽化率分别为96.83%、93.75%和94.81%,平均为95.13±1.56%,与以前的96.52%结果相似〔1〕,但比88.91%(姚等,1989)〔2〕略高。在成蚊中期和后期各有一…     

致倦库蚊实验种群动态研究

本文应用考虑年龄——龄期及雌雄性的生命表方法和传统的生命表方法计算,分析了致倦库蚊实验种群在温度为25℃条件下的种群增长参数,稳定年龄——龄期分布情况。在生命表分析的基础上,用转移矩阵模拟了致倦库蚁数量变动的规律。     

致倦库蚊饲养驯化的初步体会

致倦库蚊是丝虫病、流行性乙型脑炎、东方马脑炎等多种疾病的传播媒介,对人类健康和工农业生产的发展危害甚大。为测试蚊虫对各种杀虫剂的敏感性等生物和化学测定,需人工饲养和驯化大量的致倦库蚊,得到实验室品系。我们自1999年以来开展了实验室饲养驯化致倦库蚊的工作,已连续数年饲养致倦库蚊达60多代。各个世代蚊虫生长发育良好,种群情况稳定。现将初步体会简报如下。     

一个致倦库蚊杀虫剂敏感品系的筛选

化学防治是控制蚊虫传播疾病的主要方法, 抗性监测表明我国蚊虫已对有机磷、 有机氯、 氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类杀虫剂产生了不同程度的抗性。蚊虫抗药性的分子机制主要包括靶标抗性和三大解毒酶家族带来的代谢抗性。筛选对杀虫剂敏感的品系是抗性监测和抗性机理研究必不可少的材料。本研究通过从一个致倦库蚊Culex pipiens quinquefasciatus野生种群筛选无乙酰胆碱酯酶G119S突变且具有低活性羧酸酯酶、 P450单加氧酶和谷胱甘肽-S-转移酶的单雌系, 建立了一个对杀虫剂敏感的致倦库蚊品系。该品系的羧酸酯酶活性是敏感品系S-lab的2.5倍, P450单加氧酶和谷胱甘肽-S-转移酶的活性与S-lab相当。生物测定表明, 与S-lab相比, 该品系对有机磷杀虫剂有低于2倍的抗性, 对氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类杀虫剂没有抗性, 可以作为相对敏感品系用于抗性监测。     

一摸香叶精油对致倦库蚊的生物活性及其成分分析

参照“农药登记卫生用杀虫剂的室内药效评价/驱避剂GB/T 17322.10—1998”,研究了一摸香鲜叶的水蒸汽蒸馏精油对致倦库蚊的驱避作用;参照“电热片蚊香的室内药效测定方法GB 13917.5—1992”,测试了该精油对致倦库蚊成蚊的熏杀效果;采用浸液法测试了其对致倦库蚊幼虫及蛹的毒杀活性;并用GC-MS测试分析了其化学成分.结果表明：一摸香叶精油在1.5 mg·cm^-2剂量下对实验室饲养的未吸血致倦库蚊雌成蚊的驱避100%保护时间为(6.54±0.17) h,对成蚊的熏杀24 h LC₅₀值为6.895 μg·cm^-3,对成蚊的熏蒸KT₅₀值为6.46 min (熏蒸剂量为11.850 μg·cm^-3),对Ⅳ龄期幼虫的24 h毒杀LC₅₀值为119.020 μg·ml^-1.精油中共鉴定出17种化合物,占该精油挥发性成分总量的97.4%.说明一摸香叶精油对致倦库蚊具有显著的驱避作用和极强的毒杀活性.     

致倦库蚊主要组织结构的石蜡切片观察

【目的】蚊虫是传播人类多种疾病的重要媒介害虫, 对其组织形态学的认识是开展众多领域研究的基础。本文通过研究致倦库蚊Culex pipiens quinquefasciatus成虫组织结构及形态, 为媒介蚊虫的抗药性研究及有效防治提供基础材料。【方法】采用改进的石蜡切片法和HE染色, 结合活体内脏器官解剖及光学显微镜观察, 从形态学和组织学水平对致倦库蚊组织结构做详尽展示。【结果】获得结构完整、 染色清晰、 定位准确的消化排泄系统、 生殖系统、 神经系统、 呼吸系统等HE染色石蜡切片。【结论】探讨了改进制片和染色过程中一些步骤及注意事项。研究结果为利用原位杂交、 免疫组化等方法研究蚊虫体内抗药性基因的准确定位及基因功能分析提供了可靠的基础。     

致倦库蚊和中华按蚊产卵习性实验观察

在饲养致倦库蚊(Culex pipiens quinquefasciatus)和中华按蚊(Anopheles sinensis)的过程中,发现雌蚊吸一次血后致倦库蚊产卵时间很长,中华按蚊产卵时间较短,为了搞清楚这两种不同属的蚊虫产卵习性的差异,我们于1992年进行了这两种蚊的产卵习性实验观察。1 材料与方法     

不同种群致倦库蚊对有机磷杀虫剂敏感性测定

分别用生物测定法测定致倦库蚊四龄幼虫对倍硫磷的敏感度、微量孔板酶联免疫检测仪检测成虫的非特异性酯酶活性.结果表明:不同种群致倦库蚊对倍硫磷的半数致死量(LC50)(ppm)(95%可信区间)分别为:北京敏感株(S-BJ)0.0005(0.0005-0.0006),番禺沙湾(PrSW)0.0019(0.0018-0.0021),广州石牌(GZSP)0.0016(0.0015-0.0017),抗溴氰菊酯株(Anti-thrin)0.0011(0.001-0.0012),抗马拉硫磷株(Anti-OP)0.0177(0.017-0.0183).根据S-BJ的LC50值为1,分别计算其他种群的抗性倍数,其抗性倍数分别为:S-BJ1.0,PYSW 3.8,GZSP 3.2,Anti-thrin2.2,Anti-OP 35.4.微板法测库蚊酯酶活性(A值):S-BJ 0.3905(0.281-0.501),PYSW 0.664(0.619-0.709),GZSP 0.575(0.478-0.672),Anti-thrin0.743(0.683-0.804),Anti-OP2.32(2.283-2.357).不同品系致倦库蚊对有机磷杀虫剂抗性:Anti-OP＞PYSW＞GZSP＞Anti-thrin＞S-BJ.     

致倦库蚊的生殖行为和寿命的实验室观察

1981年5—9月,笔者对致倦库蚊Culex pipiens quinquefasciatus Say的生殖行为及寿命进行了实验室观察。实验成虫采用从贵阳市区化粪池中捞回的蚊蛹羽化经鉴定确证者。成虫皆喂以10％蜂蜜水,并以小白鼠供血。实验室温、湿度及日照时间未加人工控制,每天三次测温、湿度,取其均值。吸血蚊置阴暗处(最大照度18Lux),其余蚊虫置室内自然光下(最大照度1,100—1,980Lux)。观察结果报告于下:     

致倦库蚊Cecropin基因家族的比较和系统发育分析

利用生物信息学方法比较分析了致倦库蚊Cecropin家族4成员的基因结构、氨基酸序列、蛋白理化特性,预测蛋白空间结构,并基于7种昆虫绘制分子进化树,随后使用RT-PCR方法获取致倦库蚊Cecropin家族4成员的c DNA。结果表明:致倦库蚊Cecropin家族基因有两条正向编码,两条反向编码,长度为330~544 bp,由2个外显子和1个内含子构成;氨基酸序列长度为59~61 aa,具有两条基序和多个保守位点;编码的蛋白理论分子量为6 284.6~6 619.0 k D,p I值为10.36~11.24,亲水性平均系数为0.393~0.551;蛋白预测的二级结构和三级结构结果基本一致,它们具有1个信号肽结构域和1个催化结构域,结构域主要由α-螺旋构成;7种昆虫的Cecropin蛋白进化关系与物种进化关系基本一致,并以"目"或"亚目"为单位分别聚类,CPIJ005108与致倦库蚊Cecropin祖先基因最相似。本研究的分析结果可为蚊科Cecropin结构和功能的研究提供有价值的信息。     

球形芽孢杆菌对致倦库蚊的后致死作用

研究了球形芽孢杆菌Bacillus sphaericus C3-41菌株对致倦库蚊Culex quinquefasciatus幼虫的毒力及其后致死作用。生物测定表明,该菌株对目标蚊幼虫具有很高的毒力,其丙酮粉剂对3～4龄幼虫48 h的半致死浓度(LC₅₀)为(6.92±0.22) μg/L。用不同亚致死浓度处理2～3龄致倦库蚊幼虫,存活幼虫在后期发育中存在明显的延续死亡和损伤现象,经LC₃₀、LC₅₀、LC₇₀、LC₉₀和LC₉₈剂量的C3.41粉剂处理的致倦库蚊羽化前的总死亡率分别为84%、91%、95%、97%和100%,同时存活的幼虫、蛹和成蚊的发育和行为也受到一定的影响。这种后致死作用随处理浓度的升高而增强,可能同球形芽孢杆菌毒素蛋白对处理期间蚊幼虫中肠上皮细胞造成的损伤相关。     

不同地区致倦库蚊种群相关酯酶 基因的特征分析

分别从广州、沙市、武汉近郊采集到致倦库蚊Culex pipiens quinquefasciatus,对单只蚊虫进行淀粉凝胶电泳和Southern杂交方法的分析结果表明：3个实验种群中均分布有与抗性有关的高活性酯酶β1¹,酯酶α2/β2分布于广州实验种群中;广泛分布于地中海地区尖音库蚊Culex pipiens种群中的酯酶α4/β4、α5/β5在以上3个种群中均不存在。但是,在3个实验种群中均发现存在有一对新的高活性酯酶α8/β8,其电泳迁移率和限制性酶切片段均与目前已报道的几种高活性酯酶不同。含这两对新酯酶的蚊虫将应进一步从种群中纯化,纯合蚊虫新品系做分子特征的研究。     

有机磷抗性致倦库蚊种群中酯酶基因扩增的定量分析

致倦库蚊Culex qinquefasciatus是丝虫病的主要传染媒介。通过生物测定、单个蚊虫酯酶α2和β2基因拷贝数分析和酯酶β基因序列比较, 分析了抗性水平、抗性相关基因在种群中的分布及其基因拷贝数等的抗性分子特征。应用快速PCR仪（realtime quantitatIve PCRs）直接检测库蚊中酯酶基因和mRNA拷贝数。结果显示：上海致倦库蚊对对硫磷的抗性LC₅₀为8.12, 酯酶活性升高是上海致倦库蚊种群对有机磷杀虫药剂产生抗性的主要机理。编码致倦库蚊酯酶β的氨基酸序列同编码尖音库蚊酯酶B1的氨基酸序列相比同源性为98%;同致倦库蚊酯酶B2氨基酸序列相比同源性为100%,同环蹶库蚊酯酶B3氨基酸序列相比同源性为90%, 上海致倦库蚊中酯酶α和β基因均扩增。有机磷抗性的上海和PellRR蚊虫种群中单个蚊虫酯酶α2 和β2定量基因拷贝数均不同,其同一蚊虫个体的酯酶α2 比酯酶β2基因的拷贝数高,但没有明显的规律性,酯酶结构基因的扩增是上海致倦库蚊种群对有机磷杀虫药剂抗性的主要机理,估计在野外种群的杂合个体中存在多种调控机制。     

一株高水平表达重组蛋白昆虫细胞系的建立

报道了一株来自粉纹夜蛾Trichoplusiani脂肪体的传代细胞系 ,在辅以 5%胎牛血清的商品无血清培养基Excell 4 0 0中 ,细胞群体倍增时间为 2 2 9h ,最高密度可达 2 2× 10 6 mL ,该细胞对苜蓿丫纹夜蛾多粒包埋型多角体病毒 (AcMNPV)极为敏感 ,增殖AcMNPV多角体平均每个细胞达86个 ,表达由AcMNPV构建的重组蛋白的水平较高 ,β 半乳糖苷酶的表达水平为 ( 2 2 5 5± 13 4 )IU mL ;碱性磷酸酶的表达水平为 ( 4 7± 0 61)IU mL ,是一株高水平表达重组蛋白的传代细胞系 ,命名为HNU Tn FB1。     

幼虫期食物量对致倦库蚊实验种群动态的影响

在室温26±1℃和相对湿度80%的条件下,以食物充足和食物缺少两种处理饲养致倦库蚊Culex quinquefasciatus Say幼虫.实验表明,幼虫期食物量不仅对幼虫有影响,而且对成蚊期一系列种群参数均有明显影响.净增殖率R₀、内禀增长能力r_m和有限速率γ降低,种群增长受抑制不仅是由于幼虫期食物量减少使幼虫发育速率减慢、存活率下降所致,且与成蚊的年龄特征存活率及年龄特征产雌率有关.各年龄组雌蚊所产的卵的孵出率随年龄的增长而下降,故以卵孵出数计算产雌率m_x所得的种群参数值较为客观,而以卵孵出率与年龄关系的回归方程校正以卵数计算的m.,同样达到上述目的.本文还提供广州致倦库蚊实验种群生命表特征的资料.