新的抗细胞凋亡因子—Clusterin研究新进展

Clusterin是近年来发现的新的抗细胞凋亡因子，尤其在肿瘤细胞中存在的高表达，并发挥抗肿瘤细胞凋亡的作用，本文将近年来有关Clusterin抗凋亡作用研究的新进展进行综述，希望能为今后对这一新的抗凋亡因子的研究提供帮助。     

凋亡蛋白和Nmi的相互作用及作用位点的筛选鉴定

为研究来源于鸡贫血病毒的小分子蛋白质———凋亡蛋白 (apoptin)诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制 ,利用酵母双杂交系统从人白细胞cDNA文库筛选凋亡蛋白相互作用蛋白质 ,核苷酸序列分析及同源性检索表明 ,其中一个约为 1.2kb的克隆与Nmi(N Mycinteractionprotein)高度同源。细胞免疫共沉淀实验结果显示 ,在哺乳动物细胞水平仍能够检测到凋亡蛋白与全长Nmi的特异相互作用。利用构建好的分别缺失C端 11个氨基酸、中间 33～46位氨基酸和二者均缺失的 3个凋亡蛋白突变体进行相互作用位点研究 ,结果表明凋亡蛋白的 33～ 46位氨基酸(核外运信号 )对于凋亡蛋白与Nmi的相互作用是必需的 ,而C端核定位信号 /DNA结合序列对于凋亡蛋白与Nmi的相互作用不是充分必要的     

从人白细胞cDNA文库筛选凋亡素相互作用蛋白

来源于鸡贫血病毒的小分子蛋白-凋亡素(apoptin)能够选择性诱导肿瘤细胞凋亡,为研究其选择性诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制,利用酵母双杂交系统筛选从人白细胞cDNA文库筛选apoptin相互作用蛋白,核酸序列分析及同源性检索表明,其中一个与ABP280（actin-binding protein 280）有高度同源性.细胞免疫共沉淀实验结果显示：在哺乳动物细胞水平仍能够检测到apoptin与ABP280片段的特异的相互作用.分别构建缺失C端11个氨基酸、中间33～46位氨基酸和二者均缺失的apoptin的3个突变体, 突变体与ABP280相互作用研究表明：apoptin的33～46位氨基酸（核外运信号）对于apoptin 与ABP280的相互作用是必需的,而C端核定位信号/DNA结合序列对于apoptin 与ABP280的相互作用不是充分必要的.     

PML coiled-coil结构域与RAN结合蛋白9相互作用的验证

目的验证前髓细胞性白血病的卷曲螺旋结构域（PML—C）和RAN结合蛋白9（RANBP9）之间的相互作用。方法构建分别表达诱饵蛋白PML—C和靶蛋白RANBP9的载体pGBKT7-PML-C和pACT2-RANBP9,然后转人酵母AH109,培养3～5d后对其是否有胞内相互作用进行检测。将目的片断PML-C和RANBP9再次构建于真核生物表达载体pCMV—HA和pCMV—myc里,然后共转染人胚肾293细胞里（HEK293）,最后对其是否有体外相互作用通过免疫共沉淀和免疫印迹进行分析。结果在共转化了质粒pGBKT7-PML—C和pACT2-RANBP9的AH109酵母平板里观察到蓝色菌落生长。用抗HA多克隆抗体对共转染过重组质粒的HEK293细胞的蛋白提取物进行免疫共沉淀,再用抗myc单克隆抗体作为一抗进行免疫印迹,最终检测出融合蛋白myc—RANBP9条带。结论酵母双杂交实验验证了PML—C和RANBP9之间存在胞内相互作用,同时免疫共沉淀实验也从体外验证了它们之间的相互作用。     

Nogo-B的生物学功能

Nogo-B是网状蛋白家族4的重要成员,其广泛表达于中枢神经系统及外周组织,其亚细胞定位于细胞内质网及细胞膜。研究显示,Nogo-B主要参与血管损伤、组织修复、再生及炎症过程的调控,并可能在肿瘤细胞凋亡及中枢神经系统疾病中也发挥重要作用。对Nogo-B的结构及其功能的进一步探索,有助于更加深入地了解其在各种疾病中发挥作用的机制。     

血管生成素相互作用蛋白的发现及其在哺乳动物细胞中的验证

通过RT-PCR从人外周血白细胞中钓取血管生成素(angiogenin,Ang)cDNA,构建诱饵蛋白载体pAS-2-1-Ang,对其自身转录激活活性进行鉴定后,通过酵母双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库,获得两个双阳性克隆.序列分析和同源检索表明所获候选蛋白分别为人上皮细胞素和λ晶体蛋白.构建Ang及候选蛋白标签融合表达载体并共转染COS-7细胞,利用免疫共沉淀和蛋白质印迹方法在哺乳动物细胞中验证了Ang与候选蛋白间的相互作用.为阐明Ａng促血管新生的分子机制创造了条件.     

利用双杂交系统对SeNPV泛素与抗细胞凋亡蛋白相互作用的研究

本文报道利用酵母双杂交系统研究甜菜夜蛾核多角体病毒(SeNPV)的泛素(Ubiqutin)与抗细胞凋亡蛋白(IAP2,IAP3)相互作用的结果。使用Clontech公司的MACHMAKER GAL4 Two-hybrid system 3,以病毒ubiquitin基因与酵母GAL4的DNA结合域重组表达“诱饵”蛋白,以病毒iap2或iap3基因与DNA活化域重组表达“猎物”蛋白,在低严谨犁筛选培养基上均得到阳性克隆。这一结果表明,甜菜夜蛾核多角体病毒泛素与IAP2或IAP3在体外能进行相互作用,这种作用利用了酵母内源性E1和E2。SeNPV的抗细胞凋亡蛋白(IAPs)可能是泛素一蛋白酶水解途径(UPP)中的泛素连接酶(E3),或者是泛素依赖性蛋白水解酶的靶底物。     

用酵母双杂交系统分离一个新的人类细胞凋亡诱发基因

asy基因是最近发现的一个新的凋亡诱发基因, 但其诱发凋亡的机制仍不清楚. 采用酵母双杂交系统, 从人肺细胞系(WI-38)cDNA文库中克隆了一个asy相互作用蛋白基因asyip (asy interacting protein). asyip在人的各种组织内均能组成型转录合成1.8和2.7 kb两种mRNA转录本, 但转录水平有明显差异, 在脑组织中转录水平最高. 而且, 脑组织中2.7 kbmRNA转录水平大大高于1.8 kb的转录本. 序列分析表明两种转录本起始于一个共同的5′端,但3′端加poly(A)位点不同. 两者共享一个大的可读框, 编码26 ku的蛋白ASYIP. 推论的氨基酸一级结构表明, ASYIP含有两个大的强疏水区、两个蛋白激酶C磷酸化位点和两个酪蛋白激酶磷酸化位点. C端具有一个内质网捕获信号(Lys-Lys-Lys-Ala-Glu). 免疫沉淀试验进一步验证ASYIP和ASY在哺乳动物细胞中可以相互结合. 与asy基因一样, asyip基因的大量表达能抑制肿瘤细胞Saos-2的生长, 诱发细胞凋亡, 但效率比asy低.     

人FasL基因转染成熟树突状细胞对T淋巴细胞增殖和凋亡的影响

探讨转染人FasL基因的成熟树突状细胞(DC)对异体T淋巴细胞增殖和凋亡的影响,为实现临床器官移植免疫耐受提供初步实验依据.从健康成年人外周静脉血中获得成熟树突状细胞.将人FasL基因成功转染成熟树突状细胞,检测其表面分子的表达和自身凋亡情况,并对其抗原递呈功能进行分析.从异体健康成人外周血中获取T淋巴细胞,将转染成功的树突状细胞与T淋巴细胞混合培养,检测其对T淋巴细胞增殖和凋亡的影响.结果表明:人FasL基因转染没有明显影响成熟树突状细胞表面分子CD40、CD80、CD86和HLA-DR的表达;没有诱导树突状细胞自身发生凋亡;没有影响DC的抗原递呈功能.转染FasL基因后的树突状细胞使异体T淋巴细胞刺激指数明显下降,凋亡增加.因此认为,人FasL基因转染对成熟树突状细胞的表面分子表达、自身凋亡、抗原递呈等生物学性状无影响;转染FasL基因的树突状细胞使异体T淋巴细胞的增殖能力减弱,并能明显诱导T淋巴细胞凋亡.     

G-CSF受体胞内区与AK017149的相互作用

为研究G-CSF受体胞内区与AK017149基因之间的相互作用,进而揭示G-CSF受体信号转导通路的可能机制,采用高敏感性的酵母双杂交体系,筛选小鼠胎肝文库,在筛选过程中获得了1个功能未知的基因片段-AK017149,并在酵母和哺乳动物细胞体内验证了该基因片段的表达蛋白与G-CSF受体间的相互作用．实验研究提示,G-CSF受体作为胞内信号转导的起始点,可以与众多蛋白因子相结合,对其中未知蛋白的研究,可以为揭示G-CSF受体信号转导通路起重要的提示作用．     

Interaction of mouse Pem protein and cell division cycle 37 homolog

Mouse Pem, a homeobox gene, encodes a protein consisting of 210 amino acid residues. To study the function of mouse Pem protein, we used the yeast two-hybrid system to screen the library of 7-day mouse embryo with full-length mouse Pem cDNA. Fifty-two colonies were obtained after 1.57×10^8 colonies were screened by nutrition limitation and β-galactosidase assay. Seven individual insert fragments were obtained from the library, and three of them were identified, one of which was confirmed to be the cell division cycle 37 （Cdc37） homolog gene by sequencing. The interaction between mouse Pem and Cdc37 homolog was then confirmed by glutathione S-transferase pull-down assay, and the possible interaction model was suggested.     

肿瘤及胚胎组织特异表达蛋白CEP65相互作用蛋白的筛选与鉴定

CEP65蛋白(cancer and embryo expression protein 65)为肿瘤单克隆抗体3H11所识别的抗原分子, RT-PCR及RNA印迹检测表明, CEP65蛋白表达于肿瘤及胚胎组织.为了研究CEP65在肿瘤发生中的作用机制,以CEP65为诱饵蛋白,通过酵母双杂交体系筛选人胚胎组织cDNA表达文库. 从5.2×10⁶个克隆中筛选得到14个阳性克隆,并在酵母体系中通过不同方法得到验证.在此基础上,选取在双杂交中作用明显的51号克隆,与CEP65作GST pull-down实验, 结果证明, CEP65与51号阳性克隆蛋白确能相互作用. 生物信息学分析发现, CEP65与51号阳性克隆蛋白相互作用, 可能通过WW结构域或者蛋白激酶C对细胞的增殖与分化起到调节作用.     

Antisense Oligonucleotide of Clusterin mRNA Induces Apoptotic Cell Death and Prevents Adhesion of Rat ASC-17D Sertoli Cells

Clusterin has been known to play important roles in cell-cell and/or cell-substratum interactions. Recently we reported the transient expression of clusterin in pancreatic endocrine cells during the early developmental stages and suggested a role in aggregating the endocrine cells for islet formation. In the present study, we have investigated the involvement of clusterin in cell-substratum interaction by the inhibition of clusterin synthesis using antisense oligonucleotide. The expression of clusterin was transiently increased as early as 2–8 h after plating the ASC-17D Sertoli cells to the culture flask, which was the period of cell attachment. In addition, up-regulation of clusterin mRNA was so much greater when the Sertoli cells were plated on the petri dish for the bacterial culture instead of in a animal cell culture flask that therefore, the cells failed to attach to it. These findings suggested that interruption of cell to plate substratum interaction might lead to over-expression of clusterin from Sertoli cells to induce cell to cell aggregation or, perhaps, to re-establish attachment with the substratum. Transfection of ASC-17D Sertoli cells with a 20-base antisense oligonucleotide against clusterin mRNA resulted in extracellular release of LDH and DNA fragmentation. Sertoli cell death by antisense oligonucleotide of clusterin was sequence specific and dose dependent. Treatment of antisense oligonucleotide induced a marked reduction of synthesis for clusterin protein, but not for clusterin mRNA expression, suggesting the translational suppression of clusterin by antisense oligonucleotide. Further, microscopic observation showed that more noticeable cell death was induced by treating the antisense prior to plating the cells than by treating after cell attachment to the plate. From these results, we speculate that down-regulation of clusterin expression in the anchorage-dependent Sertoli cells prevents them from attaching to the plate, and therefore induces cell death.     

肝细胞生长因子基因转染对人淋巴瘤细胞凋亡的影响

探讨肝细胞生长因子（HGF）基因转染人淋巴瘤细胞系Raji细胞后,拮抗足叶乙甙（VP－16）诱导细胞凋亡的研究。将三种细胞：未转染Raji细胞、空载体pVITR02－mcs转染细胞和HGF基因转染细胞,分成正常对照组和经vP－16处理的药物组。采用Westernblot法验证HGF蛋白的表达：CCK－8法检测诱导Raji细胞凋亡的药物浓度;通过透射电镜、流式细胞术、吖啶橙（A0）染色、苏木精咿红（HE）染色等方法观察Raji细胞的凋亡情况,并进行相关分析。结果显示：Westernblot法验证了HGF蛋白质的表达;CCK．8法显示100μg／mL足叶乙甙可明显抑制Raii细胞增殖;透射电镜下可发现典型的凋亡细胞;流式检测结果表明：给药组与正常组相比,三组细胞的凋亡率明显升高（P〈0．01）,提示VP－16具有诱导细胞凋亡的作用：但给药组间：HGF基因转染组凋亡率明显低于未转染组（P＜0．05）和空载体pVITR02．mcs转染组（P〈0．05）,提示嬲F基因转染可明显抑制VP-16诱导的Raji细胞的凋亡,AO染色和HE染色结果也同样提示HGF具有拮抗VP－16诱导的细胞凋亡效应。     

角质细胞生长因子-2与核糖体蛋白L22相互作用的发现及在哺乳动物细胞中的验证

通过聚合酶链式反应从人胎肝cDNA文库中钓取KGF-2 cDNA,构建诱饵蛋白载体pAS2-1-KGF-2并对其自身转录激活活性进行鉴定,利用酵母双杂交系统筛选人胎肝cDNA文库,挑选双阳性克隆.DNA序列分析和同源检索显示,所获侯选蛋白为人核糖体蛋白L22(RPL22).将KGF-2和侯选蛋白分别克隆至哺乳动物细胞双杂交的BD、AD质粒中,共同转染COS-7细胞,通过CAT分析验证了KGF-2和侯选蛋白之间的相互作用.为阐明KGF-2作用的分子机制提供有益线索.     

Clusterin抑制人肾近曲小管上皮HK-2细胞的凋亡

Clusterin是一种硫酸糖蛋白.最近研究发现,clusterin具有抗凋亡作用,同时对肾细胞具有保护作用,但抗凋亡的具体机制仍不清楚.为研究clusterin及其不同功能区域在人肾近曲小管上皮HK-2细胞中的抗凋亡作用,构建了含有全长及缺失前导序列的clusterin重组质粒（分别命名为pIRES2-EGFP/cluac和pIRES2-EGFP/clubc）.将重组质粒转染人肾近曲小管上皮HK-2细胞后,检测转染细胞中clusterin的表达及其抗Na₂SeO₃（10μmol/L）诱导的凋亡作用.Western印迹显示,转染pIRES2-EGFP/cluac的HK-2细胞培养上清及细胞裂解液中均可检测到clusterin蛋白表达,但转染pIRES2-EGFP/clubc的HK-2细胞仅在裂解液中检测到clusterin,在培养上清液中未检测到该蛋白表达.流式细胞术检验显示,HK-2 /clubc细胞实验组出现明显凋亡峰,而 HK-2 /cluac细胞组则未见凋亡;两组的凋亡百分率之间也存在显著性差异（P<0.05）.以Cy3标记的Annexin V染色后于荧光显微镜下观察细胞凋亡情况与FCM检测结果基本一致.上述结果证明,clusterin有明显的抑制人肾近曲小管上皮HK-2细胞凋亡的作用;clusterin前导序列是其发挥抗凋亡作用的必需功能区域,提示clusterin抗凋亡作用是通过细胞外途径产生的.     

用酵母双杂交系统研究SMAD3和SMAD4的相互作用

利用酵母双杂交试验,鉴定了细胞内信号传导蛋白SMAD3和SMAD4的相互作用。通过SMAD3和SMAD4各突变体的同源和异源相互作用的双杂交反应,确定SMAD4介导信号传递的功能区在中间连接区,SMAD3的功能区在C末端。