重组人和大鼠醇脱氢酶、醛-酮还原酶的克隆表达及应用

克隆、表达人和大鼠醇脱氢酶 (ADH)、醛-酮还原酶 (AKR) 基因全长cDNA, 研究扁桃酸 (MA) 代谢机制。设计引物, 利用RT-PCR克隆人和大鼠醇脱氢酶、醛-酮还原酶基因全长cDNA。测序正确的cDNA被克隆到表达载体pET-28a (+) 上并在大肠杆菌BL21 (DE3) 中稳定表达。利用亲和色谱纯化相应的酶, 通过检测其在340 nm吸收度值的变化进行酶活性测定。获得的醇脱氢酶与扁桃酸, 醛-酮还原酶与苯乙酮酸 (PGA) 共孵育, 采用HPLC分析其代谢和转化情况。通过测序, 目的蛋白的cDNA序列完全正确, 在宿主菌中获得良好的可溶性表达, 经Ni²⁺亲和柱纯化后目的蛋白达到了电泳纯, 具有较好的催化活性。人ADH2对扁桃酸的代谢具有立体选择性, 优先代谢S-MA, 对S-MA的代谢能力较强。大鼠ADH1对扁桃酸无代谢活性, 人和大鼠AKR对苯乙酮酸均无代谢。成功构建人和大鼠醇脱氢酶、醛-酮还原酶的表达质粒, 获得高活性的蛋白。这些重组酶模型可以用于由醇脱氢酶和醛-酮还原酶介导的药物代谢研究。     

大鼠血栓调节蛋白基因的克隆及在原核细胞中的表达

目的研究大鼠血栓调节蛋白基因的扩增、克隆及在原核细胞中的表达。方法以大鼠基因组DNA为模板,进行PCR扩增,用pMD18-Tsimple vector进行T克隆并测序。经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,将目的基因克隆到pET-28a(+)表达载体质粒中,转化E.coliBL21(DE3)表达重组蛋白,通过SDS-PAGE分析表达产物。结果含有大鼠血栓调节蛋白基因的PCR产物约为1850bp。重组pMD18-Tsimple vector质粒和重组pET-28a(+)质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后,有相应大小的目的片段,测序结果正确。经IPTG诱导,重组pET-28a(+)质粒在E.coliBL21(DE3)中有相对分子质量约为72000的融合蛋白表达。结论成功克隆了大鼠血栓调节蛋白基因,并成功表达了该基因编码的蛋白。     

白木香细胞色素P450还原酶基因的克隆、表达与功能鉴定

细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase, CPR)是细胞色素P450酶电子传递链的组成部分,在生物体内起着重要的电子传递作用。本研究从白木香(Aquilaria sinensis)愈伤组织细胞中克隆得到1个CPR基因(Ascpr1), Ascpr1含有一个2 124 bp的开放阅读框,编码707个氨基酸残基,其蛋白分子质量为78.82 kD。系统进化分析显示, AsCPR1为Ⅱ型CPR蛋白,与来源于可可树(Theobroma cacao)的CPR蛋白亲缘关系较近。跨膜预测结果显示该蛋白的第52～71位氨基酸为跨膜区,在大肠杆菌Transetta (DE3)中成功表达了N-端缺失67个氨基酸残基的融合蛋白,经亲和色谱纯化后获得对细胞色素C具有还原能力的融合蛋白AsCPR1。本研究结果为进一步研究P450酶参与的白木香防御物质合成及CPR在白木香防御反应中的作用奠定基础。     

一种用于筛选启动子元件库的酵母检测载体的构建及初步应用

天然药物合成生物学技术是一种采用多基因控制的方式,实现天然产物代谢途径在异源底盘细胞中的重构。启动子是调控基因表达的一种顺式元件,对多基因控制的代谢途径的平衡起着重要的作用。为了筛选获得性能优越的启动子用于多基因控制的代谢途径,一个基于红色荧光蛋白的酵母检测质粒被构建。首先,根据已经发表的红色荧光蛋白基因,设计并合成了一系列引物,通过连续重叠PCR的方法合成了全长红色荧光蛋白基因DsRed-Monomer,并将该红色荧光蛋白基因导入酿酒酵母,SDS-PAGE、Western blot以及荧光显微镜观察都表明该红色荧光蛋白基因在酿酒酵母中获得了表达。然后,将具备功能的DsRed-Monomer基因与酿酒酵母表达载体pGBT9进行重组,获得能进行启动子文库筛选的启动子检测质粒pGBT9Red。为了检测该质粒的效能,通过PCR从酿酒酵母基因组中克隆得到了6种启动子(包括4种诱导型启动子和2种组成型启动子),并将6种启动子分别克隆到pGBT9Red中,置于红色荧光蛋白基因DsRed-Monomer上游,通过荧光成像确定启动子对红色荧光蛋白基因表达的调控效率。结果表明,6种启动子(GAL1、GAL2、GAL7、GAL10、TEF2和PGK1)在酿酒酵母中均能调控DsRed-Monomer的表达。该检测质粒的成功构建为进一步进行启动子活性分析和启动子元件文库筛选奠定基础。     

肝细胞生长因子在LO2细胞表达的实验研究

目的 将肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)真核表达栽体,转染培养的LO2肝细胞,观察其表达。方法 将含肝细胞生长因子cDNA真核表达栽体PEGFP-HCF,脂质体(Lipofectauline)转染培养的LO2肝细胞;PCR鉴定外源基因的导入,绿荧光蛋白检测肝细胞生长因子的表达。结果 (1)重组质粒PEGFP-C1-HGF转染峨肝细胞,5d后,细胞内可检测到绿荧光蛋白。(2)PCR结果显示：转染PEGFP-C1-HGF质粒组可见306bp特征条带与阳性对照大小一样,假转染组与空质粒组无特征条带。结论 人肝细胞生长因子基因真核表达栽体,PEGFP-C1-HGF,能成功转染LO2细胞并获表达。     

Streptomyces sp.4353中3-氨基-5-羟基-苯甲酸（AHBA）合酶基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达

目的 克隆Streptomyces sp.4353中的3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)合酶基因,并将其在大肠埃希菌中表达.方法参与AHBA生物合成的5个基因,即氨基奎尼酸脱水酶基因、氨基奎尼酸/莽草酸脱氢酶基因、AHBA合酶基因、氧化还原酶基因和磷酸酶基因通常连锁,形成一个AHBA生物合成基因簇.本文通过分析、比较已知AHBA生物合成基因簇的基因组织结构特点和序列保守性,设计引物,以Streptomyces sp.4353的总DNA为模板,在已知737bp AHBA合酶基因部分序列的基础上,通过PCR扩增其上、下游DNA序列,克隆至pMD18-T载体上,测序、拼接并进行生物信息学分析.以pET24a(+)为表达载体,对克隆得到的AHBA合酶基因在大肠埃希菌BL21-Codon Plus(DE3)-RIL中进行表达和SDS-PAGE检测.结果从Streptomyces sp.4353中得到了一段2872bp大小的DNA片段(NCBI GenBank接受号EU734184),其中含有AHBA生物合成基因簇中的AHBA合酶基因、氧化还原酶基因和磷酸酶基因(部分);AHBA合酶基因在大肠埃希菌中得到了成功表达,在SDS-PAGE上可见到清晰的、与预计大小(42.7ku)一致的蛋白表达特异条带.结论 Streptomyces sp.4353中的AHBA合酶基因的克隆以及在大肠埃希菌中的表达为进一步研究该基因的功能奠定了基础.本研究克隆得到的2872bp DNA片段还有可能用于AHBA的杂合/异源生物合成,以及安莎类抗生素的组合生物合成.     

头花蓼对幽门螺杆菌抗菌作用分析

目的:探讨头花蓼对幽门螺杆菌(Hp)的抗菌机制.方法:采用琼脂稀释法检测头花蓼对幽门螺杆菌国际标准测序株ATCC 700392的最低抑菌浓度(MIC);选用三氯醋酸/丙酮沉淀法收集药物作用前后的幽门螺杆菌全菌蛋白,应用双向凝胶电泳技术(2-DE)和Real-time PCR技术检测头花蓼对幽门螺杆菌蛋白及基因表达水平的影响.结果:头花蓼对幽门螺杆菌国际标准测序株 ATCC 700392的MIC为4 mg·ml^-1;通过质谱技术鉴定出10个差异蛋白点,其中延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基、烷基过氧化氢还原酶、粘附-巯基还原酶、非血红素铁蛋白仅在药物作用前的全菌蛋白中表达,乙酰脲利用蛋白A、亮氨酰胺肽酶、过氧化氢酶在头花蓼作用后明显下调,而丙酰胺左旋门冬氨酸酶、延长因子P和 NADPH 黄素还原酶的蛋白表达则在药物作用后上调;Real-time PCR结果显示头花蓼作用后幽门螺杆菌的过氧化氢酶基因、烷基过氧化氢还原酶基因、粘附-巯基还原酶基因基因mRNA表达量呈减弱趋势,实验组与对照组相比,katA的基因表达水平下调1.52倍,TsaA的基因表达水平下调2.94倍,TagD的基因表达水平下调3.65倍(P<0.05).结论:头花蓼对Hp具有明显的抑制作用,是通过干扰和抑制Hp蛋白表达水平和mRNA水平的发挥作用.     

人细胞色素P450 1A2的异源表达及代谢活性测定

目的 获得单一的具有活性的人细胞色素P450 1A2(CYP1A2)重组酶,以进一步进行该酶参与的药物代谢研究。方法 以人肝组织提取的总RNA为模板,RT- PCR扩增全长的人类CYP1A2基因片段,插入转座载体pFastBac构建重组转座质粒pFastBac-CYP1A2,转化入DH10Bac 大肠杆菌,获得重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-CYP1A2,以之转染草地夜蛾细胞(Sf9),与细胞色素氧化还原酶(CYPOR)进行共表达。利用蛋白质印迹分析鉴定其表达,并以非那西丁为底物,利用HPLC对其进行代谢活性测定。 结果 蛋白质印迹分析表明人CYP1A2蛋白在Sf9细胞中成功表达,且该重组酶对非那西丁的Km值为(82.04±11.39)μmol·L^-1(n=3),Vmax值为(1.78±0.26)nmol·min^-1·mg^-1蛋白(n=3),表观清除率Clint值为0.02 mL·min^-1·mg^-1蛋白。结论 利用杆状病毒/昆虫细胞系统,可获得具代谢活性的人CYP1A2重组酶,该酶可进一步用于其他底物的I相代谢研究。     

志贺菌感染的多重PCR快速诊断技术的建立

目的 探讨多重PCR技术在志贺菌感染快速诊断中的应用.方法 用多重PCR法对临床分离的68株志贺菌毒力基因shet1A、shet1B、ial和ipaH进行扩增检测.结果 68株志贺菌均在423bp(ipaH)处出现条带,在147bp(shet1B)、309bp(shet1A)、320bp(ial)处均出现了至少一个条带,与常规鉴定法的符合率达100%.结论 成功建立了志贺菌感染的多重PCR快速诊断技术.     

遗传性高铁血红蛋白一家系的基因诊断

目的 检测Ⅰ型遗传性高铁血红蛋白血症(HM)先证者(L72P,长乐)家系成员的细胞色素b5还原酶(b5R)基因的突变。方法 PCR方法扩增正常人和HM先证者之兄、父、母的b5R基因组DNA片段(含第3和第4外显子);用限制性内切酶Apa Ⅰ分析扩增产物。结果PCR扩增产物用Apa Ⅰ酶切后,正常人为649和471 bp;先证者之兄为649、440和31bp,表明存在b5R基因第72密码子纯合子突变:其父、母均为649、471、440和31bp,表明存在b5R基因第72密码子杂合子突变。结论PCR结合Apa Ⅰ内切酶分析可用于b5R基因第72密码子突变的检测;PCR-RFLP方法是检测人群中b5R基因杂合子突变的简捷有效的方法。     

Characterization of Tilapia (Oreochromis niloticus) aldehyde reductase (AKR1A1) gene,promoter and expression pattern in benzo-a-pyrene exposed fish

This study planned to isolation and characterization of AKR1A1 cDNA from Bap injected nile tilapia (Oreochromis niloticus), comparison of its characteristic structures with those of other species, characterization of AKR1A1 gene and promoter, and investigation of AKR1A1 mRNA expression in various organs of Bap injected tilapia. The cDNA was 1172?bp long which includes an open reading frame of 975?bp encoding a 324 amino acids protein and a stop codon. The sequence showed 3' and 5' non-coding regions of 179 and 18?bp. The amino acid sequence of O. niloticus AKR1A1 shows similarities of 60, 60, 60.6, 61.2 62.2, and 57.8% with mouse AKR1A1, Norway rat AKR1A1, zebrafish AKR1A1, African clawed frog AKR1A1, human, and yellow perch AKR1A1, respectively. Nucleotide sequence investigation of AKR1A1 gene and 5′-flanking region showed that the structural gene and the 5′-flanking region were approximately 2975?bp and 4006?bp in length, respectively. The protein-coding region contained eight exons, and one additional upstream exon. Real-time polymerase chain reaction (PCR) results showed that the highest level of AKR1A1 expression was found in bile (108.7), followed by kidney (77.9), muscles (37.3), and liver (24.7). mRNA levels of AKR1A1 were almost negligible in gills (0.6) while no detectable (ND) constitutive expression was detected in gut. In conclusion, our results concluded that tilapia AKR1A1 is inducible by BaP and have a significant function in the metabolism of xenobiotics and, therefore, may used as biomarker in fish     

丹参果糖磷酸酶基因的克隆和功能研究

丹参是著名的药用植物,在中国、日本、美国和欧洲国家被广泛地用于心脑血管系统疾病的治疗.笔者首次从丹参中克隆出了一个新的果糖磷酸酶基因,并将其命名为SmFBA,GenBank编号为FJ540907.SmFBA的cDNA全长含有1 390个核苷酸,包含一个完整的1 065 bp的开放阅读框,编码355个氨基酸残基.SmFBA基因全长含有3个外显子和2个内含子.生物信息学分析显示SmFBA蛋白预测的等电点为5.60,预测的分子量为37.78 ku,和其他植物物种中果糖磷酸酶具有很高的序列同源性.用Southern杂交技术显示SmFBA在丹参基因组中呈低拷贝.该基因在丹参根、茎、叶等器官都表达,根中表达量最高.体外重组表达的SmFBA在大肠杆菌中具有酶活性,并且能够提高大肠杆菌的耐盐性.这项研究进一步拓展了人们对高等植物糖酵解途径的认识.     

广西菲牛蛭水蛭素基因cDNA的克隆与序列分析

目的克隆广西菲牛蛭水蛭素基因的cDNA,并对该基因以及氨基酸进行序列分析。方法根据已发表的马尼拉菲牛蛭水蛭素基因cDNA设计一对引物,从广西菲牛蛭的头部提取总RNA后,采用RT-PCR扩增cDNA,将产物克隆至载体PMD-19T,PCR鉴定后进行测序。结果广西菲牛蛭水蛭素基因cDNA序列长度为251 bp,编码框由83个氨基酸组成,其中包括由20个氨基酸的信号肽,以及63个氨基酸组成的成熟肽。广西菲牛蛭水蛭素基因的氨基酸序列和已报道的广东菲牛蛭、马尼拉菲牛蛭水蛭素基因HM1、HM2基因的氨基酸序列相比较,同源性分别为94%,91.8%,84.7%。结论广西菲牛蛭水蛭素基因cDNA序列长度为251 bp,由83个氨基酸组成。     

丹参4-(5′-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶的cDNA全长克隆及其诱导表达分析

本文首次从丹参毛状根中克隆得到了丹参4-(5′-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(简称为SmCMK)的编码基因的全长cDNA序列，GenBank注册号：EF534309。KEGG软件分析表明：SmCMK位于二萜类化合物生物合成的上游途径——非甲羟戊酸途径(DXP)，是DXP途径上唯一的激酶。所克隆的SmCMK基因序列全长1 493 bp，包括完整的开放阅读框(open readingframe，ORF)，推测编码396个氨基酸的多肽，分子质量为43.302 kDa，等电点(pI)值为6.78；含有71 bp的5′非转译区(5′ UTR)和232 bp的3′非转译区(3′ UTR)。末尾具有完整的AATAA加尾信号和PolyA结构，说明所克隆基因的序列较为完整。经序列比对分析表明，SmCMK与其他植物CMK激酶家族具有较高的同源性。实时荧光定量PCR结果显示该基因受茉莉酸甲酯(MJ)诱导后表达水平显著升高，与丹参酮类成分含量受MJ诱导后的增加趋势一致，初步证明了SmCMK基因表达量与丹参酮类成分的积累之间的关系，为进一步研究丹参酮类成分的次生代谢调控机制奠定了基础。     

白木香查尔酮异构酶基因的克隆鉴定与表达分析

查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)是黄酮类成分生物合成途径中的关键酶之一,在植物防御反应中发挥重要作用。本研究根据白木香转录组测序结果并结合RT-PCR技术首次从白木香愈伤组织中克隆得到1个CHI基因,命名为AsCHI1。白木香AsCHI1基因的开放阅读框(ORF)长654 bp,编码蛋白含217个氨基酸,其蛋白分子质量为23.11 kDa。AsCHI1蛋白具有查尔酮异构酶保守的活性位点,系统进化树显示AsCHI1蛋白为I型CHI蛋白,与棉花(Gossypium hirsutum)CHI蛋白亲缘关系较近。构建原核表达载体pET28a-AsCHI1并在E.coli BL21(DE3)菌株中成功表达AsCHI1,利用Ni2+亲和色谱纯化得到可溶性AsCHI1重组蛋白。体外酶活性分析证明重组蛋白AsCHI1可以催化柚皮素查尔酮转化为柚皮素。实时荧光定量PCR检测结果表明白木香愈伤组织经盐、甘露醇、低温以及重金属胁迫诱导后,AsCHI1基因的表达量明显上升;植物激素脱落酸、赤霉素和水杨酸均能够诱导愈伤组织中AsCHI1基因表达,说明AsCHI1在白木香自我防御反应中发挥作用。本研究结果为进一步探讨白木香中黄酮类成分的生物合成及其在白木香防御反应中的作用提供参考。     

TNMD基因在肥胖者脂肪组织中的表达及生物信息学分析

目的 验证差异表达基因-Tenomodulin(TNMD)基因在肥胖者脂肪组织中的表达及生物信息学特征.方法 采用实时荧光定量RT-PCR法验证肥胖与正常人(各8例)脂肪组织中TNMD基因的表达筹异,应用生物信息学方法初步分析该基因的核苷酸基本特征、蛋白质理化性质、疏水性/亲水性、跨膜结构域、亚细胞定位及结构域等.结果 TNMD基因差异低丰度表达于肥胖者脂肪组织中.该基因cDNA全长1360 bp,开放阅读框长954 bp,编码317个氨基酸,预测分子量37kDa,定位于染色体Xq21.33-q23区带,含7个外显子和6个内含子;其编码蛋白为一非分泌的跨膜蛋白.定位于线粒体的可能性较大,存在一BRICHOS结构域.结论 成功验证TNMD基因在肥胖与正常者脂肪组织中的差异表达并对其进行生物信息学分析,为进一步研究该基因提供依据.     

Cloning, expression and purification of arylsulfate sulfotransferase from Eubacterium A-44

A gene (astA) encoding arylsulfate sulfotransferase (ASST), which transfers a sulfate group from phenolic sulfate esters to phenolic acceptors, was cloned from a Eubacterium A-44 genomic library. The probe (1.5 kb fragment) for the astA gene was prepared from the PCR product of the primers produced using two internal amino acid sequences of ASST, which had been purified from Eubacterium A-44. The astA gene was cloned into the pKF3 vector. Its sequence revealed a 1863 bp open reading frame (ORF) encoding a protein containing 620 amino acids with a secretary signal peptide, and showed 91% homology (identity) to Eubacterium rectale IIIH previously reported. The cloned astA gene was expressed under the T7 promoter of the expression vectors, pET-39b(+) and pET-26b(+), in Escherichia coli BL21 (DE3), and the expressed ASSTs were purified using His Bind column chromatography. The specific activities of the purified ASSTs were 25.6 micromol/min/mg and 37.1 micromol/min/mg, respectively.