慢性乙型肝炎肝纤维化患者Th1／Th2细胞及其细胞因子的变化

目的探讨Th1／Th2细胞及其分泌的细胞因子在慢性乙型肝炎（CHB）肝纤维化患者发生发展中的作用。方法选取2011年3—10月在河北医科大学第三医院感染科接受肝组织病理活检的CHB肝纤维化患者46例,根据纤维化分期分为S0～1期15例,S2～3期20例,S4期11例三组,另取同期健康志愿者10名作为健康对照组。用流式细胞术和实时荧光定量PCR检测外周血Th1、Th2细胞频率和单个核细胞（PBMCs）中干扰素γ（IFN-γ）、白细胞介素4（IL-4）基因表达;用ELISA法检测血清IFN-γ和IL-4水平;用免疫组织化学染色检测肝组织IFN-γ和IL4表达。应用Spearman相关分析、Kruskal—WallisH检验、Logistic逐步回归方法分析Th1／Th2细胞及其细胞因子在CHB肝纤维化患者外周血和肝组织中的变化。结果不同肝纤维化分期的CHB患者外周血Th1／Th2细胞频率的比值、PBMCs中IFN-γ／IL-4mRNA、血清中IFN-γ／IL-4及肝内IFN-γ／IL-4差异均有统计学意义,并随肝纤维化程度加重逐渐下降（χ2=36．259、40．822、26．321和31．852,P〈0．05）。血清及肝组织中IFN-γ,／IL-4比值与肝纤维分期均呈负相关（r=-0．616和-0．531,P〈0．01）。Logistic回归分析显示：AST、凝血酶原时间（PT）和血清IFN-γ／IL4比值是发生显著肝纤维化（S2-4）的三个独立危险因素（OR=5．933,95％CI：1．324～26．586,P=0．02;OR=12．866,95％CI：1．746～94．788,P=0．01;OR=4．755,95％CI：1．034～21．862,P：0．04）。结论CHB患者体内存在Th1／Th2失衡,随着肝纤维化进展,外周血及肝脏内均呈现Th2应答的极化现象,这可能是CHB肝纤维化发生发展的一种机制。     

异体骨髓间充质干细胞治疗乙型肝炎终末期肝病的短期疗效及对Th1/Th2的影响

目的 初步探讨异体骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗终末期肝病的短期疗效及其对Th1/Th2平衡的影响.方法 35例乙型肝炎终末期肝病患者分为两组,干细胞治疗(治疗组)13例,均采用内科综合基础上加用MSCs移植治疗;对照组22例,予以内科综合治疗.观察治疗前,治疗后2和4周的丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、总胆红素(TBil)、白蛋白(ALB)与凝血酶原活动度(PTA)等指标变化.应用流式细胞仪检测患者外周血IFN-γ与IL-4的水平,分析Th1/Th2的变化.比较两组患者治疗前后生化指标及治疗组Th1/Th2的变化情况.结果 13例患者干细胞移植全部成功且未出现不良反应和并发症,治疗组后4周无死亡病例.治疗组患者的肝功能及凝血功能恢复优于对照组,其中ALT、PTA与对照组比较差异具有统计学意义(P＜ 0.05);而 ALB、TBil与对照组比较差异无统计学意义(P >0.05).治疗组患者干细胞治疗后IFN-γ均升高,其中慢性乙型肝炎肝衰竭患者干细胞治疗后IL-4升高,而乙型肝炎肝硬化患者干细胞治疗后IL-4下降.治疗组干细胞治疗后Th1/Th2较治疗前升高.结论 MSCs治疗乙型肝炎终末期肝病是安全有效的,对Th1/Th2轴可能有免疫调节作用,但其机制有待进一步研究.     

HBV对人骨髓间充质干细胞体外增殖的影响

目的探讨HBV对人骨髓来源间充质干细胞(MSCs)体外增殖的影响。方法从成人骨髓分离纯化MSCs并体外培养至第3代,将MSCs与含高浓度HBV的人血清共培养作为实验组,并用不含HBV的健康人血清作为对照。采用MTT法绘制细胞生长曲线并计算细胞倍增时间。分别应用细胞克隆形成试验和流式细胞术检测MSCs的克隆形成能力和细胞增殖指数。结果实验组的生长曲线发生右移,其对数生长期的细胞倍增时间较对照组延长(t=2.453,P<0.05)。体外培养10 d后,实验组的细胞克隆形成率和增殖指数均明显低于对照组(t=2.488,P<0.05;t=2.798,P<0.05)。结论 HBV可抑制人骨髓间充质干细胞的体外增殖。     

人羊水来源间充质干细胞冻存后生物学特征研究

目的体外分离培养人羊水间充质干细胞(human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells,HAFMSCs),观察低温冻存复苏后HAFMSCs生物学特征,为进一步研究奠定理论基础。方法取12份自愿捐赠的孕16～20周羊水标本,采用改良两步法分离培养HAFMSCs,用含量不同的FBS、DMSO冻存液冻存细胞,液氮冻存12周后42℃水浴复苏,锥虫蓝染色检测细胞存活率,MTT法检测细胞增殖速度并绘制生长曲线,流式细胞仪检测冻存复苏后HAFMSCs表型。对冻存复苏后的HAFMSCs进行成脂、成骨诱导分化培养,并分别采用油红O、von Kossa染色进行鉴定;实时荧光定量PCR分析细胞冻存前后Oct-4、Nanog mRNA表达差异。结果细胞冻存12周后,不同的冻存方案对细胞存活率影响有差异,优化的冻存方案为DMEM/FBS/DMSO=50%/40%/10%。冻存复苏后的HAFMSCs呈漩涡状排列,生长曲线呈S形,与冻存前细胞生长曲线相似。流式细胞仪检测示冻存复苏后细胞的MSCs表型CD29、CD44、CD73、CD90为阳性,造血干细胞表型CD34、CD45为阴性。成脂、成骨诱导21 d,油红O、von Kossa染色均呈阳性。实时荧光定量PCR检测示冻存前后Oct-4、Nanog mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HAFMSCs具有体外增殖快、分化能力强的优势;并可耐受短期冻存,复苏后细胞存活率高,生物学特征及分化潜能未发生明显变化,冻存液DMEM/FBS/DMSO=50%/40%/10%是较好冻存方案。     

人羊水间充质干细胞的分离鉴定及其对抗Thy-1肾炎的治疗作用

探讨羊水间充质干细胞(amniotic fluid mesenchymal stem cells,AF-MSCs)对抗Thy-1肾炎模型的治疗作用。 方法采用差异性贴壁与机械性分离法从人孕中期羊水中分离出羊水间充质干细胞,流式细胞术鉴定其表面标志物,成脂、成骨诱导分化检测其分化能力。利用尾静脉注射抗Thy-1抗体建立SD大鼠抗Thy-1系膜增生性肾炎模型;将第5代羊水间充质干细胞通过尾静脉注射治疗抗Thy-1系膜增生性肾炎大鼠,检测大鼠尿蛋白的变化,PAS染色观察大鼠肾脏病理改变。 结果羊水间充质干细胞顺利分离,流式结果显示其表达间充质干细胞标志物(CD29、CD44、CD73、CD90、CD105)和胚胎干细胞标志物(SSEA-4)而不表达造血干细胞标志物(CD34、CD45、CD133),且在适当条件下能够被诱导分化为脂肪细胞和骨细胞。羊水间充质干细胞治疗后,与模型组相比,治疗组在第7、12天时24 h尿蛋白明显下降(P<0.01),且肾脏病理结果表明系膜细胞增殖减轻,系膜区细胞外基质积聚减少。 结论成功的从人孕中期羊水中分离出羊水间充质干细胞,羊水间充质干细胞治疗系膜增生性肾小球肾炎有效。     

人脐带间充质干细胞移植对大鼠流产模型妊娠结局的影响

目的探讨人脐带间充质干细胞(WJ-MSCs)移植对大鼠流产模型妊娠结局的影响及机制。方法将48只孕鼠随机分为6组,每组8只。生理盐水对照组(a):孕6~8d皮下注射生理盐水0.4mg·kg~(-1)·d~(-1),孕9d尾静脉注射生理盐水1ml/kg;乙醇对照组(b):孕6~8d皮下注射75%乙醇0.4mg·kg~(-1)·d~(-1),孕9d尾静脉注射生理盐水1ml/kg;流产模型组(c):孕6~8d皮下注射溴隐亭0.4mg·kg~(-1)·d~(-1),孕9d尾静脉注射生理盐水1ml/kg;实验组d1、d2、d3分别于孕6~8d皮下注射溴隐亭0.4mg·kg~(-1)·d~(-1),孕9d尾静脉注射WJ-MSCs 1×105个、1×106个、1×107个(生理盐水使用量为1ml/kg,将细胞制成混悬液后注射)。各组大鼠均于孕14d处死并取材,观察各组大鼠胚胎吸收率,RT-PCR检测蜕膜组织白介素-10(IL-10)、干扰素-γ(IFN-γ)和IL-17mRNA的相对表达量。ELISA检测各组外周血IL-10、IFN-γ和IL-17的含量。结果 c组和d1组的平均胚胎吸收数和平均胚胎吸收率均显著高于a、b、d2、d3组(P0.05)。c组、d1组与a、b、d2、d3组比较,IL-10mRNA表达显著降低(P0.05),IFN-γ和IL-17mRNA表达显著升高(P0.05)。c组、d1组与a、b、d2、d3组比较外周血IL-10含量显著降低(P0.05),IFN-γ和IL-17含量显著升高(P0.05)。c组与d1组间,a、b组与d2、d3组间的观察指标比较均无显著性差异(P0.05)。结论一定浓度的WJ-MSCs移植入大鼠流产模型体内,可以降低胚胎吸收率,改善大鼠流产模型的妊娠结局;其机制可能与WJ-MSCs上调IL-10、下调IFN-γ和IL-17的含量有关。     

胶原凝胶复合骨髓间充质干细胞对小鼠 急性肝衰竭的疗效与机制研究

目的 探讨移植胶原凝胶复合骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs） 对小鼠急性肝功能衰竭（acute liver failure,ALF）的治疗效果与机制。方法 105只雄性C57BL/6 小鼠随机 分为5组：对照组、ALF组、ALF+胶原凝胶组、MSCs组和胶原凝胶-MSCs组,每组21只。ALF组、ALF+ 胶原凝胶组、MSCs组和胶原凝胶-MSCs组采用腹腔注射D-氨基半乳糖苷（D-Gal）12 h后,分别于肝脏多 点注射200 μL PBS、200 μL胶原凝胶、1×106 MSCs和1×106胶原凝胶-MSCs。记录各组小鼠7 d存活率, 全自动生化仪检测肝功能水平,HE染色检测肝脏组织病理学改变,免疫组化检测肝细胞凋亡和增殖情况, 利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测肝脏炎症因子水平,Western blotting检测PI3K-AKT信号通路表达。 结果 扫描电镜示胶原凝胶与MSCs具有较好的相容性,动物活体成像检测显示胶原凝胶-MSCs移植的 信号强于单独MSCs移植的ALF小鼠。D-Gal处理后,胶原凝胶-MSCs组和MSCs组的小鼠生存率明显提高 （P＜0.05）,小鼠血清AST、ALT在胶原凝胶-MSCs组和MSCs组的小鼠明显优于ALF组和ALF+胶原凝胶 组（P＜0.05）,且肝功能指标明显改善,胶原凝胶-MSCs组要更优于MSCs组（P＜0.05）。 HE染色提示胶原 凝胶-MSCs组肝脏的病理改变（肝细胞坏死部位和范围）轻于MSCs组,Western blotting、Ki-67和cleavedCaspase3免疫组化结果显示,胶原凝胶-MSCs组肝细胞增殖能力强于MSCs组,同时肝细胞凋亡程度要低 于MSCs组,相应的胶原凝胶-MSCs组肝脏内IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS和CCL2等炎性因子水平也低于 MSCs组。且胶原凝胶-MSCs移植能明显激活肝脏内的PI3K-AKT通路。结论 胶原凝胶复合MSCs移植能 增强MSCs的肝脏定植能力,通过抑制细胞凋亡和促进细胞增殖减轻肝损伤,并调控AKT信号通路改善肝 细胞功能,因此胶原凝胶复合MSCs移植优于单纯MSCs移植治疗ALF。     

LncRNA HIF1A-AS2对人骨髓间充质干细胞的影响

[目的]探讨LncRNA HIF1A-AS2对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用及机制。[方法]人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells, h MSCs）分为6组,为空白组、骨诱导组、AS2 NC过表达组、AS2过表达组、AS2 NC干扰组、AS2干扰组。后4组分别体外转染相应的LncRNA HIF1A-AS2的慢病毒载体,再将除空白组外的hMSCs进行成骨诱导培养。检测细胞凋亡、细胞增殖和细胞钙化沉积情况。检测HIF1A-AS2、MMP2和VEGF165 mRNA的表达水平及MMP2和VEGF165蛋白的表达水平。[结果] RT-PCR结果显示,成骨诱导分化最强时间点为7 d。细胞凋亡率由高至低依次为,空白组>AS2干扰组>AS2 NC过表达组>AS2 NC干扰组>骨诱导组>AS2过表达组,整体差异有统计学意义（P<0.05）。细胞增殖OD值由低至高依次为：空白组相似文献   

hBMP-2基因改良修饰骨髓间充质干细胞和人脐血间充质干细胞研究

目的研究hBMP-2基因改良修饰骨髓和人脐血间充质干细胞的方法,并比较修饰结果。 方法联合应用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、培养骨髓和人脐血间充质干细胞,通过高效非脂质体试剂X-treme GENE介导重组hBMP-2质粒转染骨髓和人脐血间充质干细胞,倒置荧光显微镜检测荧光强度并计算转染效率,qPCR检测hBMP-2及软骨连接蛋白在两种细胞中的表达,免疫组化检测细胞中Ⅱ型胶原的变化。 结果成功分离、培养出骨髓和人脐血间充质干细胞,两种细胞具有不同的生长特性。高效非脂质体试剂介导的重组hBMP-2质粒成功转染骨髓和人脐血间充质干细胞,转染骨髓间充质干细胞效率[（18.44±5.94）%]低于人脐血间充质干细胞[（27.74±7.59）%],且差异有统计学意义（t=3.027,P<0.05）。转染后的两种细胞均检测到hBMP-2、软骨连接蛋白及Ⅱ型胶原的表达。 结论hBMP-2基因可以有效改良修饰骨髓和人脐血间充质干细胞,且能促进其向软骨细胞方向分化。     

体外调节Th1/Th2平衡治疗脑胶质瘤

目的 观察外源性细胞因子白细胞介素( IL)-2、干扰素(IFN)-γ和IL-4单克隆抗体(McAb)、IL-10 McAb在体外能否促使Th2型细胞因子分泌优势向Th1型逆转,抑制胶质瘤细胞生长。方法 体外培养大鼠C6胶质瘤细胞,加入外源性细胞因子共同孵育,光学显微镜观察细胞形态学变化,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖抑制率,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Th1/Th2类细胞因子表达变化。结果 实验组较对照组细胞体积变小,生长密度低,细胞数目少;实验组与对照组比较细胞增殖抑制率分别为(26.41 ±3.60)％,其A值与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。对照组细胞只表达Th2类细胞因子,Th1类细胞因子表达缺如,实验组IFN-γ表达增加,IL-4和IL-10表达减弱,但是未见IL-2表达。结论 外源性细胞因子能够抑制脑胶质瘤细胞的生长,促进Th2型细胞因子分泌优势向Th1型逆转。     

人羊水来源c-kit~+间充质干细胞的生物学特征和心肌诱导分化

目的探讨人羊水来源c-kit~+间充质干细胞(c-kit~+human amniotic fluid-derived mesenchymal stemcells,c-kit~+HAFMSCs)的生物学特征及心肌诱导分化能力。方法通过产前诊断或自愿引产获取50份孕中期羊水标本,经流式细胞仪分选c-kit~+HAFMSCs,MTT法观察细胞增殖情况,并通过流式细胞仪、细胞免疫化学染色观察行细胞表型鉴定。在体外经成骨及成脂诱导分化,于诱导培养后21 d采用yon Kossa染色观察钙沉积颗粒,油红O染色观察脂滴形成情况。实时荧光定量PCR检测细胞经5氮-2’脱氧胞苷心肌诱导前后,NKx2.5、Tbx5、GATA-4、α-MHC 4种心肌特异性基因表达情况。结果经流式细胞仪分选,人孕中期羊水中c-kit~+HAFMSCs含量约为贴壁细胞的3.07%±1.03%;体外增殖迅速,表达MSCs表面标志CD29、CD44、CD73、CD90、CD105,不表达造血干细胞表面标志CD34、CD45;农达人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-ABC,不表达HLA-DR。细胞免疫化学染色示CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、Oct-4染色呈阳性,CD34、CD45染色呈阴性。MTT检测示第5、10、15代c-kit~+HAFMSCs具有相似的生长曲线。成骨和成脂诱导培养后21 d,细胞内有钙盐沉积和脂滴形成。实时荧光定量PCR检测示,心肌诱导后14 d,NKx2.5、Tbx5、GATA-4、α-MHC 4种心肌特异性基因表达均较诱导前明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论通过流式细胞仪分选的c-kit~+HAFMSCs在体外可以诱导分化为心肌样细胞,可能成为心肌再生性治疗的种子细胞。     

恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎肝衰竭的疗效观察

目的观察恩替卡韦对乙型肝炎慢性肝衰竭患者肝功能及生存率的影响。方法治疗组63例乙型肝炎慢性衰竭患者在常规内科治疗基础上加用恩替卡韦0.5mg/d,对照组58例患者采用常规内科治疗,观察12周内两组患者肝脏生化学指标、凝血酶原活动度（PTA）、HBVDNA低于检测下限的比率并进行随访,比较两组患者的生存率。结果在治疗第4、8、12周时两组患者血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）均显著下降,但差别无统计学意义。第12周时治疗组PTA较对照组升高,差别具有统计学意义（P〈0.05）。治疗4周时治疗组血清HBVDNA水平较对照组明显下降（P〈0.05）。治疗第8周、12周时HBVDNA低于检测下限的比率显著高于对照组,差别有统计学意义。随访4年期间,治疗组与对照组存活率分别为57.1%和17.2%,治疗组存活率高于对照组（P〈0.01）。采用Kaplan-Meier方法对两组患者进行生存分析,治疗组的生存率高于对照组（P〈0.01）。结论在乙型肝炎慢性肝衰竭患者中应用恩替卡韦抗病毒治疗能够改善患者的肝功能,提高患者生存率。     

结直肠癌患者外周血Th1和Th2细胞的检测与临床意义

目的 研究结直肠癌患者外周血CD4+T细胞亚群Th1和Th2细胞的比例以及相关特异性转录因子与细胞因子的表达水平,并观察其与临床分期之间的关系.方法 43名结直肠癌患者(肠癌组)与30名健康体检志愿者(对照组)作为研究对象.结直肠癌患者外周血Th1和Th2细胞占CD4+T细胞的比例运用流式细胞技术进行检测.采用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative Real-time PCR),检测外周血Th1/Th2细胞亚群特异性转录因子的相对基因表达量.血浆细胞因子的表达水平使用液相芯片技术方法定量检测.结果 肠癌组外周血Th2细胞占CD4+T细胞的比例和Th2细胞特异性转录因子GATA-3的mRNA表达量均显著高于对照组(P<0.05).肠癌组外周血Th1细胞特异性转录因子T-bet的mRNA表达量显著低于对照组(P<0.05),但Th1细胞占外周血CD4+T细胞的比例与对照组差异无统计学意义(P>0.05).血浆TNF-α、IL-1β和IL-15表达水平组间无显著差异(P>0.05).结直肠癌患者血浆IFN-γ、IL-4和IL-6的表达水平与病程分期有关(P<0.05).结论 结直肠癌患者外周血中Th1细胞比例变化不明显而Th2细胞比例明显升高.结直肠癌患者血浆细胞因子的不平衡表达可作为机体免疫状态转换与病情判断的指标.     

凝血酶对狼疮肾炎末梢血单个核细胞分泌Th1/Th2细胞因子的影响

目的探讨狼疮肾炎(LN)患者凝血活性对其Th1/Th2平衡的影响。方法LN患者20例,按红斑狼疮病情活动指数(SLEDAI)分为稳定组11例(SLEDAI<9分),活动组9例(SLEDAI≥9分)。健康对照组8例。采集末梢血单个核细胞(PBMC),进行高、低浓度凝血酶刺激下体外培养。ELISA法检测培养液上清IL-10、IFN-γ水平。RT-PCR检测IL-10和IFN-γmRNA表达。结果凝血酶呈浓度依赖性上调LN患者PBMCIL-10表达,但不影响IFN-γ表达,故增加IL-10/IFN-γ比值。结论凝血酶加重狼疮肾炎患者PBMC分泌Th1/Th2细胞因子的平衡紊乱。     

成骨肉瘤患者TH1/TH2亚群漂移研究

观察成骨肉瘤患者辅助性Ｔ淋巴亚群中Ｔｈ１／Ｔｈ２亚群的变化,为细胞因子免疫治疗提供依据。方法应用放射免疫法以及酶联免疫吸附法检测成骨肉瘤患者血清中ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α的含量,检测外周血单个核细胞培养上清中ＩＬ－２、ＩＬ－４含量。结果成骨肉瘤血清中及培养上清中ＩＬ－２减少,而ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α含量增加。结论成骨肉瘤患者中存在有Ｔｈ１／Ｔｈ２平衡失调,其中Ｔｈ１亚群功能抑制,Ｔｈ２亚群功能亢进,它们与肿瘤在宿主体内生长密切相关。