人4-1BB-hIgG1Fc融合蛋白真核表达载体的构建

目的：构建人４１ＢＢ胞膜外区ｈＩｇＧ１Ｆｃ融合蛋白真核表达载体。方法：ＰＣＲ扩增人４１ＢＢ胞膜外区和ｈＩｇＧ１Ｆｃ基因片段，用ＨｉｎｄⅢ、ＰｓｔＩ酶切４１ＢＢ胞膜外区，ＰｓｔＩ　、ＥｃｏＲ　Ｉ　酶切ｈＩｇＧ１Ｆｃ　，ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲＩ　酶切ｐＣＤＮＡ３，纯化后的酶切产物经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化大肠杆菌ＤＨ５α，氨苄青霉素筛选阳性克隆，ＰＣＲ及测序鉴定。结果：连接反应产物转化大肠杆菌ＤＨ５α，氨苄青霉素筛选出多个阳性克隆；分别以针对４１ＢＢ胞膜外区和ｈＩｇＧ１Ｆｃ的引物进行ＰＣＲ扩增，电泳后观察到一５５８ｂｐ、７０８ｂｐ的特异性条带，与４１ＢＢ胞膜外区和ｈＩｇＧ１Ｆｃ相符，提示构建成功。进一步测序分析证明克隆在ｐＣＤＮＡ３　质粒中的４１ＢＢ和ｈＩｇＧ１Ｆｃ序列和读码框架正确，无基因突变。结论：成功构建人４１ＢＢ胞膜外区ｈＩｇＧ１Ｆｃ融合蛋白真核表达载体，为表达４１ＢＢ融合蛋白奠定基础。     

人CD40L胞外区腺病毒分泌表达载体的构建

目的 构建人CD40L胞外区单基因腺病毒分泌表达载体pAd—hCD40L，为进一步研究CD40，CD40L共刺激通路在免疫耐受中的作用奠定基础。方法 用PCR法分别扩增人CD40L胞外区和致瘤素的分泌信号肽cDNA，通过PCR连接后将重组的cDNA扩增出来，导人pGEMT-Easy，经测序正确后转入AdEasy(tm)XL Adenoviral Vector System系统中，得到CD40L胞外区单基因腺病毒分泌表达载体。结果 核苷酸序列测定显示克隆基因的核苷酸及推导的氨基酸序列与文献报道一致，开放阅读框正确。结论 人CD40L胞外区单基因腺病毒分泌表达载体构建成功。     

弓形虫ZS株P22基因片段的克隆、表达与融合蛋白的纯化

目的 克隆弓形虫ZS株表面抗原P22编码基因，构建原核重组表达质粒pThioHieA，B，C／P22，并在大肠杆菌(Top10)中进行表达及纯化融合蛋白。方法 PCR扩增及限制性内切酶Pst Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切496bp的弓形虫表面抗原P22编码基因目的片段，胶回收纯化，插入表达质粒裁体pThioHisA，B，C多克隆位点，构建置组体pThioHisA，B，C／P22，并转化大肠杆菌(E.coli)Topl0，筛选阳性克隆，以限制性酶切分析及测序鉴定后，以异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导，在E.coli Top10中表达，用SDS-PAGE与免疫印迹分析表达产物并纯化．结果 PCR扩增出约496bp的P22编码基因目的片段，与预期片段大小相符；所构建的pThioHisA，B，C／P22重组体阳性克隆经双酶切与测序鉴定，与预期结果一致；SDS—PAGE与免疫印迹显示，表达融合蛋白产物约35．4kD．结论 成功构建弓形虫ZS株表面抗原P22编码基因pThioHisA，B，C／P22表达质粒，诱导表达弓形虫表面抗原P22蛋白，并纯化该融合蛋白。     

人4—1BB—hIgG1Fc融合蛋白真核表达载体的构建

目的：构建人4－1BB胞膜外区-hIgG1Fc融合蛋白真核表达载体。方法：PCR扩增人4－1BB胞膜外区和hIgG1Fc基因片段，用HindⅢ、PstI酶切4－1BB胞膜外区，PstI、EcoR I酶切hIgG1Fc,HindⅢ、EcoRI酶切pCDNA3，纯化后的酶切产物经T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选阳性克隆，PCR及测序鉴定。结果：连接反应产物转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选出多个阳性克隆；分别以针对4－1BB胞膜外区和hIg1Fc的引物进行PCR扩增，电泳后观察到一558bp、708bp的特异性条带，与4－1BB胞膜外区和hIgG1Fc相符，提示构建成功。进一步测序分析证明克隆在pCDNA3质粒中的4－1BB和hIgG1Fc序列和读码框架正确，无基因突变。结论：成功构建人4－1BB胞膜外区－hIgG1Fc融合蛋白真核表达载体，为表达4－1BB融合蛋白奠定基础。     

mOX40-hIgG1Fc真核表达载体的构建

目的构建mOX40-hIgG1Fc的真核表达载体。方法从正常人外周血单个核细胞中提取总RNA，应用RT—PCR法扩增获得hIgG1Fc段基因，将其插入pcDNA3.1，构建pcDNA3．1-hIgG1Fc重组质粒。进而从本室保存的pIRES2-EGFP-mOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段，再利用pcDNA3．1-hIgG1Fc重组载体构建pcDNA3．1-mOX40-hIgG1Fc真核表达载体，并经PCR、限制性酶谱分析和测序分析进行证实。结果构建的pcDNA3．1-mOX40-hIgG1Fc真核表达载体，经PCR、限制性酶谱分析和测序分析，证实获得的hIgGl1Fc段及mOX40胞外段基因均与国际生物信息资源库GenBank登录的相应基因序列完全一致。结论成功构建PCD—NA3．1-mOX40-hIgG1Fc真核表达载体，为OX40分子的进一步研究奠定良好的基础。     

乙肝病毒核心蛋白真核表达载体的构建与表达

目的 构建2种包含乙肝病毒核心蛋白(HBc)基因的真核表达载体,检测其在人肝癌细胞系BEL7402中的表达.方法 以质粒pUC19/3.0HBV作为模板,PCR扩增HBc基因,分别以pcDNA3.0和pEGFP-N1为母本,构建含HBc基因的真核表达载体pcDNA-HBc-HA及pEGFP-HBc.通过单、双酶切、PCR及DNA测序鉴定其正确性.利用脂质体将其分别转染入人肝癌细胞系BEL7402,并采用RT-PCR、Western blot及荧光显微镜观察的方法,分别检测其mRNA、蛋白质水平的表达.结果 获得与预期分子量大小一致的DNA片段,转染2种质粒的BEL7402细胞均可高水平表达HBc mRNA,而空载体转染组则无表达,转染pEGFP-HBc转染组及pEGFP-N1转染组,均有较强的绿色荧光表达,pcDNA-HBc-HA转染组细胞可检测到HBc-HA融合蛋白的表达.结论 成功构建2种携栽HBc基因的真核表达载体,并可在人肝癌细胞系BEL7402中有效表达.     

鼠CD40配体cDNA真核表达载体的构建

目的:构建鼠CD40配体(Mcd40)cDNA真核表达载体，为进一步研究打下基础。方法:从鼠脾细胞中提取总RNA作为模板，用特异的引物和RT—PCIL法扩增mCD40L cDNA。PCIL产物T—A克隆了T载体构建中间重组体，NheI和EcoRI双酶切后，将Mcd40L cDNA定向插入真核表达载体pcDNA3．1多克隆位点中，构建成重组表达质粒，并用酶切分析、PCIL扩增和序列测定进行了鉴定。结果:mCD40L cDNA被正确地克隆到真核表达载体pcDNA3．1^ 中，测序结果同文献报道的序列一致。结论真核表达载体pcDNA3．1^ -mCD40L的成功构建，为开展利用mCD40L基因治疗肿瘤的研究奠定了基础。     

CD40发夹siRNA真核表达质粒与siRNA表达框架对CA46细胞CD40表达的影响

目的 构建人类CD40膜蛋白siRNA真核表达质粒，观察其能否抑制CA46细胞CD40表达。方法 合成2条编码发夹siRNA序列的单链DNA，克隆到pSilenCircle载体中，构建成含目的基因片段的重组质粒——siCD40／pSilenCircle，在polⅢ U6基因启动子控制下表达siRNA。同样方法构建相对应的编码反义RNA以及无关基因的重组质粒anticD40／psilencircle和siFly／psilen Circle，以作比较和对照。PCR制备CD40-SECs（CD40-siRNA表达框架）。以脂质体FuGene6为介质瞬时转染CA46细胞，利用流式细胞技术检测细胞膜CD40的表达。结果 （1）成功构建了CD40发夹siRNA真核表达质粒siCD40／pSilen Circle、CD40反义RNA真核表达质粒anticD40／psilencircle和无关基因重组质粒siFly／psilencircle；（2）PCR成功制备CD40-SEC；（3）与siFly／pSilencircle转染组相比较，siCD40／pSilenCircle、anticD40／pSilencircle和CD40-SEC转染组的CA46细胞CD40的表达均明显减少。结论 CD40发夹siRNA真核表达质粒siCD40／pSnencircle和CD40-SEC可有效地抑制CA46细胞CD40分子的表达。RNA干扰技术可望作为一种有效的调控基因功能的工具。     

EGFP-Cre重组酶真核表达重组质粒的构建及表达

目的 构建噬菌体P1 Cre重组酶真核表达重组质粒,检测其在体外的表达情况和生物学活性.方法 利用分子克隆技术,将cre编码序列克隆到真核表达质粒pIRES2-EGFP上,构建为重组质粒pCMV-Cre-EGFP.行菌液PCR、BamHⅠ酶切及测序鉴定,用FuGENE 6介导转染293T细胞,应用荧光显微镜和流式细胞仪观察分析Cre重组酶的表达和重组效应.结果 经菌液PCR、酶切及测序等鉴定分析,证实已将目的片段cre插入pIRES2-EGFP的多克隆位点上;建立Cre( )组(pCMV-Cre-EGFP和含Loxp-CMV-RFP-Loxp的pCSilencer质粒)和Cre(-)组(pIRES2-EGFP和pCSilencer),转染293T细胞,48 h后荧光显微镜下可见2组均表达绿色荧光和红色荧光,Cre( )组的红色荧光少于Cre(-)组;流式细胞仪检测荧光蛋白表达率,统计学分析显示2组细胞的红色荧光蛋白表达率存在显著性差异(P＜0.01).结论 成功构建噬菌体P1Cre重组酶表达重组质粒,并能在体外表达具有活性的Cre重组酶.     

CD80-IgG融合蛋白的表达、纯化与鉴定

目的构建CD80-IgG融合基因表达载体，表达并纯化该融合蛋白，初步探讨其增强抗肿瘤免疫的作用。方法将小鼠CD80分子胞外段和IgG Fc段cDNA串联起来，定向克隆入质粒pcDNA3．0中，使其在哺乳动物细胞中表达。采用免疫亲和层析法纯化，免疫印迹和斑点ELISA鉴定表达的融合蛋白，流式细胞术、MTT法检测其增强白血病细胞CD80分子表达及促进T细胞增殖的功能。结果DNA测序证明两段基因正确插入质粒载体；亲和层析纯化得到浓度为0．1mg／ml，纯度为95％的蛋白质溶液；免疫印迹、ELISA表明该蛋白质即为CD80-IgG融合蛋白；流式细胞术证明其能够提高白血病细胞表面CD80分子的表达。结论成功构建融合基因表达载体，表达并纯化出融合蛋白，该蛋白可增强CD80分子的表达。     

小鼠CD160胞外段真核表达载体的构建和表达

目的 构建小鼠CD160胞外段的真核表达载体,并稳定转染CHO细胞进行真核表达.方法 从C57BL/6小鼠脾脏中提取总RNA,经RT-PCR扩增CD160胞外段,然后将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1和pEGFP-N1两种质粒中,构建重组质粒psCD160和pEGFP-sCD160.重组质粒经双酶切鉴定及测序正确后,用脂质体转染CHO细胞,并用RT-PCR和Western blot检测CD160胞外段的表达,流式细胞术检测重组psCD160与其配体的结合能力.结果 获得长度约为520 bp的小鼠CD160胞外段基因,经测序证实其序列正确.用脂质体将含有CD160胞外段基因的重组质粒载体转染CHO细胞后.RT-PCR和Western blot分析证实转染的CHO细胞可表达重组的psCD160基因,并且表达的可溶性CD160可与其配体结合.结论 成功构建小鼠CD160胞外段基因的真核表达载体,并转染CHO细胞后表达出相应蛋白,为进一步研究CD160胞外段的功能效应奠定实验基础.     

CRMP-1 真核表达载体的构建

 目的构建人坍塌反应调节蛋白1（CRMP-1）CRMP-1基因表达载体,以研究CRMP-1 蛋白在目的细胞中的生物学功能。方法
从购买的人胚肾细胞株293T 中提取总RNA,经过RT-PCR 方法扩增含人CRMP-1基因的全长cDNA,将CRMP-1基因开放阅
读框（ORF）cDNA 序列,克隆到真核表达载体p3x-FLAG-myc-CMV-24 中,构建真核表达质粒CRMP-1-p3x-FLAG-myc-CMV-24。
以酶切和CRMP-1基因序列测定方法鉴定重组质粒CRMP-1-p3x-FLAG-myc-CMV-24 的正确性。结果酶切鉴定和CRMP-1基因序列测定均证实
重组质粒CRMP-1-p3x-FLAG-myc-CMV-24 构建正确。结论成功构建人CRMP-1基因真核表达载体。     

Gene Cloning of Murine α-Fetoprotein Gene and Construction of Its Eukaryotic Expression Vector and Expression in CHO Cells

Hepatocellularcarcinoma (HCC)isamajorcauseofcancerdeathwithmorethan 1.2millionglobalan nualincidences[1] .Surgeryandlivertransplantationaretheonlyeffectivetreatments ,butmostHCCpa tientsarenoteligiblebecauseofdiagnosisatalaterstageorunderliverinsufficiencyinthesettingofcir rhosis[2 5] .Thedevelopmentofnoveltreatmentstrategiesisneeded .TheAFPisanHCC associatedoncofetalantigen .ThemajorityofhumanHCCsoverexpresstheoncofetalantigenAFP .ThisMr 700 0 0 glycoprotein ,producedathighlevelsbyth…     

转录因子Kaiso真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建并鉴定转录因子Kaiso的表达质粒pEGFP-Kaiso.方法 采用PCR的方法扩增pCS2-Kaiso中人Kaiso的全长序列,克隆至载体pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-Kaiso,以酶切及基因测序方法鉴定重组质粒的准确性.利用LipofectamineTM 2000将重组质粒转染至肺癌细胞系A549,24h后荧光显微镜观察绿色荧光信号,48 h后Western blot鉴定Kaiso蛋白表达变化.结果 限制性双酶切及DNA测序分析结果显示插入的DNA片段长度约为2 022 bp,与预期Kaiso基因片段大小相同.转染pEGFP-Kaiso重组质粒后,荧光显微镜观察到明确的绿色荧光蛋白(GFP)的绿色荧光信号,Western blot证实转染pEGFP-Kaiso质粒后的Kaiso蛋白表达量显著上调(P＜0.05).结论 成功构建了人Kaiso基因真核表达载体,为深入研究Kaiso的生物学功能提供了有力的实验工具.     

hCGβ-TT-IRES-CD40L真核表达载体的构建

目的:构建含有分子佐剂CD40L的真核表达质粒hCGβ-TT,以提高hCGβ的免疫原性。方法:用分段PCR的方法构建了hCGβ-TT,然后插入双元真核表达质粒IRES的A位点,将CD40L插入pIRES的B位点构建hCGβ-TT-IRES-CD40L。结果:经测序所克隆的基因hCGβ-TT和CD40L序列正确。结论:利用分子佐剂CD40L与hCGβ-TT的连接,构建了hCGβ-TT-IRES-CD40L真核细胞表达质粒,为检测hCGβDNA免疫避孕疫苗的免疫原性及抗生育作用奠定了基础。     

IL-18-PE38融合基因真核表达载体的构建及其在软骨细胞中的表达

目的 构建含有白细胞介素-18(IL-18)及毒素融合基因的真核表达载体，并研究其在软骨细胞中的表达情况。方法通过分子克隆技术．将IL-18-PE38融合基因插入真核表达载体PsecTag2B中，构建真核表达载体PsecTag2B-IL-18-PE38，经EcoR Ⅰ单酶切及PCR鉴定。脂质体法将其转入原代软骨细胞，通过荧光免疫细胞化学法鉴定其瞬时表达。结果 经EfoR Ⅰ单酶切及PCR鉴定证实IL-18-PE38融合基因成功克隆入真核表达载体PsecTag2B中。荧光免疫细胞化学法荧光显微镜照片证实此重组基因可在软骨细胞膜及细胞浆中表达。结论 证实了IL-18-PE38融合基因可在软骨细胞中表达，为进一步研究其对类风湿关节炎的治疗奠定了基础。     

IN-1重组单链抗体表达载体的构建与融合表达

目的：设计并人工合成IN-1重组单链抗体（recombinant IN-1 single-chain antibody）的cDNA克隆，构建其表达载体，在原核系统中实现初步表达。方法：根据gene bank中发表的IN-1抗体的轻链重链序列，重新设计适于在大肠杆菌中表达的基因片段，该基因双链分35个小片段合成，经退火、复性连接成目的片段后，克隆到克隆载体pUC-18中，经全自动序列分析仪测序证实后，再亚克隆至表达载体pET-28a（ ），转化大肠杆菌BL21，诱导表达。结果：测序结果合成的基因序列与设计的仅差一个碱基；SDS-PAGE检测显示，表达出相对分子量31kd的融合蛋白。结论：IN-1重组单链抗体基因表达载体的构建和表达，为深入研究其生物活性奠定了基础。