原花青素联合Apollon siRNA抑制肝癌HepG2细胞增殖及凋亡

目的研究原花青素联合凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)家族成员Apollon小干扰RNA(small interfer-ence RNA,siRNA)对人肝癌(HepG2)细胞增殖、凋亡的影响。方法设计并合成Apollon siRNA的序列,将一定浓度的人工合成的Apollon siRNA经脂质体包裹转染肝癌(HepG2)细胞,运用实时荧光定量RT-PCR检测Apollon mRNA的表达水平,蛋白质免疫印记技术检测Apollon的蛋白表达水平,并筛选出Apollon siRNA的有效序列,并进一步联合不同浓度的原花青素作用于肝癌(HepG2)细胞48 h后,采用WST-8法检测单用Apollon siRNA、单用原花青素、及Apollon siRNA联合原花青素对肝癌细胞增殖抑制作用,流式细胞术检测细胞早期凋亡率;Hoechst 33258染色观察HepG2细胞凋亡形态。结果设计的三对Apollon siRNA序列,筛选出其中有一对(NO.2)能明显下调Apollon mRNA与蛋白的表达水平,Apollon siRNA联合原花青素作用于HepG2细胞48 h后,单用原花青素的IC50为25.24 mg.L-1;Apollon siRNA与原花青素联合使用,原花青素的IC50为9.99 mg.L-1,增敏倍数为2.53,表现为协同作用。流式细胞术检测结果显示:Apollon siRNA联合原花青素能促进HepG2细胞凋亡,其早期凋亡率达25.2%;经荧光显微镜观察,Apollon siRNA组可见核高强度荧光的细胞,并见凋亡小体。结论 Apollon siRNA可增强肝癌细胞对原花青素的敏感性,作用机制可能为共同促进肝癌细胞早期凋亡有关,为临床上肝癌的治疗提供理论基础。     

靶向Ccndl基因的siRNA对大鼠晶状体上皮细胞增殖的抑制作用

目的 探讨靶向Cendl基因小干扰RNA(siRNA)对培养的大鼠晶状体上皮细胞(LECs)Ccndl mRNA和周期蛋白D1表达及细胞增殖的抑制作用.方法 合成3条靶向大鼠Ccndl基因的siRNA(si-Ccndl-1,si-Ccndl-2,si-Ccndl一3),LipofectamineTM2000转染体外培养的大鼠LECs,应用RT-PCR和Western blot方法分别检测Ccndl mRNA和周期蛋白D1表达变化,筛选最有效siRNA序列.MTT法连续测定转染最有效siRNA序列后24、48、72、96和120 h细胞增殖情况.结果 与对照组相比,3条siRNA均能不同程度地抑制Ccndl mRNA和周期蛋白D1的表达,以si-Ccndl-3最为有效(P<0.05).与对照组比较,si-Ccndl-3转染后24 h开始明显发挥对细胞增殖的抑制作用,并持续至120 h以后(P<0.05).结论 靶向Ccndl的siRNA能有效降低大鼠LECsCcndl mRNA和周期蛋白D1蛋白表达,抑制LECs增殖.     

白头翁皂苷B4对肝癌细胞Huh-7及其荷瘤裸鼠肿瘤的抑制作用及机制研究

目的:研究白头翁皂苷B4(AB4)对肝癌细胞Huh-7及其荷瘤裸鼠肿瘤的抑制作用及机制。方法:将Huh-7细胞分为AB4给药组、阴性对照组(等体积培养液)、阳性对照组(5-氟尿嘧啶50μmol/L),运用MTT法检测0、3、6、12、25、50、100、200、400、800、1 600μmol/L AB4作用Huh-7细胞12、24、36、48 h的增殖抑制率,计算半数抑制浓度(IC50);克隆形成试验评估50μmol/L AB4作用Huh-7细胞24 h的克隆细胞数;膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(AnnexinⅤ-FITC/PI)染色检测50μmol/L AB4作用Huh-7细胞24 h的细胞凋亡率;Western blot法检测50μmol/L AB4作用Huh-7细胞24 h后B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、胱天蛋白酶3(Caspase-3)、活化胱天蛋白酶3(Cleaved Caspase-3)、活化多腺苷二磷酸核糖聚合酶(Cleaved PARP)等凋亡蛋白的表达。将荷瘤裸鼠随机分为阴性对照组(生理盐水)、阳性对照组(5-氟尿嘧啶50 mg/kg)和AB4低、中、高剂量组(25、50、100mg/kg),每组3只,每天腹腔注射相应药物1次,连续19 d,观察裸鼠肿瘤生长情况,计算抑瘤率;苏木精-伊红(HE)染色观察肿瘤细胞形态变化。结果:AB4对Huh-7细胞的增殖抑制率随给药浓度的增加而增加,但50μmol/L后增加不明显,随作用时间的延长而增加,但作用24 h后增加不明显,AB4的IC50为(56.76±1.756)μmol/L。与阴性对照组比较,50μmol/L AB4作用Huh-7细胞24 h的克隆细胞数明显减少、Bcl-2蛋白表达明显减弱(P<0.05),细胞凋亡率和Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白表达均明显增加(P<0.05或P<0.01),且与阳性对照组差异无统计学意义。与阴性对照组比较,AB4低、中、高剂量组和阳性对照组荷瘤裸鼠的瘤体积明显减小(P<0.05),肿瘤细胞轮廓逐渐模糊,出现核固缩、核质不清晰、核碎裂现象,其抑瘤率分别为25.93%、39.15%、46.26%、42.83%。结论:AB4对Huh-7细胞及其荷瘤裸鼠均有抑制作用,其机制可能与上调Bax/Bcl-2比例、活化Caspase-3、裂解PARP、诱导细胞发生凋亡有关。     

Livin基因和Survivin基因联合靶向siRNA抑制大肠癌细胞增殖的作用

采用1个载体编码2个shRNA技术, 构建Livin基因和Survivin基因联合靶向的siRNA重组表达载体, 研究其对人大肠癌细胞生长协同抑制的增效作用。构建Livin基因和Survivin基因联合靶向的siRNA重组表达载体并转染大肠癌细胞, 通过RT-PCR和Western blotting方法检测Livin基因与Survivin基因的表达, 利用流式细胞仪检测处理后细胞的凋亡效应。经酶切鉴定和测序分析证实Livin基因和Survivin基因联合靶向的siRNA重组表达载体构建成功, 它对大肠癌细胞Livin和Survivin mRNA的抑制率分别为27.90%和32.24%, 对Livin和Survivin蛋白表达的抑制率分别为22.28%和40.86%, 诱导肿瘤细胞凋亡率为 (11.69 ± 1.37) %, 但协同干扰作用比单独干扰Livin基因或Survivin基因弱。Livin基因和Survivin基因联合靶向的siRNA重组表达载体构建成功并能抑制Livin基因和Survivin基因的表达, 但协同抑制作用比单独干扰Livin基因或Survivin基因弱。     

Bcl-2 siRNA抑制HL-60细胞bcl-2基因表达

目的应用RNA干扰技术观察Bcl2siRNA对白血病细胞HL60中bcl2基因表达的影响,探讨siRNA技术在白血病治疗中的作用。方法利用化学合成法体外化学合成Bcl2siRNA,将Bcl2siRNA与HL60细胞共孵育,用MTT法、荧光染色观察细胞增殖及凋亡情况,用RTPCR检测Bcl2mRNA水平,用荧光染色测Bcl2蛋白水平。结果Bcl2siRNA与HL60细胞共孵育48h后,HL60细胞凋亡率增加,Bcl2mRNA水平下调,Bcl2蛋白表达水平降低。转染GAPDHsiRNA组的细胞对Bcl2表达无影响。结论Bcl2siRNA能够特异性降低Bcl2mRNA水平及蛋白质的表达,促进HL60细胞凋亡。     

siRNA干扰MT1H基因对肝癌HEPG2/ADM细胞耐药性的影响

目的探讨siRNA干扰金属硫蛋白1H（metallothionein 1H，MT1H）基因逆转HEPG2／ADM细胞耐药的可行性。方法将针对MT1H的siRNA导入肝癌耐阿霉素细胞株HEPG2／ADM中；用RT—PCR方法分析MT1H基因表达情况；Western blot检测MT1H蛋白的表达，MTT法观察细胞阿霉素耐药性；TUNEL检测阿霉素诱导细胞凋亡率。结果HEPG2／ADM细胞转染MT1H siRNA48h后，与对照组比较，MT1H siRNA转染组MT1H成部分mRNA和蛋白表达均表达明显下调，细胞对ADM的药物敏感性明显提高，ADM诱导凋亡率明显增加。结论MT1H siRNA能降低MT1H的表达，增强阿霉素对HEPG2／ADM细胞凋亡诱导作用，有效逆转HEPG2／ADM细胞耐药。     

siRNA靶向沉默人多梳基因2对鼻咽癌细胞增殖及细胞周期的影响

目的 探讨siRNA沉默人多梳基因2(HPC2)对5-8F鼻咽癌细胞增殖的作用和细胞周期的影响.方法 用RNAi MAX将靶向HPC2的siRNA转染入鼻咽癌细胞5-8F,实验分scrambled阴性对照组,#1 siRNA-HPC2组,#2 siRNA-HPC2组,用CCK8法比较细胞增殖活力,平板克隆实验比较增殖能...     

靶向hTERT的特异性siRNA抑制SMMC-7721肝癌细胞增殖机制研究

目的筛选有效抑制肝癌细胞hTERT表达的小干扰RNA(siRNA)序列,并检测其对hTERT蛋白表达、细胞凋亡的影响。方法设计并合成针对hTERT的6条siRNA双链及一条阴性对照siRNA,以LipofectaminTM2000转染至肝癌SMMC-7721细胞。用磺基罗丹明B法(sulforhodamine B法,SRB法)测定干扰后细胞增殖的变化,RT-PCR测定hTERTmRNA的表达,筛选出有效序列。有效序列转染后,进一步采用Western blot法检测hTERT蛋白水平的变化,AnnexinV-FITC/PI双染、流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果以SRB和RT-PCR法筛选出的两条有效siRNA:siRNA-2和siRNA-6,能明显抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖,对细胞的抑制率分别为45.3%、38.2%,能高度沉默hTERT mRNA的基因,沉默率分别为80%、75%。二者还能明显下调hTERT蛋白表达(P<0.05),明显增加凋亡,凋亡率分别为20.23%、17.94%。结论 siRNA-2和siRNA-6能特异性沉默肝癌SMMC-7721细胞hTERT基因表达,抑制增殖,降低hTERT蛋白水平,诱导凋亡,为肝癌基因治疗提供了有力的实验依据。     

靶向Ccnd1基因的siRNA对大鼠晶状体上皮细胞增殖的抑制作用

目的探讨靶向Ccnd1基因小干扰RNA(si RNA)对培养的大鼠晶状体上皮细胞(LECs)Ccnd1 mRNA和周期蛋白D1表达及细胞增殖的抑制作用。方法合成3条靶向大鼠Ccnd1基因的siRNA(si-Ccnd1-1,si-Ccnd1-2,si-Ccnd1-3),LipofectamineTM2000转染体外培养的大鼠LECs,应用RT-PCR和Western blot方法分别检测Ccnd1 mRNA和周期蛋白D1表达变化,筛选最有效si RNA序列。MTT法连续测定转染最有效si RNA序列后24、48、72、96和120 h细胞增殖情况。结果与对照组相比,3条si RNA均能不同程度地抑制Ccnd1 mRNA和周期蛋白D1的表达,以si-Ccnd1-3最为有效(P<0.05)。与对照组比较,si-Ccnd1-3转染后24 h开始明显发挥对细胞增殖的抑制作用,并持续至120 h以后(P<0.05)。结论靶向Ccnd1的si RNA能有效降低大鼠LECsCcnd1 mRNA和周期蛋白D1蛋白表达,抑制LECs增殖。     

甲基尿石素A对油酸诱导的Huh-7细胞脂质累积的改善作用及其机制研究

目的:研究甲基尿石素A对油酸诱导的人肝癌Huh-7细胞脂质累积的改善作用及机制。方法:采用油酸诱导建立细胞脂质累积模型。取Huh-7细胞,分为对照组(培养基)和模型组(1 mmol/L油酸)、低剂量药物组(1 mmol/L油酸+10μmol/L甲基尿石素A)和高剂量药物组(1 mmol/L油酸+20μmol/L甲基尿石素A),采用油红O染色法观察细胞中脂质累积情况;采用三酰甘油(TG)酶法测定细胞内TG含量,采用聚合酶链式反应(PCR)法检测细胞中脂肪酸合成酶(FASN)、胆固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)、过氧化物酶体增殖剂激活受体α(PPAR-α)、PPAR-γ的m RNA表达水平;采用Western blotting法检测细胞中FASN的蛋白表达水平。结果:采用油酸诱导后,细胞膜周围出现大量脂滴累积;细胞内脂质及TG含量均显著升高,FASN、SREBP-1、PPAR-γ的mRNA表达水平及FASN的蛋白表达水平均显著升高,PPAR-α的mRNA表达水平显著降低(P<0.01)。采用甲基尿石素A干预后,细胞膜周围的脂滴明显减少;细胞中脂质及TG含量均显著降低,FASN、SREBP-1、PPAR-γ的mRNA表达水平及FASN的蛋白表达水平均显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:甲基尿石素A对油酸诱导的Huh-7细胞脂肪累积有一定的改善作用,其机制可能与下调FASN、SREBP-1、PPAR-γ等相关因子的表达,抑制脂肪酸从头合成、促进脂质代谢有关。     

古抑菌素A诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及对脆性组氨酸三联体蛋白和凋亡相关蛋白表达的影响

目的:研究组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂古抑菌素A(TSA)对人肝癌HepG2细胞的抑制作用以及对脆性组氨酸三联体(FHIT)蛋白和凋亡相关蛋白caspase-3、bax、bcl-2表达的影响,初步探讨其诱导凋亡的机制。方法:以不同浓度TSA(125、250、500、1000、2000nmol·L-1)处理体外培养的人肝癌HepG2细胞,孵育24、48h后采用MTT法、以吸光度值和抑制率为指标检测细胞的生长抑制情况;分别用原位末端脱氧核苷转换酶标记(TUNEL)法和免疫细胞化学法检测TSA(250、1000nmol·L-1)作用后细胞凋亡率和细胞中FHIT、caspase-3、bax、bcl-2的蛋白表达;同时设立溶剂为对照组。结果:与对照组比较,不同浓度TSA作用后吸光度值降低,抑制率升高,并呈明显的剂量依赖和时间依赖关系;TUNEL阳性细胞百分率升高(P<0.01)、细胞中FHIT、cas-pase-3、bax蛋白表达增强(P<0.05),bcl-2的变化不明显(P>0.05)。结论:TSA可能通过上调FHIT、caspase-3、bax蛋白的表达而诱导肝癌HepG2细胞凋亡。     

三七总皂苷对三种不同人肝癌细胞株增殖的影响

目的探讨三七总皂苷在体外对三种不同的人肝癌细胞株增殖的影响。方法体外培养人肝癌细胞株HepG2、BEL-7402、SMMC-7721和正常人肝细胞株L-02,给予不同浓度（0、10、100、200、400和800μg．mL^-1）的三七总皂苷分别培养24、48和72h后,采用MTT比色法检测细胞增殖的情况。结果不同浓度三七总皂苷处理正常肝细胞L-02相同时间或相同浓度（800μg．mL^-1）三七总皂苷处理正常肝细胞L-02不同的时间时,其对细胞增殖的抑制率均较低。而不同浓度三七总皂苷处理HepG2、BEL-7402和SMMC-7721肝癌细胞株相同时间或相同浓度（800μg．mL^-1）三七总皂苷处理不同的时间时,其细胞增殖抑制效应随作用浓度的增加或作用时间的延长而升高。结论三七总皂苷可显著抑制体外培养的三种不同人肝癌细胞株的增殖,且呈浓度与时间依赖性。     

奥曲肽与氟尿嘧啶联合对人结肠癌细胞SW480增殖抑制作用的研究

目的:研究奥曲肽单用及其与5-氟尿嘧啶(5-FU)联合对人结肠癌细胞SW480的增殖抑制作用。方法:采用MTT比色法测定不同浓度(10-7～10-10mol.L-1)奥曲肽单用及其与5-FU(12.5、25、50μg.mL-1)联合作用SW480后的吸光度值后计算抑制率。结果:奥曲肽各浓度中,以10-10mol.L-1抑制率最高,10-12mol.L-1以下对细胞增殖无抑制作用;奥曲肽与5-FU联合使用对细胞增殖的抑制率明显高于单用组(P<0.01)。结论:奥曲肽能抑制人结肠癌细胞SW480的增殖,并与5-FU有协同作用。     

p100蛋白慢病毒干扰载体及p100沉默的HepG2稳定细胞系的构建

目的:用表达shRNA的干扰慢病毒载体系统构建p100基因稳定沉默的HepG2人肝癌细胞系。方法:通过RNAi序列设计软件进行p100干扰片段设计,筛选出p100基因的RNAi有效靶序列,进一步合成靶序列的OligoDNA并构建pLKO.3G-p100I慢病毒载体,用双酶切及测序进行鉴定。将构建好的p100shRNA表达质粒与慢病毒包装质粒共转染至包装细胞293T,包装产生病毒颗粒。运用病毒颗粒感染HepG2细胞,获得p100稳定沉默的细胞系。荧光显微镜下观察感染效率,利用Westernblot方法检测稳定细胞株中p100的沉默效果。结果:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒载体,并获得了稳定沉默p100及对照的HepG2细胞株。慢病毒感染HepG2细胞后,荧光显微镜下观察到90%以上细胞发出绿色荧光,Westernblot证实干扰p100后,HepG2细胞株中p100蛋白表达水平明显降低。结论:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒干扰载体及p100稳定沉默的HepG2细胞系。     

Differential Expression of the Phenol Family of UDP-Glucuronosyltransferases in Hepatoma Cell Lines

Pharmaceutical Research -     

短发夹RNA对前列腺癌细胞中PIM-1基因沉默效应的研究

目的:探讨脂质体介导的短发夹RNA(shRNA)对前列腺癌细胞中PIM-1基因表达的影响.方法:构建3种针对PIM-1 mRNA不同靶点的shRNA重组质粒表达载体,并转染前列腺癌PC-3细胞.分别采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹法(Westernblot)检测转染后细胞中PIM-1 mRNA及蛋白的表达情况.结果:转染48 h后,3种PIM-1基因靶向性shRNA表达质粒均可抑制PC-3细胞中PIM-1 mRNA和蛋白的表达,其中靶向PIM-1 mRNA第707-725位和1080-1098位序列的重组质粒干扰效果更显著.结论:本研究所构建的PIM-1 shRNA表达质粒可在体外高效特异地抑制前列腺癌细胞中PIM-1的表达,为下一步研究奠定了基础.     

脂质体介导的小发夹干扰RNA对卵巢癌顺铂耐药细胞中切除修复交叉互补基因1表达的影响

目的:探讨脂质体介导的小发夹干扰RNA(shRNA)对卵巢癌顺铂耐药细胞中切除修复交叉互补基因1(ERCC1)表达的影响。方法:设计合成针对ERCC1基因的小发夹干扰RNA(ERCC1-shRNA),构建携带ERCC1-shRNA的重组质粒表达载体,采用脂质体Lipofectamine 2000转染COC1/DDP细胞。分别采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹法(Western blot)检测转染后细胞中ERCC1 mRNA及蛋白的表达,流式细胞计数检测细胞周期和细胞凋亡情况。结果:转染后COC1/DDP细胞中ERCC1mRNA表达较转染前明显降低(F=203.73,P<0.01),ERCC1蛋白表达亦显著下降。RNA干扰ERCC1基因后48h,COC1/DDP细胞的凋亡率较对照组有明显升高(t=20.65,P<0.01)。结论:构建的重组质粒表达载体转染COC1/DDP细胞可明显下调ERCC1 mRNA及蛋白的表达,诱导肿瘤细胞凋亡。     

茶多酚与抗肿瘤药物联合作用对人鼻咽癌耐药细胞株HNE-1增殖抑制的影响

目的:检测茶多酚与4种抗肿瘤药物长春新碱、平阳霉素、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、顺铂联合应用对放射线照射后的鼻咽癌耐药细胞株HNE-1(200)的增殖抑制作用。方法:采用MTT法筛选茶多酚及4种药物的低毒剂量,再测定低毒剂量的茶多酚与4种药物联合应用后对HNE-1(200)细胞的增殖抑制率。结果:茶多酚的低毒剂量为0.50mg.mL-1,该剂量下茶多酚与长春新碱、平阳霉素、5-Fu、顺铂联合应用后,对HNE-1(200)细胞的增殖抑制率均不同程度的增加,其增幅为单用抗肿瘤药的100%～300%。结论:茶多酚与4种抗肿瘤药物低剂量联合应用对人鼻咽癌耐药细胞具有明显的增殖抑制作用,提示茶多酚对该细胞株具有一定的耐药逆转作用。     

紫苏醇亚微乳剂对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制作用研究

目的:研究紫苏醇亚微乳剂对人乳腺癌细胞MCF-7的增殖抑制作用。方法:以紫苏醇溶液为对照,采用MTT比色法检测不同浓度(0、50、100、200、400、800μmol·L-1)紫苏醇亚微乳剂处理不同时间(24、48、72h)后对人乳腺癌细胞MCF-7的抑制率及半数抑制量(IC50)值,并设立空白组进行比较。结果:与空白组比较,试验组与对照组在作用24h、浓度高于400μmol·L-1,48h、浓度高于100μmol·L-1,72h、浓度高于50μmol·L-1时均表现出明显抑制作用(P<0.05);后2组抑制作用比较无显著性差异;试验组与对照组对MCF-7细胞株的IC50值分别为353.9、377.9μmol·L-1。结论:紫苏醇制成亚微乳剂后与其溶液比较,对人乳腺癌细胞MCF-7具有相同的抑制作用。