阻断Kupffer细胞TIM-4诱导iTreg细胞的产生影响小鼠肝移植免疫耐受

目的 探讨阻断Kupffer细胞(Kupffer cells,KCs)T细胞免疫球蛋白黏蛋白4(T-cell immunoglobulin and mucin-domain-containing molecule 4,TIM-4)诱导小鼠原位肝移植术后iTreg细胞的产生及其相关机制.方法 建立小鼠原位肝移植急性排斥反应模型,分为sham组、control mAb组、TIM-4 mAb组.流式细胞仪检测KCs活化,Western blot检测肝脏TIM-4表达,TUNEL检测肝细胞凋亡指数(apoptotic index,AI).提取KCs,激光共聚焦检测KCs TIM-4表达,将KCs和提取的初始CD4+T细胞进行共培养,激光共聚焦检测Kupffer细胞TIM-4表达,分为control组、control mAb组以及TIM-4 mAb组;CFSE检测CD4+T细胞增殖,流式细胞仪检测CD4+ CD25+ Foxp3+T细胞,ELISA检测IL-4、IL-6、IL-13水平,Western blot检测STAT6表达.建立小鼠移植模型,分为3组:iTreg组移植模型注入iTreg细胞(预先用TIM-4 mAb处理的TIM-4+ KCs与初始CD4+T细胞共培养所诱导),sham组和单纯肝移植组(LT)注入相应的PBS作为对照,检测各组AST、ALT、TBIL水平,HE染色评价肝组织排斥活动指数(rejective activity index,RAI),观察小鼠生存率.结果 肝移植术后24、48、72 h KCs的活化分别为15.9％、21.6％、28.3％,术后1、3、7 dTIM-4蛋白表达水平明显高于sham组(P＜0.05);control mAb组AI值(29.23 ±2.56)明显高于sham组和TIM-4 mAb组[(0.40±0.49),(11.04 ±2.28),P＜0.05].KCs与CD4+T细胞共培养后,control、control mAb以及TIM-4 mAb组CD4+T细胞的增殖率分另别为32.5％、31.6％、17.2％,CD4+ CD25+ Foxp3+T细胞分化分别为12.4％、13.9％、28.1％,共培养上清液TIM-4 mAb组IL-4、IL-6、IL-13分泌水平明显低于control mAb (P＜0.05),且加入TIM-4 mAb明显降低了与TIM-4+ KCs共培养的CD4+T细胞p-STAT6蛋白表达(P＜0.05),外源性加入IL-4可明显增高CD4+T细胞p-STAT6蛋白的表达(P＜0.05).移植模型注入iTreg细胞,iTregz组肝功指标明显好转,与LT组比较差异有统计学意义(P＜0.05).肝组织病理学检查,iTreg组RAI平均得分为(3.97±0.67),明显低于LT组[(8.47±0.90),P＜0.05],且iTreg组小鼠平均存活时间延长.结论 阻断KCs TIM-4能够抑制初始CD4+T细胞IL-4/STAT6信号通路的激活,从而诱导更多iTreg细胞的生成,致使宿主对移植物产生免疫耐受.     

阻断Kupffer细胞IRE1-XBP1通路对大鼠肝移植排斥反应的影响

目的 探讨阻断Kupffer细胞IRE-XBP1通路对大鼠原位肝移植排斥反应的作用.方法 术前用GdCl3处理或未处理建立大鼠原位肝移植急性排斥反应模型,未处理大鼠随机数字法分为XBP1-shRNA组(A组),Scrambled-shRNA组(B组),PBS组(C组);处理大鼠随机分为GdCl3+XBP1-shRNA组(D组),GdCl3+Scrambled-shRNA组(E组),GdCl3+PBS组(F组).未处理组术后检测血清ALT、AST、IFN-γ、IL-10、IL-17的表达水平;RT-PCR检测T-bet、RORγt、IFN-γ、IL-17及IL-10mRNA水平;Western blot检测CD86、CD206、IFN-γ、IL-17及IL-10蛋白表达水平,HE染色观察肝组织结构,根据Banff方案进行RAI评分,各组剩余大鼠观察术后生存率.处理组术后检测IFN-γ、IL-17及IL-10 mRNA以及蛋白表达水平,HE染色观察肝组织结构.结果 在未处理组中,与B、C组比较,A组各时间点肝功能指标ALT、AST明显下降(P＜0.05),A组血清表达IFN-γ、IL-10明显受到抑制(P＜0.05),IL-10的表达水平则呈明显上升趋势(P＜0.05),与RT-PCR和Western blot结果趋势相符合,另外A组CD86蛋白表明显下降(P＜0.05),而表达CD206上升(P＜0.05),T-bet/RORγt mRNA相对表达量也明显下降(P＜0.05),B、C组上述指标与A组对比则呈相反趋势,而且B、C组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05);A组RAI评分(3.83 ±0.14),明显低于B、C组RAI评分(9.13±0.20)、(8.95±0.26) (P ＜0.05),并且A组大鼠的生存时间明显高于B、C组大鼠(P＜0.05).在处理组中,D、E和F组肝脏局部IFN-γ、IL-17、IL-10 mRNA和蛋白表达情况以及病理组织AcR程度比较无统计学上的差异(P＞0.05).结论 阻断IRE1-XBP1通路促进了KCs的M1型极化,引起Th1/Th17向Th2/Treg的免疫偏移,在一定程度上减轻了移植肝脏急性排斥反应的程度.     

活体肝移植与尸肝移植急性细胞排斥反应的比较

目的 比较活体肝移植（LDLT）与尸肝移植（CLT）急性细胞排斥反应（ACR）的发生率及严重程度。方法 将116例病人分为两大组,LDLT组51例（其中供受体有血缘关系者30例）,CLT组65例。收集的临床资料包括肝移植物冷缺血时间、基础免疫抑制剂的应用、ACR发生次数及对激素治疗的反应、供受体HLA配型、肝移植物及病人存活情况。结果 CLT组及LDLT组移植物存活率、病人存活率、ACR发生率、ACR多次发生率、对激素治疗无效率分别是72％和78％、77％和78％、48％和41％、20％和10％、11％和4％（两组比较P＞0．05）。有血缘关系者间的肝移植与尸肝移植比较ACR的发生率差异无显著意义。在发生与不发生ACR的病人间HLA位点不合数差异亦无显著意义。以FK506为主的二联免疫治疗方案能减少ACR的发生（P＜0．01）。结论 活体肝移植与尸肝移植ACR的发生率差异无显著意义。供受体HLA配型及移植物冷缺血时间长短与ACR无关。而FK506预防ACR的效果明显优于环孢霉素A。     

细胞间粘附分子一1与肝移植排斥反应

细胞粘附分子(cell adhesion molecule CAMs)或称为粘附受体是一大类膜蛋白,它们介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质以及某些血浆蛋白间的识别与结合,并参与细胞内外的信号转导,在胚胎分化发育、正常组织结构的维持、细胞的运动游走、免疫调节、炎症反应、血栓形成、损伤修复以及肿瘤转移等生理和病理过程中发挥重要作用[1]. 在移植免疫过程中,细胞粘附分子通过细胞间的黏附作用并作为复合刺激因子刺激相应的淋巴细胞,产生抗原识别,激活T淋巴细胞,从而产生排斥反应.CAMs介导的细胞间及细胞外基质粘附机制在肝移植排斥反应中的重要作用已成为研究热点.本文就CAMs之一即:细胞间粘附分子-1与肝移植排斥反应的关系作一概述.     

细胞间粘附分子-1与肝移植排斥反应

细胞粘附分子 (ｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅＣＡＭｓ)或称为粘附受体是一大类膜蛋白 ,它们介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质以及某些血浆蛋白间的识别与结合 ,并参与细胞内外的信号转导 ,在胚胎分化发育、正常组织结构的维持、细胞的运动游走、免疫调节、炎症反应、血栓形成、损伤修复以及肿瘤转移等生理和病理过程中发挥重要作用［１］。在移植免疫过程中 ,细胞粘附分子通过细胞间的黏附作用并作为复合刺激因子刺激相应的淋巴细胞 ,产生抗原识别 ,激活Ｔ淋巴细胞 ,从而产生排斥反应。ＣＡＭｓ介导的细胞间及细胞外基质粘附…     

T淋巴细胞在异种鼠肝移植免疫排斥反应中的作用

目的 探讨Ｔ淋巴细胞是否参与了异种肝移植免疫排斥反应。方法 建立仓建到大鼠原全肝移植模型,用免疫组织化学染色方法检测异种肝移植免疫排斥反应中Ｔ淋巴细胞浸润情况及其Ｆａｓ抗原配体（Ｆａｓ－Ｌ）的表达,并用普通组织学及原位末端标记方法检测移植肝中细胞凋亡。结果 异种肝移植免疫排斥过程中,移植肝中Ｔ淋巴细胞,包括ＣＤ４、ＣＤ８亚型大量浸润,术后４天开始表达Ｆａｓ－Ｌ,随着排斥反应的加重,Ｆａｓ－Ｌ表达越     

他克莫司通过抑制GITRL减轻大鼠肝移植排斥反应的研究

目的探讨他克莫司(FK506)抑制大鼠肝移植排除反应中的作用机制。方法建立大鼠原位肝移植模型,分为3组。耐受组为Brown Norway(BN)到Lewis肝移植;排斥组为Lewis到BN肝移植;他克莫司(FK506)组在建立排斥模型基础上于术后注射FK506。术后7 d检测肝组织病理改变及糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子相关蛋白配体(GITRL)的表达、Kupffer细胞GITRL的表达及细胞因子的改变。结果与耐受组比较,排斥组肝脏及kupffer细胞中GITRL表达升高,采用FK506后,降低了GITRL表达(P<0.05)。与耐受组比较,排斥组血清及kupffer细胞中IFN-γ表达升高,IL-10降低(P<0.05),而在FK506组,与排斥组比较,血清及kupffer细胞中IFN-γ表达降低,IL-10表达升高(P<0.05)。结论 FK506能减轻大鼠肝移植后的急性排斥反应,其机制与降低GITRL的表达有关。     

阻断TIM-4分子对M1/M2型巨噬细胞极化及同种异体免疫排斥反应的影响

目的: 运用特异性单克隆抗体阻断抗原T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域蛋白-4(T-cell immunoglobulin and mucin domain containing protein-4,TIM-4),探讨其对巨噬细胞(M1/M2)极化及同种异体免疫排斥反应的影响。方法: 构建同种异体免疫排斥模型,将BALB/c小鼠脾细胞悬液注入C57BL/6小鼠腹腔,分为同型对照组(n=6)和抗TIM 4组(n=6);分别腹腔注射同型对照免疫球蛋白和抗TIM-4单克隆抗体, 300 μg/只;第5天,重复注射1次;第10天,处死两组小鼠,采用流式细胞术检测受体鼠脾和腹腔中M1和M2型巨噬细胞百分比;用实时荧光定量PCR法检测受体鼠脾和腹腔细胞中微小RNA-21(miR-21)、IL-10、p40、p35和EB病毒诱导基因3 (Epstein-Barr virus-induced gene 3,EBi-3)等mRNA表达水平。结果： 在脾细胞中,与同型对照组相比,抗TIM-4组M1和M2型巨噬细胞百分比、miR-21和p40 mRNA表达水平无明显变化(P均>0.05),但IL-10和p35 mRNA表达水平明显升高(P均<0.05),EBi-3 mRNA表达水平明显下降(P<0.05);在腹腔中,与同型对照组相比,抗TIM-4组M1型巨噬细胞百分比和p35 mRNA表达水平无明显变化(P均>0.05),而M2型巨噬细胞百分比、IL-10、p40和EBi-3 mRNA表达水平均显著升高(P均<0.05),miR-21表达水平显著降低（P<0.05）。结论： 阻断TIM-4分子促进小鼠腹腔M2增殖分化,上调脾和腹腔细胞中抑炎因子和促炎因子mRNA表达,减轻同种异体免疫排斥反应。     

Kupffer细胞对实验性肝损伤脂质过氧化反应的影响

目的：探讨Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞对实验性肝损伤脂质过氧化反应的影响。方法：用半乳糖胺（ＧａｌＮ）诱发大鼠肝损伤，分别给予Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞吞噬功能促进剂甘油三酯（ＴＧ）或抑制剂二氧化硅，并设正常和损伤对照组。给ＧａｌＮ３０ｈ后处死动物，测定血浆及肝组织有关指标。统计学处理，用Ｆ和Ｈ检验。结果：损伤组肝组织／ｇ脂质过化物（ＭＤＡ）含量明显高于正常组，超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）和的型胱甘肽（ＧＳＨ）含量低于     

阻断4-BB/4-1BB配体信号通路对抑制大鼠肝脏移植免疫排斥反应的实验研究

Background Blocking the 4-1BB/4-1BB ligand （4-1BBL） signal may modulate the secretion of Th1/Th2 cytokines and prolong the survival of the grafts, which play a key role in organ transplantation tolerance. The aim of this study was to investigate the role of blockade of the 4-1BB/4-1BBL co-stimulatory pathway with 4-1BBL monoclonal antibody （mAB） in acute rejection of rat orthotopic liver transplantation. Methods The orthotopic liver transplantation model was set up, while male Lewis rats were used as liver donors and Brown-Norway rats as recipients. The recipient rats were intravenously injected with anti 4-1BBL mAB or isotype control antibody. Groups were monitored for graft survival after transplantation. Plasma chemistry, including aspartate transaminase （AST）, alanine aminotransferase （ALT）, and bilirubin （BIL）, was assayed. The concentrations of interleukin （IL）-2, IL-10 and interferon （IFN）-γ in plasma were also measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Allograft histology images were collected under light microscope and electron microscope. Results Isotype antibody treated recipients exhibited elevated plasma levels of liver injury markers including AST, ALT and BIL, progressive portal and venous inflammation and cellular infiltration of the liver ailografts, and a mean graft survival time （MST） of 10.9 days. Administration of anti 4-1BBL mAB resulted in a decrease in plasma levels of liver injury markers and the concentrations of IL-2, IL-10 and IFN-γ. The histological grade of rejection on day 7 decreased and MST （17.3 days） increased substantially. Conclusions These results demonstrate that attenuation of acute rejection follows the blockade of the 4-1BB/4-1BBL co-stimulatory pathway with 4-1BBL monoclonal antibody and strongly suggest it is a promising strategy to prevent progression of graft rejection by suppressing T cell-mediated immunity.     

HLA抗体对肝移植术后急性排斥发生的影响

目的 探讨肝移植手术前后HLA抗体变化对移植肝脏急性排斥的影响。方法 134例患者接受改良背驮式肝移植,分别于手术前、手术后第1、7、14、30日通过酶联免疫吸附（ELISA）法检测HLA抗体,通过B超引导下肝穿刺病理检查明确有无急性排斥,观察肝移植前后HLA抗体变化对急性排斥发生的影响。结果 术前HLA抗体阳性组急性排斥发生率（56．8％）显著高于术前HLA抗体阴性组（25.9％）（P=0．001）;术前HLA抗体阴性而术后转为阳性组急性排斥发生率与术前术后HLA抗体均为阴性组有显著差异（P=0．003）。结论 患者术前HLA抗体阳性可能是引起肝移植术后急性排斥的原因之一。患者术后HLA抗体持续阳性与急性排斥的发生密切相关。     

甲型肝炎患者黏蛋白域蛋白1 和4 表达与抗体产生的相关性研究

目的 探讨甲型肝炎患者恢复期T 细胞免疫球蛋白及黏蛋白域蛋白（TIM）1 和4 mRNA 水平与体液免疫的关系,了解TIM-1 和TIM-4 在体液免疫抗体产生过程中的相关作用。方法 选取甲型病毒性肝炎典型病程的60 例患者于恢复期留取血液标本,以同期60 例健康体检志愿者血液标本作为对照,qRTPCR检测TIM-1 和TIM-4 mRNA 水平,ELISA 检测外周血白介素4（IL-4）、白介素10（IL-10）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和血清总Ig（IgG、IgM 和IgA）水平。结果 甲型病毒性肝炎患者外周血TIM-1 及TIM-4 mRNA 的表达水平高于对照组（P <0.05）;甲型病毒性肝炎患者血清中IL-4 和IL-10 水平高于对照组（P <0.05）;甲型病毒性肝炎患者血清总Ig（IgG、IgM 和IgA）水平高于正常对照组（P <0.05）。结论TIM-1 及TIM-4 水平升高可能通过提高IL-4、IL-10 和TNF-α 来增强体液免疫的功能。     

T细胞分化群40补体免疫球蛋白基因修饰骨髓间充质干细胞在肝移植排斥反应中的作用

目的探讨T细胞分化群40补体免疫球蛋白(CD40LIg)基因修饰骨髓间充质干细胞(MSCs)肝移植排斥反应中的作用。方法采用双袖套法建立DA-Lewis大鼠原位肝移植模型,经门静脉输注CD40LIg基因转染的MSCs,观察大鼠肝移植术后肝功能的变化、生存情况和移植肝病理形态学的改变,检测肝移植大鼠干扰素(INF-γ)和白细胞介素4(IL-2)水平的变化。结果(1)基因转染MSCs组生存时间显著长于对照组、单纯MSCs组和基因转染组,而单纯MSCs组和基因转染组又较对照组显著延长(P<0.05)。(2)对照组谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBil)、IL-2和INF-γ水平在肝移植术后急剧升高,各时段均显著高于3个治疗组(P<0.05);(3)肝脏组织病理检查,对照组呈重度排斥反应,单纯MSCs组和基因转染组为轻度排斥反应,而基因转染MSCs组无明显排斥反应。结论 CD40LIg基因修饰MSCs可以延长肝移植大鼠的存活时间,抑制大鼠肝移植的排斥反应。     

经静脉声学造影对移植肝急性排斥血流灌注的评价

目的 评价肝移植血流灌注的可行性,探讨经静脉声学造影脉冲反相谐波造影成像对移植肝急排的诊断价值.方法 建立异体肝移植动物模型,采用自身前后对照,术前术后均进行外周静脉声学造影并行定量分析,同时进行肝功能监测.结果 造影后急排组较未移植前及正常移植肝组AUC下降F=11.069,P=0.011;而参数A、Alpha、C、t(O)、DPI、TTP未见明显差异(P>0.05).结论 经静脉声学造影脉冲反相谐波成像技术结合声学定量技术是观测异体移植肝血流灌注的有效检测手段,此种方法 所获得的TIC参数对定量估测异体移植肝排斥的发生有较高的价值.     

Effect of emodin in suppressing acute rejection following liver allograft transplantation in rats

<正>Objective:To investigate the mechanism of action of emodin for suppressing acute allograft rejection in a rat model of liver transplantation.Methods:Brown Norway(BW) recipient rats of orthotopic liver transplantation(OLT) were divided into three groups,Group A receiving isografting(with BW rats as donor), Group B receiving allografting(with Lewis rats as donor),Group C receiving allografting and emodin treatment (50 mg/kg daily).They were sacrificed on day 7 of post-transplantation,and their hepatic histology,plasma cytokine levels,and T-cell subset expression were detected.Results:Compared with those in Group A,rats in Group B exhibited severe allograft rejection with a rejection activity index(RAI) of 7.67±0.98,extensive hepatocellular apoptosis with an apoptosis index(Al) of 35.83±2.32,and elevated plasma levels of interleukin-2 (IL-2),interleukin-10(IL-10),tumor necrosis factor-α(TNF-α),CD4~+ and CD4~+/CD8~+ ratio.However,recipients in Group C showed a decrease in histological grade of rejection and hepatocellular apoptosis,as well as a decrease in plasma levels of IL-2,TNF-α,CD4~+ and CD4~+/CD8~+ ratio,but elevated levels of IL-10 as compared with the allograft group.Conclusion:Post-OLT acute rejection could be attenuated by emodin,its mechanism of action may be associated with protecting hepatocytes from apoptosis,polarizing the Th 1 paradigm to Th2,and inhibiting the proliferation of CD4~+ T cell in plasma.