人端粒重复序列结合因子1^33—277在大肠杆菌中的？…

目的：建立能高效表达人端粒重复序列结合因子１第＾３３－２７７位（ＴＲＦ１＾３３－２７７）氨基酸的菌株并制备多抗。方法：设计一对引物,分别带有Ｋｐｎ Ｉ和ＥｃｏＲＩ位点,从已经克隆了ＴＲＦ１ｃＤＮＡ全长的重组质粒ｐＣＲⅡ－ＴＯＰＯ－ＴＲＦ１扩增ＴＲＦ１＾３３－２７７ｃＤＮＡ片段,克隆入ＰＧＥＭ－Ｔ质粒,测序和酶切图谱鉴定,ＥｃｏＲＩ酶切后亚克隆入ｐＧＥＸ－３Ｘ的ＥｃｏＲＩ位点之间,筛选在向插入重组子     

人端粒重复序列结合因子基因组和假基因研究

目的：确定人端粒重复序列结合因子(TERF1)的基因组结构和假基因的定位与结构。方法：利用GenBank等生物信息学资源，NCBI提供的BLAST及其他相关的生物信息学工具(Sequencher，DNA Strider和Autoassembler等)，确定TERF1基因组和假基因的定位与结构，并用PCR和测序证实。结果：定位在8q13上的7TERF1基因组由10个外显子构成。它有4个假基因分别分布在第13、18、21和X染色体上(ΨTERF1-X、ΨTERF1-18、ΨTERF1-21和ΨTERF1-X)，其结构均与TERF1 mRNA相似，但缺少部分外显子。ΨTERF1-13、ΨTERF1-18和ΨTERF1-21的周边序列之间存在长度至少60kb的同源片段。结论：TERF1基因组合10个外显子，它有4个加工过的假基因分布在第13、18、21和X染色体上。大片段同源序列属近期重复片段中的染色体间倍增。     

抗人端粒重复序列结合因子多克隆抗体制备及纯化

目的 制备并纯化抗人端粒重复序列结合因子片段（TRF1^33-277)的多克隆抗体。方法 运用基因工程的方法表达人工TRF1^33-277，将表达蛋白经亲和层析大量纯化后免疫白哆，制备血清过柱纯化，将TRF1^33-277和GST交连于CNBr-活化的Sephrose4B柱，血清过GST柱以去除抗GST抗体，然后经GST-TRF1柱吸收抗TRF1抗体，获得兔抗人TRF1多克隆抗体。结果 用此抗体作为一抗。在人膀胱癌细胞总蛋白中检到68KD的特异条带，与阳对照基本一致。结论 兔抗人TRF1多克隆抗体制备方法有效。所获抗TRF1^33-277多克隆抗体为国内首次报道。     

端粒重复序列结合因子1和2及端粒保护蛋白1基因在食管癌中的表达

目的检测端粒重复序列结合因子1和2及端粒保护蛋白1基因在食管癌组织中的表达。方法收集我院33例明确诊断为食管癌患者的中心组织及其相应癌旁组织,然后提取总RNA并逆转录成cDNA,适时荧光定量PCR方法检测TRF1、TRF2和POT1基因在这些组织中的表达水平。结果 TRF1mRNA在食管癌中心和癌旁表达所得CT值分别为（1.42±2.31）和（1.02±1.04）,差异有统计学意义（P〈0.05,n=33）;TRF2为（8.53±2.57）和（8.38±1.50）,两者差异无统计学意义（P〉0.05,n=33）;POT1为（4.72±1.47）和（3.80±1.06）,两者差异有统计学意义（P=0.001,n=33）。结论虽然TRF2基因在食管癌中表达没有统计学差异,但TRF1和POT1基因在食管癌组织中表达显著降低,提示TRF1和POT1有可能与食管癌的发生、发展有着密切的关系。     

端粒重复序列结合因子1和2及端粒保护蛋白1基因在食管癌中的表达

目的检测端粒重复序列结合因子1和2及端粒保护蛋白1基因在食管癌组织中的表达。方法收集我院33例明确诊断为食管癌患者的中心组织及其相应癌旁组织,然后提取总RNA并逆转录成cDNA,适时荧光定量PCR方法检测TRF1、TRF2和POT1基因在这些组织中的表达水平。结果 TRF1mRNA在食管癌中心和癌旁表达所得CT值分别为(1.42±2.31)和(1.02±1.04),差异有统计学意义(P<0.05,n=33);TRF2为(8.53±2.57)和(8.38±1.50),两者差异无统计学意义(P>0.05,n=33);POT1为(4.72±1.47)和(3.80±1.06),两者差异有统计学意义(P=0.001,n=33)。结论虽然TRF2基因在食管癌中表达没有统计学差异,但TRF1和POT1基因在食管癌组织中表达显著降低,提示TRF1和POT1有可能与食管癌的发生、发展有着密切的关系。     

人端粒重复序列结合因子在急性白血病细胞中的表达及与端粒酶活性的关系

目的:研究人端粒重复序列结合因子(TRF1)在30例急性白血病细胞中的表达,了解TRF1表达与急性白血病分型的关系,以及与端粒酶活性的关系.方法:用荧光定量RT-PCR定量检测30例急性白血病细胞中TRF1 mRNA表达情况,同时检测hTERT mRNA的表达,并分析两者之间的相关性.结果:TRF1在急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)细胞中的表达0.0126(0.0127～0.0546)明显低于正常人骨髓单个核细胞中的表达0.0457(0.00839～0.262)(P<0.001),但在急性淋巴细胞性白血病(ALL)细胞中的表达0.0745(1.92×10-6～0.193)与正常人骨髓单个核细胞比较差异无显著性,且在ANLL细胞中的表达明显低于ALL细胞中的表达(P=0.001).TRF1和hTERT在急性白血病细胞和正常人骨髓单个核细胞中的表达无显著相关性(r=-0.173,P=0.207).结论:TRF1 mRNA在ANLL细胞中表达明显降低,而在ALL细胞中表达无显著改变,提示ANLL细胞中TRF1可能通过调控端粒长度对端粒酶起间接负调控作用.     

端粒重复序列结合因子在肾脏肿瘤中的表达水平

目的:研究TRF1蛋白在肾脏恶性肿瘤及相应癌旁组织中的表达水平.方法:定量分析肾组织中TRF1蛋白的表达水平,应用经倍比稀释的TRF133-277纯化蛋白作为定量标准,建立了以抗TRF133-277单抗作定量Wes-tern-blot的方法,并以该方法检测TRF1蛋白在组织中的表达水平.结果:32例肾肿瘤样本均不同程度的表达TRF1蛋白质,均值为2.428±1.352 μg/μl,癌旁自身对照组织TRF1的表达水平为3.611±1.922 μg/μl(t=5.776,P<0.001).肿瘤组织内TRF133-277表达水平较相应癌旁组织显著降低,并与肿瘤的恶性程度相关,差异具有显著性意义(P<0.01).结论:TRF1蛋白在肾脏恶性肿瘤中的表达明显减低,并与肿瘤恶性程度呈负相关.     

端粒重复序列结合因子1在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

目的探讨人端粒重复序列结合因子1（TRF1）在非小细胞肺癌（NSCLC）肺组织中的表达及其与临床、病理的关系。方法采用Envision免疫组织化学染色法检测40例NSCLC患者手术切除后石蜡包埋标本和37例癌旁正常肺组织中TRF1的表达水平,并分析其与NSCLC患者临床、病理指标及生存期的关系。结果NSCLC组织中TRF1蛋白阳性表达率显著高于癌旁正常组织（P〈0.01）;TRF1蛋白在NSCLC组织中的阳性表达水平与患者性别、年龄、是否长期吸烟、肿瘤大小、淋巴结是否转移、病理TNM分期、分化程度、组织学类型和总生存期等方面的差异均无统计学意义（均P〉0.05）。结论TRF1在NSCLC组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常组织,但其表达水平则与NSCLC的组织学类型、性别、年龄、是否长期吸烟、肿瘤大小、淋巴结是否转移、病理TNM分期、分化程度及预后无关。     

端粒重复序列结合因子2真核表达载体的构建及表达

目的:构建端粒重复序列结合因子2(TRF2)真核表达载体,观察其在胃癌细胞中的表达.方法:EcoRI,HindⅢ双酶切AdTRF2质粒,胶回收1 600 bp小片段,连接入pcDNA3.1载体.经双酶切及测序鉴定后转染SGC7901细胞,空载体质粒转染SGC7901细胞为对照.G418选择培养液培养2个月,选取转染组及对照组细胞克隆.①细胞用阿霉素处理6 h后Western blot法检测TRF2表达.②MTT法检测转染对细胞生长增殖速度的影响.结果:成功构建TRF2真核表达载体,转染后SGC7901细胞TRF2表达明显增高,对细胞的生长增殖速度无明显影响(P＞0.05).结论:成功构建TRF2真核表达载体及稳定转染细胞株,为进一步研究TRF2功能奠定了基础.     

人碱性成纤维细胞生长因子在大肠杆菌中的融合表达

将人碱性成纤维细胞生长因子ｈｂＦＧＦ基因克隆于质粒ｐＧＥＸ，构建了融合蛋白ＧＳＴ－ＦＧＦ的表达质粒ｐＧＥＸ－ＦＧＦ，将ｐＧＥＸ－ＦＧＦ转化大肠杆菌ＤＨ５α，诱导培养后测得融合蛋白表达量占菌体总蛋白量的２２％，每升发酵液中可产生１８８ｍｇ ＧＳＴ－ＦＧＦ。     

p33^ING1在结直肠癌中的表达及其临床意义

目的：探讨生长抑制基因（inhibitor of growth,p33^ING1）在结直肠癌中的表达意义,以及p33^ING1与结直肠癌临床病理特征的关系及其可能的作用机制。方法：对60例结直肠癌组织及20例癌旁非肿瘤组织标本,应用免疫组化检测肿瘤组织和正常组织的p33^ING1、p21^WAF1的表达。结果：p33^ING1在结直肠癌组织中的表达阳性率为43.3%,在正常组织中为90.0%,显著低于正常组织（P〈0.005）;p33^ING1减低与结直肠癌的Dukes分期及淋巴结转移有一定关系（P〈0.005和P〈0.01）,而与患者的性别、年龄、肿瘤分化程度、肿瘤部位及浸润深度无明显关系（P〉0.05）。p33^ING1与p21^WAF1表达呈正相关关系（P〈0.05）。结论：p33^ING1在结直肠癌组织中低表达,对结直肠癌的发生、发展可能起着重要的作用;p33^ING1、p21^WAF1表达可作为判断结直肠癌恶性程度的重要指标之一。     

人干细胞因子cDNA克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

以超速离心法提取的HepG2细胞总RNA为模板，应用RT-PCR技术扩增得到编码人干细胞因子（SCF）全长CDNA（约0.8kb）。克隆、序列分析确证编码人SCF膜外活性区的CDNA（约0.5kb）结构正确，构建了含有该基因的表达质粒（PBV-mhSCF）并在大肠杆菌中获得高效表达。     

人PD-L2(B7-DC)基因的克隆及其IgV+C段的原核表达

目的:克隆hPD-L2(B7-DC)基因并表达其IgV C段。方法:从人外周血细胞中分离出外周单个核细胞，诱导树突细胞(DC)后通过RT—PCR扩增出全长的PD-L2基因片段；经DNA序列测定证实；用聚合酶链反应(PER)技术克隆其胞外段hPD—L2(IgV C)，构建原核表达载体PGEX-4T-3／h PD-L2(IgV C)，并在大肠杆菌BL21-RIL中表达。结果:构建了其PD-L2(IgV C)片段的原核表达载体；将转化菌BL21-RIL诱导表达后经SDS-PAGE电泳分析显示在50kd处有hPD-L2(IgV C)／GST(Glumthmne S-transferase)融合蛋白的高效表达。结论:PD-L2(B7-DC)基因的克隆及其胞外段PD-L2(IgV C)的克隆和表达为PD-L-PD-1途径的深入研究奠定了坚实的基础。     

B淋巴细胞刺激因子基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

聚合酶链式反应(PCR)扩增获得了编码BLys(134—285AA)的cDNA片段，该片段以限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ双酶切插入pET32a载体。测序表明除(ATA^263→ATG^263)突变并导致了氨基酸(1263M)突变外，其余序列与Genbank报道的序列一致。蛋白表达用异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，SDS—PAGE表明：在33ku处有明显的融合蛋白表达，其表达水平高达总茵体蛋白的50％。点印迹证实融合蛋白能与anti—His6Tag抗体反应。生物学活性研究表明BLys协同丝裂霉素能明显地抑制HeLa细胞的生长。     

人MT-1E融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 :体外表达人源性MT 1E融合蛋白并进行纯化。方法 :采用RT PCR方法获得人MT 1E基因的编码区 ,将其克隆入原核表达载体pQE4 0 ,并在大肠杆菌M15中表达 ,对蛋白的表达形式及诱导条件进行分析 ,用Ni NTagarose亲和层析柱纯化目的蛋白。结果 :重组蛋白在原核细胞中以可溶和不可溶两种表达形式存在 ,但以不可溶性形式为主 ,表达量随诱导时间延长而增加 ,在诱导 8h时目的蛋白约占菌体总蛋白的 32 %。经亲和层析获得较高纯度的人MT 1E融合蛋白。结论 :利用基因重组原核表达技术获得较纯的人源性MT 1E融合蛋白 ,为进一步研究金属硫蛋白的功能及特异性抗体的制备奠定了基础。     

重组人sCD40L功能性片段在大肠杆菌中的表达

目的 克隆sCD40L功能性片段(E107-L261)基因并在大肠杆菌体系进行表达。方法 从CD40L胞外段全长基因通过PCR方法扩增出sCD40L功能性片段(E107-L261)的基因，并在其N端融合6个组氨酸(His)；经PCR、酶以及DNA测序证实；将融合得到的sCD401L基因插入pET30a表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)表达体系进行诱导表达。结果 构建了pET30a-sCl340L原核表达载体；将转化菌BL21(DE3)诱导表达后经SDS-PAGE电泳以及Western Blotting鉴定显示在18kd处有sCD40L功能性片段(E107-L261)的高效表达。结论 sC1340L功能性片段基因的克隆及其表达为进一步研制其同源三聚体形式的功能性重组蛋白奠定了基础。     

大肠杆菌sRNA sdsR表达水平与其耐药性的相关性分析

目的 旨在探究临床分离的大肠埃希菌株中sRNA sdsR的表达水平与环丙沙星以及头孢噻肟耐药性之间的关系.方法 采用实时荧光定量PCR方法 测定医院2018年1月—2018年12月从临床标本非重复分离得到的50株大肠埃希菌的sRNA sdsR的表达水平,并通过pearson相关分析确定环丙沙星及头孢噻肟耐药性与sRNA...     

鲑鱼降钙素基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

用ＰＣＲ方法从鲑精ＤＮＡ中分离出编码蛙鱼降钙素（ｓＣＴ）基因，并将其插入带有谷脱甘肽转移酶（ＧＳＴ）基因的融合表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ上，转入大肠杆菌ＪＭ１０９中，ＩＰＴＧ诱导表达。融合蛋白（ＧＳＴ－ｓＣＴ）表达量占菌体总蛋白量的３８％～４０％。用亲和层析方法纯化该融合蛋白，达８０％电泳纯，降钙素酶联免疫试验呈阳性反应。这为生产重组ｓＣＴ进而研究它的功能和应用打下了基础。     

纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用ＰＣＲ方法以分泌纳豆激酶的纳豆杆菌染色体ＤＮＡ为模板扩增纳豆激酶基因,将该基因克隆到质粒载体ＰＵＣ１９上,筛选重组子,通过限制性内切酶和ＰＣＲ技术分析初步确定该重组子所携外源基因为纳豆激酶基因。利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的表达载体,并在大肠杆菌中进行了表达,凝块溶解时间法（ＣＬＴ）测出表达产物具有溶解血栓性。在确定了最佳培养时间与诱导时间后,ＳＤＳＰＡＧＥ分析结果表明基因表达产物为分泌