狂犬病病毒抗体胶体金检测试纸的制备

通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的狂犬病病毒抗体检测方法,对犬等动物免疫狂犬病疫苗后的抗体水平监测提供参考。用醋酸锌沉淀法沉淀狂犬病病毒CVS11,Sepharose 4FF进行层析纯化。用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金,标记纯化的狂犬病病毒,喷于试纸的结合释放垫 (金标垫),将SPA (葡萄球菌表面A蛋白) 和纯化的兔抗狂犬病病毒IgG分别喷于试纸的T (检测线) 处和C (对照线) 处,组装试纸条。用制备的试纸条对261份犬血清进行检测,与快速荧光灶抑制试验 (RFFIT) 检测的结果一致;对已知效价的犬狂犬病毒中和抗体 (VNA) 大于0.5 IU,结果为阳性;对狂犬病病毒中和抗体 (VNA) 小于0.5 IU/mL的血清,结果为阴性。制备的狂犬病病毒抗体胶体金检测试纸检测犬血清抗体,具有特异、便捷、快速的特点,能够检测出狂犬病病毒中和抗体大于0.5 IU的血清,适用于临床犬血清抗体水平监测,具有良好的应用前景。     

狂犬病疫苗接种者血清对狂犬病病毒中和能力研究

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒属成员（Lyssavirus）引起的人兽共患病,全球99%以上人狂犬病是由该属主要成员狂犬病病毒（Rabies virus,RABV）引起的。近年来,我国RABV毒株多样性明显增多,但是现有狂犬病疫苗对不同毒株（特别是新出现的毒株）免疫保护效果尚不清楚。为研究目前商品化的人用狂犬病疫苗对RABV街毒株是否具备交叉免疫保护能力,本研究通过制备不同进化群、不同宿主来源的3株街毒株GDMMD16、NMALSF01和NeiMeng927A的细胞毒,分别对免疫过aG株和/或PM株狂犬病疫苗的23份人血清进行狂犬病荧光抗体病毒中和实验,结果发现所有血清对GDMMD16、NMALSF01和NeiMeng927A街毒株的中和效价均高于WHO推荐的标准（0.5IU/mL）,表明上述2种商品化的人用狂犬病疫苗对3株RABV街毒株具有保护能力。     

人乳头瘤病毒（HPV）58型中和单克隆抗体的制备及初步应用

人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）58型是宫颈癌的主要诱因之一. HPV58在亚洲地区宫颈癌组织中的检出率仅次于HPV16/18. HPV58中和单克隆抗体可用于 HPV病毒样颗粒（virus-like particle,VLP）疫苗的研究,并为病毒感染入侵机制的 研究提供实验材料. 本研究采用HPV58 L1 VLP免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞进行杂交瘤 细胞的制备,通过VLP-ELISA和假病毒中和实验筛选杂交瘤细胞株;经rProtein A纯化 阳性杂交瘤细胞培养上清获得单抗;采用ELISA测定型别特异性中和单抗的亲和力,采用相加实验及变性VLP-ELISA分析单抗识别表位的性质;选取高亲和力单抗建立定量分 析HPV58 L1 VLP的ELISA方法. 获得了2株HPV58特异性中和单抗XM-22和XM-23,亲和常数分别为2.7×107 mol-1·L和1.9×106 mol-1·L,二者识别表位可能不同. 同时获得2株具有交叉中和活性的单抗XM-21和XM-24,除可较高水平中和HPV58外,还可分别交叉 中和亲缘关系较远的HPV18和HPV6. 以XM-22建立的ELISA方法定量分析HPV58 L1 VLP的检测范围为0.05 μg/mL~0.40 μg/mL. 本研究建立的ELISA方法可用于HPV58 L1 VLP疫苗生产的质量控制研究,获得的4株具有不同特点的中和单抗可用于HPV58感染入侵机制 的研究.     

一株人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的表位及中和活性的研究

目的通过ELISA相加试验和狂犬病毒(Rabies virus,RV)逃逸突变试验对一株人源抗狂犬病病毒单克隆抗体(human anti-rabies virus monoclonal antibody,Ab1)进行抗原表位分析。方法将已知表位的对照抗体(CR57和CR4098)和Ab1进行ELISA相加试验;以及对RV逃逸株氨基酸突变位点分析进一步验证Ab1针对的抗原表位,用小鼠中和试验(mouse neutralization test,MNT)分析Ab1的体内抗狂犬病病毒中和活性。结果 Ab1和CR57可同时与RV结合;与CR4098存在竞争,Ab1的逃逸株在氨基酸位点333、336发生突变,MNT检测体内中和活性为550.32 IU/mg,MNT和快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)结果基本一致。结论该抗体针对III号抗原表位且具有较高的抗狂犬病病毒中和活性。     

芜菁花叶病毒单克隆抗体的制备及检测应用

先以芜菁花叶病毒（TuMV）免疫BAL B/C小鼠,然后取其脾细胞使之与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选、克隆,获得4株能稳定传代并分泌抗TuMV单克隆抗体（Mab）的杂交瘤细胞,并以之制备腹水单抗。4株单克隆抗体腹水ELISA效价在10-5～10-6之间,仅对TuMV起特异性反应。Western blot分析表明,4株单抗都能与TuMV 34kD的外壳蛋白亚基起特异反应。利用TuMV的多抗兔血清和单抗腹水建立了三抗体夹心ELISA检测TuMV的方法,检测病叶的灵敏度为1∶5120倍,检测提纯TuMV病毒绝对量为21.9 ng。利用三抗体夹心ELISA测定出7种作物上有TuMV侵染。      

人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的构建及验证

目的利用人源抗狂犬病病毒ScFv噬菌体抗体库,构建单克隆抗体(单抗)轻、重链质粒,瞬时表达,纯化后验证具有高中和活性的单抗。方法以从ScFv噬菌体抗体库中筛选获得特异性抗体为模板,PCR扩增抗体轻、重链可变区序列,构建人源全分子抗体瞬时转染质粒;轻、重链质粒混合后转染HEK293 EBNA1细胞,瞬时表达全分子抗体。采用Mabselect SuRe介质手动亲和纯化抗体,Nano Vue超微量分光光度计测定蛋白质的质量浓度,快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT)进行体外中和效价验证。结果成功构建22个轻链质粒,15个重链质粒。通过真核细胞瞬时表达后,经手动亲和纯化后,获得22株单抗。除1株抗体外,其余21株抗体的蛋白质量浓度均>300μg/mL;部分抗体纯度均在90%以上。中和活性结果显示,5株在1 500~1 800 IU/mg之间;8株在800~1 500 IU/mg之间;7株在500~800 IU/mg之间;其余2株在500 IU/mg以下。结论成功构建并验证获得20株中和活性>500 IU/mg的人源抗狂犬病病毒单抗,为单抗混合制剂的研究奠定了基础。     

口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及检测应用

用纯化的口蹄疫病毒(Footandmouthdiseasevirus,FMDV)免疫BALB/C小鼠,将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用有限稀释法进行克隆,经筛选获得多株能稳定分泌抗FMDV单抗的杂交瘤细胞株。选择其中一株(2G12)用于下列实验,其细胞培养上清液的效价是1:256,腹水效价是1:1280;以自行制备的兔抗FMDV高免血清IgG为捕获抗体包被酶联免疫吸附试验微量反应板,以单抗2G12为第二抗体,建立了快速检测FMDV抗原的双抗体夹心ELISA,该方法能检出90ng病毒,而且只与FMDV发生特异性反应,与猪瘟病毒(HCV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和乙脑病毒(JEV)均不发生反应。本研究为检测口蹄疫病毒抗原提供了灵敏和特异的方法。     

IHNV单克隆抗体的制备及其初步应用

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抗利尿激素单克隆抗体的制备及初步应用

近年来,人们对抗利尿激素(ADH)有了不少新的认识,特别是它对心肾疾病的发生,对应激反应和神经网络的调节,以及对血管平滑肌细胞中某些癌基因的表达,都可能起着重要的作用。抗ADH单克隆抗体(ADH McAb)是上述研究极有用的工具。本实验室应用B淋巴细胞杂交瘤技术,成功地建立了小鼠抗ADH McAb的细胞株,并对其分泌的单克隆抗体进行了分析和初步应用。1 材料和方法 ADH:Peninsula Laboratories Inc产品;聚乙二     

新型冠状病毒假病毒的制备及血浆中和抗体检测

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引发新型冠状病毒肺炎（COVID-19）全球大流行。由于SARS-CoV-2生物安全管理的要求,高效制备获得高滴度的新型冠状病毒假病毒对基于S蛋白研发疫苗、中和抗体、病毒入侵抑制剂药物以及人群血清学调查等十分重要。本研究基于慢病毒系统,对制备新型冠状病毒假病毒过程中的重要参数进行优化,用Western Blot检测假病毒S蛋白和p24蛋白的表达及假病毒包装情况,用荧光素酶报告系统检测假病毒感染入侵效率。利用制备好的假病毒对恢复期血浆的中和抗体水平进行检测。结果显示骨架质粒与野生型Spike质粒为2∶1比例,在转染后48h收集上清为SARS-CoV-2野生型假病毒包装的最佳条件。与野生型相比,恢复期血浆对四种突变株的中和抗体滴度均降低,对B.1.351株中和能力最弱,B.1.617.2株其次,重型患者恢复期血浆对野生型和突变株的中和抗体滴度高于轻型与普通型患者。本研究优化了新型冠状病毒假病毒包装的实验室条件,评估了COVID-19患者恢复期血浆对野生型及四种突变株的中和抗体水平,提示未来对突变株的免疫逃逸进一步加强监测的重要性。     

戊型肝炎病毒中和性单克隆抗体的鉴定

阻断实验发现。用戊型肝炎病毒(HEV)衣壳蛋白重组抗原制备的8株抗HEV单克隆抗体(mAb),分别识别3个构象表位和2个线性表位。用抗体捕获反转录PCR方法证实,其中识别2个构象表位的3个mAb可以直接捕获HEV颗粒,表明这2个表位位于HEV颗粒的外表面。识别这两个表位的mAbSCll和8H3均可中和HEV对恒河猴的致病性和感染性。rnAb8C11缩短排毒时间的效应较明显,而mAb8H3延迟机体抗HEV抗体阳转时间的效应较明显。二者的中和效应具有较明显的协同作用。中和单抗8C11、8H3对戊肝不同感染时期的血清均有显著阻断作用,Fab片段的阻断作用与完整抗体类似,表明这两个mAb对应的中和表位是HEV体液免疫应答的优势表位。     

一种从抗狂犬病病毒噬菌体抗体库中筛选和验证中和抗体的方法

目的建立一种从噬菌体库抗体库中高效筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法。方法①定性分析:从经过灭活的CVS-11筛选噬菌体抗体库中挑取单克隆于96孔板中培养,制备噬菌体抗体,取培养上清进行快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT),选择可明显抑制病毒感染的克隆测序,获得具有中和活性的抗体可变区序列;②定量分析:挑选有中和活性的克隆,重新制备噬菌体抗体颗粒,纯化后进行RFFIT分析;扩增抗体可变区基因,构建真核瞬时表达质粒。瞬转HEK-293 EBNA1细胞,培养上清经Mabselect SuRe亲和纯化后测定抗体比活。结果定性分析获得的噬菌体抗体颗粒与全分子抗体体外中和活性显著相关;剔除低活性序列后,活性高于0.5 IU/mL的噬菌体抗体颗粒与其全分子抗体体外中和活性之间无显著相关;所有纯化后噬菌体抗体颗粒活性>0.5 IU/mL的序列其全分子抗体体外中和活性均>500 IU/mg。结论构建了一种从抗狂犬病病毒噬菌体库中高效筛选、验证中和抗体的方法。     

抗AAV2单克隆抗体的制备及特性研究

以纯化的重组AAV2病毒颗粒为抗原免疫小鼠,获得7株稳定分泌抗AAV2衣壳蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其中B10和G4两株单克隆抗体具有中和活性,抗体亚型分别为IgG1和IgG2a型。对这两株单克隆抗体与rAAV病毒结合的特性进行了研究。单克隆抗体B10和G4对rAAV2病毒颗粒的结合均具有良好的血清型特异性,并且这种特异结合作用不被肝素阻断。这两株抗体都不阻断AAV2病毒与敏感细胞的结合,提示它们与病毒颗粒的结合位点都不处于AAV2病毒与主要受体结合的部位内。Western blotting检测结果显示,B10与AAV2的三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3均能结合,而G4不能与AAV2的这三种衣壳蛋白结合。这说明B10与AAV2结合的位点位于衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的重叠部分处并且可能是线性表位,而G4则可能是针对AAV2病毒颗粒构象表位的抗体。这两种结合特性不同的单克隆抗体为研究AAV2病毒颗粒的表面特性和感染特性提供有用的工具。     

PTH单克隆抗体的制备与初步应用

甲状旁腺激素(parathyroid hormone, PTH)是一种只有84个氨基酸(amino acid, aa)的直链多肽激素,是调节钙磷代谢的主要激素之一。临床上通过测定PTH来评估骨转换、肾脏疾病以及血液透析患者的预后。本研究旨在通过制备抗PTH的单克隆抗体建立一种快速检测PTH的方法。首先,以化学合成法合成PTH多肽并将多肽偶联至血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)上,通过皮下注射的方式免疫BALB/c小鼠。其次,经过细胞融合以及杂交瘤细胞的筛选,共获得5株稳定分泌抗PTH的单克隆抗体,并对其进行了制备和纯化。再次,采用方阵棋盘滴定法进行抗体配对筛选,并以9B6和22E8抗体分别作为捕获抗体与酶标抗体,建立了检测PTH的双抗体夹心酶联免疫吸附测定(double-antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay, dsELISA)方法。最后,在保证灵敏度的情况下对所建立的方法进行了工作浓度的优化,该方法的检测灵敏度可达0.14ng/mL;在0.5～8.0 ng/mL的范围内,其R2达到了...     

建兰花叶病毒单克隆抗体的制备及检测应用

用建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得3株能稳定传代并分泌抗CymMV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞(2C6、5B7和12G9),分别制备它们的单抗腹水。其中5B7和12G92株单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-6,3株单抗的抗体类型及亚类均为IgG1,轻链均为κ链。利用单克隆抗体建立了抗原包被间接ELISA(ACP-ELISA)检测CymMV的方法。蝴蝶兰病叶作1∶10240倍稀释、提纯CymMV病毒浓度为4.87ng/mL(每孔的病毒绝对量为0.487ng)时,该方法仍能检测到病毒。利用ACP-ELISA方法检测了田间样品,发现CymMV在兰花上发病很普遍。     

整合狂犬病病毒G蛋白的假病毒构建及应用

目的 构建表达狂犬病病毒(rabies virus, RABV)G蛋白的假病毒,为RABV中和抗体检测及疫苗的研发提供有效实验工具。方法 通过无缝克隆技术构建表达RABV G蛋白的假病毒p-RABV-G,通过抗体中和试验评估狂犬疫苗接种者体内的中和抗体水平。结果 成功在293T细胞内进行假病毒p-RABV-G的包装,p-RABV-G可以表达G蛋白,并能高效感染Huh7.5细胞。4位狂犬疫苗接种者21 d的血清对p-RABV-G的抑制效果处于最优水平,在1∶625倍数的稀释条件下对p-RABV-G的抑制率高达95.79%、98.26%、98.42%和98.88%。结论 成功构建表达RABV G蛋白的假病毒p-RABV-G可用于狂犬疫苗的开发与中和抗体的筛选。在狂犬疫苗接种后的111 d,本文调查的4位接种者中的其中3位体内血清仍可对p-RABV-G产生抑制效果。     

抗rhEPO单克隆抗体的制备及初步应用

用重组人促红细胞生成素（ｒｈＥＰＯ）免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,取其脾细胞在ＰＥＣ４０００作用下与ＳＰ２／０小鼠骨髓瘤细胞融合,获得一株能分泌抗ｒｈＥＰＯ单抗隆抗体的杂交瘤细胞株２Ｆ１２,染色体数目大于１００条,间接ＥＬＩＳＡ法测定腹水和细胞培养上清效价,分别为１．６×１０＾－７和４×１０＾－４。测定抗体亚类时,则同时显示ＩｇＡ和ＩｇＧ１,其轻链为κ链;相对亲和力为５×１０％＾－１２ｍｏｌ／Ｌ。单抗２Ｆ