组织型纤溶酶原激活剂工程细胞系遗传特性及成瘤性分析

构建了突变体t-PA,使其在CHO-dhfr细胞中表达。获得t-PA工程细胞系。对该细胞系进行了遗传特性分析,在培养基中加入秋水仙素,通过低张、固定处理并将细胞滴片、染色,进行染色体分析,结果表明,该工程细胞系染色体条数为20条,畸变类型有异着丝粒、四倍体、裂隙、断片、微小体,畸变率为15％,属于正常范围。同时进行成瘤性检测,选用4周龄裸鼠作为试验鼠,以人宫颈癌细胞(Hela细胞)为阳性对照,CHO-dhfr细胞为阴性对照,试验表明,t-PA工程细胞及表达产物对裸鼠均无成瘤性。     

组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）突变体工程细胞株生物学特性分析

The morphology of t-PA mutant engineered cell line FSGGI48 is similar to that of CHO-dhfr- cell in polygon. When aminopterin (MTX) concentration is 5 x 10(-6) mol/L, a part of cells become slim, but they are still in polygon. Therefore, the morphology of FSGGI48 cell line is normal. The expression level is 4000 IU/10(6) cells/24 h in serum-free medium. The cell line is bequeathed for three months in vitro and revived after freezing three months, the greater part of cells are stable. The expression level is 3000-4000 IU/10(6) cells/24 h. The assay of tumorigenesis shows that the cells, cellular DNA and purified products don't form tumors in nude mice. The cell line hasn't been contaminated by mycoplasma. The results of chromosomal analysis show that the chromosomal number of CHO-dhfr- cell is 20 and the abnormal rate is 6%. FSGGI48 cell line is same as CHO-dhfr- cell in chromosomal number and the abnormal rate is 15%-18%, it is normal in scope. Therefore, the engineered cell line FSGGI48 is excellent.     

野生型组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)工程细胞株生物学特性分析

野生型t-PA工程细胞4B3形态与亲代细胞CHO-dhfr-相似呈多角形,类似上皮细胞。在MTX加压达5×10~(-7)mol/L时,少数细胞略变瘦长,但仍显多角形,形态正常。细胞无血清培养上清经FAPA检测,亚克隆株表达水平为10~6细胞4000～5000IU/24h。细胞经体外传代3个月及冻存3个月后复苏,部分亚克隆株表达水平下降,多数仍为10~6细胞4000IU/24h,表明4B3细胞株稳定性好。裸鼠试验表明,该工程株活细胞、细胞DNA、纯化的4B3rt-PA均无致瘤性病毒,支原体检查为阴性。遗传特性分析表明,该工程细胞与其亲代细胞CHO-dhfr-细胞染色体数均为20条,均有不同程度不同类型的畸变。该工程细胞的畸变率为16％。CHO-dhfr-细胞畸变率为6％。属正常范围。结果表明4B3细胞株为高效表达的性能优良的工程细胞株。     

组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）cDNA序列的测定

已经从ｍｅｌａｎｏｍａ细胞系中成功地获得了人组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）ｃＤＮＡ，在此基础上用双脱氧终止法测定了ｔ－ＰＡｃＤＮＡ编码区全序列及３’非编码区部分序列，并发现与Ｐｅｎｎｉｃａ等发表的ｒ－ＰＡｃＤＮＡ序列相比，有两处差异，其一是第１７２５位核苷酸残基为Ｃ而非Ａ，并使此处序列与Ｐｅｎｎｉｃａ序列相比新产生一个ＳｔｙＩ切点，但由于差异发生在密码子第三位，没有引起编码的氨基酸变化；其二是第     

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体工程细胞株生物学特性分析

t-PA突变体工程细胞株FSGGI48形态与其亲代细胞CHO-dhfr相似呈多角形,类似上皮细胞。在MTX加压至5×10~(-6)mol/L时,少数细胞形态略变瘦长,但仍呈多角形,因此该工程细胞株形态正常。抗体中和抑制试验及纤维蛋白板80℃加热试验显示,FSGGI48细胞表达产物与st-PA的活性均能被抗t-PA抗体所抑制,而胰酶的活性则不被抑制,且二者在80℃加热的纤维蛋白板上均不产生溶解圈,胰酶则产生溶解圈,由此可知,该细胞株表达产物为特异的rt-PA产品。细胞无血清培养上清经FA-PA检测,亚克隆株表达水平为4000IU/10~6细胞/24h。分别测定冻存3个月后复苏和体外传代3个月以上细胞的表达水平,结果显示部分亚克隆细胞株表达水平下降,多数仍为3000-4000IU/10~6细胞/24h,说明细胞株稳定性好。裸鼠试验表明,该工程株活细胞、细胞DNA、纯化的细胞表达产物均无致瘤性。支原体检查结果为阴性。染色体分析显示,FSGGI48细胞与其亲代细胞(CHO-dhfr细胞)染色体数目相同均为20条,但均有不同程度不同类型的畸变。CHO-dhfr细胞畸变率为6%。该工程细胞的畸变率为15%-18%,在允许范围内。结果证明,t-PA突变体细胞株FSGGI48为性能优良的工程细胞株。     

组织型纤溶酶原激活剂（t－PA）cDNA序列的测定

已经从ｍｅｌａｎｏｍａ细胞系中成功地获得了人组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）ｃＤＮＡ,在此基础上用双脱氧终止法测定了ｔ－ＰＡｃＤＮＡ编码区全序列及３′非编码区部分序列,并发现与Ｐｅｎｎｉｃａ等发表的ｔ－ＰＡｃＤＮＡ序列相比,有两处差异,其一是第１７２５位核苷酸残基为Ｃ而非Ａ,并使此处序列与Ｐｅｎｎｉｃａ序列相比新产生一个ＳｔｙＩ切点,但由于差异发生在密码子第三位,没有引起编码的氨基酸变化;其二是第１７７７位核苷酸残基（终止密码子后第４位核苷酸残基）为Ｔ而非Ｇ,使与终止密码子相隔３个核苷酸残基处产生了一个新的ＴＧＡ,与Ｐｅｎｎｉｃａ序列相比此处的ＢｓｔＮＩ切点也消失了。     

组织型纤溶酶原激活剂突变体细胞t—PA基因拷贝数测定及分析

组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）溶栓特异性高,但半衰期短。本组构建了增强纤维蛋白亲合力和延长半衰期的t—PA突变体表达细胞株。测定工程细胞株基因拷贝数是细胞生物学特性鉴定的一个方面。我们采用狭缝杂交法和SouthernBlot法对该细胞株t—PA基因进行了拷贝数测定,结果为30—60个拷贝。     

人组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）突变体FrGGI的构建,表达及特性…

为了获得半衰期延长,特异活性提高及具有ＰＡＩ－１抗性的新型ｔ－ＰＡ溶性剂,利用基因重组及定位突变技术构建了ｔ－ＰＡ的Ｋ１、Ｋ２区糖基化位点消除,ＰＡＩ－１结合位点缺失,Ｆ与Ｅ区连接序列Ｈｉｓ４４￣Ｓｅｒ５０置换为纤粘蛋白Ｉ型Ｆ区间连接序列Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｕ的ｔ－ＰＡ组合突变体ＦｒＧＧＩ,并在中国仓鼠卵巢细胞中获得了高效表达,对表达产物的生物学特性分析表明     

EZH2蛋白在食管上皮永生化细胞系和恶性转化细胞系中的表达

目的研究EZH2蛋白在食管上皮永生化细胞系(SHEE)和恶性转化细胞系(SHEEC)中的表达。方法采用免疫细胞化学染色、免疫印迹分析和流式细胞术检测两种细胞系EZH2蛋白的表达。结果两种细胞EZH2蛋白染色均呈阳性,阳性反应定位于细胞核,部分细胞胞浆也有阳性着色。免疫印迹分析表明SHEEC细胞和SHEE细胞的总蛋白、核蛋白在分子质量约90ku的位置均出现特异性印迹条带。SHEE细胞中EZH2蛋白的表达强于SHEEC细胞(P<0.05)。流式细胞术显示EZH2蛋白在两种细胞中均有表达,两者的平均荧光强度无明显差别;阳性细胞率均较高,其中SHEE细胞阳性率高于SHEEC细胞。结论EZH2蛋白在SHEE细胞和SHEEC细胞中高表达可能参与了它们的恶性改变;而EZH2蛋白在两种细胞系中的差异表达可能与细胞的分化程度及来源于胚胎食管上皮细胞相关。     

黑麂(Muntiacus crinifrons)细胞系的建立及其细胞生长特性和细胞遗传学分析

黑麂是我国特有的动物,其染色体大而数少(2n=8♀,2n=9♂),并且有三对大小相近,形态相似的染色体(早性6条,♂性5条)(段幸生等,1984)。由于上述特点,它可能是研究染色体结构与功能,特别是着丝点结构与功能研究的好对象,亦是辐射生物学,遗传毒理学,细胞杂交等研究的好材料。我们所建立的黑麂(♀)胚胎肺组织成纤维二倍体细胞系命名为KIZ—8102。已对其部分生物学特性进行了研究。     

HGPRT缺陷性人结肠癌细胞株的建立

本研究首先用化学突变剂乙基甲磺酸(EMS)处理人结肠癌细胞系CCL187,然后用嘌呤类似物8-氮鸟嘌呤(8-AG)筛选次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖酶缺陷细胞(HGPRT~-),历时半年,成功获得抗8-AG毒性突变体,即HG-PRT缺陷细胞株MCL187。该缺陷株细胞HG-PRT酶活性显著低于野生型细胞,在8-AG中能够存活,在HAT选择性培养基中则死亡,与野生型细胞同样表达结肠癌相关抗原LEA。此缺陷株的成功建立,为杂交细胞制备及其应用研究奠定了基础。     

人工基膜对鼻咽癌上皮细胞株（CNE—2）生长的影响

人工基膜（ＡＢＭ）主要以Ⅰ型胶原的水合性胶原丝网为网架,辅上纤维连结蛋白,Ⅳ型胶原和层粘连蛋白等主要基膜糖蛋白制备而成,具海绵状的形态结构。ＡＢＭ可减少胎牛血清用量１０％,提高细胞生活力和延长细胞传代周期。在２－５％血清浓度的情况下,ＡＢＭ可提高ＣＮＥ－２细胞的生长效率,克隆形成率和克隆生长率而抑制细胞的＾３Ｈ－ＴｄＲＡ掺入。提示在体外研究细胞外基质对细胞的影响时应使用低血清培养液。ＡＢＭ是体外诱     

大鼠脑神经干细胞系(RNSC-FMU 1)的建立和鉴定

采用无血清培养液分离和培养新生SD 大鼠脑的神经干细胞,以机械分散的方法传代,成功地建立了大鼠脑神经干细胞系(RSNC-FMU 1)。该细胞系可在体外长期传代,至今已在体外连续生长超过21个月(>100代),保持了神经干细胞的特性和正常的核型,经诱导可分化成为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,具有较旺盛的自新能力,倍增时间约为20h,并可冷冻保存,裸鼠体内移植证实其不具有成瘤性。该细胞系为神经干细胞研究提供了一个良好的工具。     

H_(18)细胞中Epstein-Barr病毒DNA复制的抑制和恢复

采用~(32)P标记的EBV DNA BamH Ⅰ-W片段为探针,通过细胞点杂交测出每个H_(18)细胞中EBV基因组拷贝数约207个。在PAA存在下,这些病毒基因组数快速下降。每毫升细胞培液中加75γPAA后第11天,每个细胞中EBV基因组平均拷贝数降到17个,只占未处理细胞的8%,而后既使继续处理也稳定地维持在该水平。然而EBV-VCA的合成被完全地抑制了,只是EBV-EA的合成不受影响。如去除PAA,第3天时细胞中EBV基因组数可恢复到对照组的29%,而第40天则可恢复到90%。但是在去除PAA处理的同时加n-BA处理则明显地抑制这种恢复。一般认为EBV附加体DNA的复制由宿主细胞DNA多聚酶催化,病毒线状DNA由病毒诱导的PAA敏感的DNA多聚酶复制。由于n-BA能有效地阻碍宿主的DNA复制功能,因而我们的实验结果提示,宿主细胞和病毒诱导的DNA多聚酶??可能都参与了去除PAA处理后的H_(18)细胞中EBV DNA的恢复。     

人体肝癌细胞系(SMMC-7721)的糖皮质激素受体以及糖皮质激素对酪氨酸转氨酶的诱导

本文以[~3H]Dex为配体,采用完整细胞GCR和核特异结合百分率的测定方法检测了人体肝癌细胞系(SMMC-7721)的GCR。实验表明,该细胞具有高亲和力、低容量、能与GC进行特异结合的Dex结合部位,该结合部位与[~3H]Dex结合后可向核内转位,因而具备了作为GCR的基本条件。但该细胞的GCR与正常细胞的GCR相比较亦有些差别,GC与受体结合后不能诱导TAT的生成。本文对上述改变的可能机理进行了讨论。     

小鼠胎肝造血基质细胞系对CFU—GM生长的调控作用

利用本实验室建立的小鼠胎肝造血基质细胞系(MFLSC)研究了造血基质细胞对粒-巨噬系造血祖细胞(CFU-GM)生长的影响。实验结果表明,MFLSC对CFUGM集落的生成有双向调控作用,即既有刺激性作用,又有抑制性影响。这种调控有体液因子之中介,亦有细胞与细胞间近距离的效应。文中讨论了MFLSC双向调控CFUGM生长的意义及其机理。