白念珠菌钙调蛋白基因单点突变重组质粒的构建和鉴定

目的；构建白念珠菌钙调蛋白基因（CMD1）单点突变重组质粒，为进一步探讨CMD1突变对真菌生长周期及致病性的影响奠定基础。方法：采用PCR定点突变法，将CMD1编码C端3个苯丙氨酸（F89、F92和F141）的碱基分别定点突变成编码丙氨酸的碱基，构建CMD1单点突变重组表达质粒，并进行序列测定。结果：测序结果证实，所构建的3个重组质粒均含有相应的CMD1定点突变后的序列，F89^ ：TTC→GCT；F92^ :TTT→GCC；F141^ :TTT→GCC。结论：成功构建了3个CMD1单点突变重组表达质粒，为后续研究奠定了基础。     

白念珠菌钙调蛋白定点突变重组菌株的构建和鉴定

目的：构建白念珠菌钙调蛋白（Cmd1）定点突变重组菌株,为进一步探讨钙调蛋白基因突变对真菌生长周期及致病性的影响奠定基础。方法：将含白念珠菌钙调蛋白基因（CMD1）定点突变的重组质粒转染CMD1缺陷HIS3^ 重组单倍体菌株,用His/Trp省却培养基和His/Trp/Ura省却培养基联合选择培养筛选到Cmd1定点突变酵母菌株。结果：经选择培养筛选得到能在His/Trp省却培养基上生长而不能在His/Trp/Ura省却培养基生长的菌株4株。结论：成功构建了4株Cmd1定点突变重组菌染,为进一步探讨Cmd1定点突变对白念珠菌生物学特性及致病性的影响奠定基础。     

钙调蛋白的分子生物学

钙是机体重要的调节因子之一,它同CAMP一样可作为第二信使广泛参与生命活动的调控。现已证实,钙几乎都是与钙调蛋白(Calmodulin,CaM)结合成活性复合物而完成其调控功能。CaM的分布无所不在,且与钙平行,标志着它具有普遍的生物     

钙调蛋白结构域来源小分子多肽的构建

目的 构建钙调蛋白结构域来源小分子多肽(EF-hand 4,a.a 113-148),建立一种简便、直观、快速检测EF-hand 4的电泳方法.方法 通过固相合成法构建EF-hand 4.采用分离胶为16.5％T的Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳法检测多肽,CS Analyzer 3.0软件对EF-hand 4...     

缺氧家兔组织钙调蛋白水平及钙调蛋白拮抗剂对血流动力学的影响

为观察钙调蛋白(CaM)在缺氧所致的肺动脉高压等血流动力学改变中的作用,我们采用环核苷酸磷酸二脂酶的方法测定了缺氧家兔肺动脉、肺和心肌组织CaM水平,观察了脂质体包裹的CaM拮抗剂三氟啦嗪(TFP)对缺氧动物血流动力学的影响。结果表明:1.缺氧(模拟4000m高原10～11天)家兔肺动脉、肺和心肌组织CaM活性量水平与平原对照值无显著差异,CaM在上述实验条件下改变不甚显著;2.在模拟4000m高原为缺氧家兔注入脂质体包裹的TFP后,Ppa无显著改变,PVR有增高趋势,而观察45分钟末动物肺动脉的CaM活性受到显著抑制,说明缺氧性肺动脉压增高不一定依赖于CaM;3.家兔肺循环和体循环对缺氧反应不同,在模拟4000m高原,脂质体包裹的TFP对缺氧动物的肺、体循环的血流动力学影响也不同,提示;肺循环与体循环血管平滑肌收缩的调节机制不尽一致。     

白念珠菌钙调蛋白定点突变对重组菌株形态与生长的影响

目的 :研究白念珠菌钙调蛋白 (Cm d1)定点突变对重组菌株生长状态的影响。 方法 :以不同的培养温度培养 Cmd1定点突变重组菌株 ,分析其温度敏感性 ,在光镜下观察 Cmd1定点突变后重组菌株形态发生和生长速度的变化。结果 :重组菌株 B(F92 +)和 E(F89+F141+)菌株具有温敏性 ,在适当温度下才能生长 ,而重组 A(F89+)和 C(F141+)菌株无温敏性。光镜观察发现对照组、重组菌株 A和 C细胞芽体呈圆形或椭圆形 ,芽颈较短 ;而 B和 E菌株可见多数为细长的芽体 ,但也可见少许为圆形和椭圆形的芽体。 B和 E菌株培养早期的菌体总数明显少于对照组、A和 C菌株的菌体总数 (P<0 .0 5 )。结论 :Cmd1F92 +和 F89+F141+定点突变导致重组菌株具有温度敏感性 ,并影响了重组菌株细胞形态的正常发生和生长速度     

唑来膦酸对破骨细胞分化中钙调蛋白､钙调磷酸酶表达的影响

目的:探讨唑来膦酸(zoledronate,ZOL)对破骨细胞分化中钙调蛋白(calmodulin)和钙调磷酸酶(calcineurin)基因表达的影响?方法:小鼠RAW264.7细胞分为A?B两组,均用100 ng/mL核因子κB受体激活蛋白配体(RANKL)诱导4 d;B组细胞在RANKL 诱导第2天加入1×10-6 mol/L ZOL处理48 h?RANKL 诱导4 d后收获细胞,检测破骨细胞生成及calmodulin?calcineurin基因表达情况?结果:B组多核破骨细胞数?吸收陷窝数目及面积分别为(8.8 ± 2.3)个?(6.7 ± 1.2)个和(997.1 ± 14.8)μm2,均显著低于A组的(19.7 ± 2.9)个?(13.3 ± 1.5)个和(1 676.9 ± 24.9) μm2(P < 0.01)?B组calmodulin mRNA及蛋白水平较A组分别降低了51.0%和78.7%(P < 0.05),calcineurin则分别下降了37.0%和69.5%(P < 0.01)?免疫荧光细胞化学显示,B组calmodulin?calcineurin的荧光强度较A组也明显下降?结论:ZOL可显著抑制破骨细胞生成,并下调破骨细胞分化中calmodulin和calcineurin的mRNA和蛋白水平,而calmodulin?calcineurin可能参与了ZOL对破骨细胞形成和功能的抑制?     

植物中钙调蛋白拮抗剂的研究

目的：为了加深对植物中的钙调蛋白拮抗剂和蛋白激酶抑制剂的认识、研究和开发。方法：本文综述了国内外对该类化合物的研究情况，植物中的黄酮类、蒽醌类及吖啶类等化合物，对肌球蛋白轻链激酶（ＭＬＣＫ），ｃＡＭＰ依赖性蛋白激酶催化亚基（ｃＡＫ），蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）及Ｃａ依赖性蛋白激酶（ＣＤＰＫ）均有不同程度抑制，揭示了某些药物的作用机理。结果：研究发现，钙调蛋白拮抗剂和蛋白激酶抑制剂存在于多种植物中，并有多种药理作用。结论：认识研究该类物质，有助于植物资源的开发利用。     

钙调蛋白结构及其神经生物学功能的研究进展

Ca2 是细胞内重要的第2信使,对细胞的存活、增殖及其他各个方面的功能有重要的调节作用.Ca2 通过与特异性的Ca2 结合蛋白相互作用而发挥其功能.目前已发现与Ca2 结合的蛋白大概有100多种,而钙调蛋白(calmodulin,CaM)是其中最重要的一种.     

豚鼠钙调蛋白2基因编码区及3′端非编码区序列克隆

目的克隆豚鼠钙调蛋白2(Ca M2)基因编码区及3′端非编码区,为豚鼠Ca M基因功能等研究提供遗传学信息。方法以豚鼠心肌组织作为实验材料提取RNA,通过RT-PCR和3′-RACE PCR的方法扩增Ca M2的编码区和3′端非编码区序列,应用基因工程技术插入克隆载体构建重组质粒后基因测序及分析。结果克隆出豚鼠Ca M2基因编码区450 bp序列和3′端非编码区660 bp序列。分析编码区序列所编码的氨基酸序列与其他种属其他亚型完全一致。而3′端非编码区与其他亚型的同源性较低。结论成功获得了豚鼠Ca M2基因编码区和3′端非编码区序列,为进一步研究Ca M2的基因功能及其在相关疾病中的作用奠定基础。     

人ERGIC3基因稳定表达支气管上皮细胞株的建立与迁移能力

目的 构建含ERGIC3基因真核表达载体,并转染至支气管上皮细胞株BEAS-2B,筛选并建立ERGIC3稳定表达的细胞株,为进一步研究ERGIC3在肺癌中的作用奠定基础.方法 采用RT-PCR方法获取人类ERGIC3基因的ORF框的DNA序列,构建逆转录病毒载体pLXSN-ERGIC3,用PT-67细胞包装后获得病毒颗粒;用病毒颗粒感染BEAS-2B细胞,通过G418筛选获取整合了外源基因ERGIC3的单克隆化细胞;采用定量RT-PCR和Western blot对ERGIC3稳定表达的细胞株进行鉴定,并用划痕实验分析稳定转染细胞株的迁移能力和形态学变化.结果 获得4个ERGIC3稳定表达的BEAS-2B细胞株,ERGIC3的表达量均远高于对照组细胞,分别为对照组细胞的45.3、48.8、41.5和28.2倍,且稳定转染细胞株的迁移能力也显著增强（P＜0.05）,但其形态学没有明显变化.结论 成功构建了含ERGIC3基因真核表达载体pLXSN-ERGIC3;筛选出多个ERGIC3基因稳定转染的BEAS-2B细胞株,且迁移能力明显提高.     

稳定表达野生型p53基因人骨肉瘤细胞株的建立与鉴定

目的建立稳定表达外源性野生型p53基因的人骨肉瘤细胞株(U-2 OS),为进一步研究野生型p53基因在骨肉瘤自杀基因治疗中的协同作用提供体外实验模型建立与鉴定的方法。方法利用分子生物学基因克隆技术将人类野生型p53基因cDNA片段插入到表达载体pIRES-EGFP中,得到重组质粒pIRES-EGFP-p53,并通过PCR、酶切电泳等方法进行质粒鉴定;然后用该重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,转化菌落经PCR扩增后,将提取的质粒DNA用脂质体介导的转染方法导入U-2 OS细胞中,经荧光显微镜下人工筛选得到稳定转染的骨肉瘤细胞系。结果成功地构建出包含有野生型p53 cDNA片段的重组质粒pIRES-EGFP-p53,通过PCR、酶切电泳等方法鉴定质粒大小和位点均符合实验设计;并将该重组质粒成功导入人骨肉瘤细胞株U-2 OS细胞中,经荧光显微镜下人工筛选得到稳定转染的骨肉瘤细胞系,命名为U-2-p53 OS。转染后的骨肉瘤细胞出现散在的凋亡现象。结论利用基因转染技术,建立了稳定表达外源性野生型p53基因的人骨肉瘤U-2-p53 OS细胞系,为进一步研究野生型p53基因在骨肉瘤自杀基因治疗中的协同作用奠定了基础。     

F10基因真核细胞稳定表达系统的构建与鉴定

目的 检测葡萄胎发病新基因F10在人多种细胞系中转录水平的表达,从中选取F10低表达的细胞株,构建F10稳定转染的表达系统,研究F10的功能.方法 荧光定量PCR检测F10在人A549、16HBE、Bel7402、HIC、HepG2、293、PC、MGC细胞株中的表达差异.采用电穿孔介导基因转染技术将已构建的pRc-CMV2-F10、pRc-CMV2转染A549细胞系.经G418筛选获得阳性单克隆细胞.细胞扩大培养后,荧光定量PCR技术鉴定F10基因在阳性克隆细胞中的表达.结果 新基因F10在人的8种细胞系中呈不同程度的表达,其中在Bel7402、PC、MGC中呈高表达,在HepG2、HIC中表达次之,293中表达量较低,16HBE、A549中表达量最低;稳定转染细胞株A549具有F10基因的整合和相应mRNA的高表达.结论 成功构建了稳定表达外源新基因F10的肺癌细胞系,为进一步研究F10基因的生物学功能提供了实验材料.     

人p58.2重组逆转录病毒载体的构建及稳定包装细胞系的鉴定

目的　构建并鉴定携带人p5 8 2基因的重组逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系。方法　用PCR技术从pSPORT1-p5 8 2扩增出编码p5 8 2N端 1～ 3 45个氨基酸的全长基因 ,定向克隆入逆转录病毒载体pMSCVneo中 ,酶切鉴定 ;脂质体法将重组逆转录病毒转入包装细胞系PT67,G418筛选建立稳定产病毒的细胞株。结果　双酶切鉴定 ,成功构建重组逆转录病毒载体 ;重组逆录病毒载体转入包装细胞 ,经G418筛选 ,形成了抗性克隆 ,并测得病毒滴度为 3×10 5cfu/ml,提示构建携带人p5 8 2基因的逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系成功。结论　构建人p5 8 2基因的逆转录病毒载体可行 ,并且可望成为一种很好的对血液系统疾病进行基因治疗的方法     

沉默GPC-3基因质粒构建及对HepG2细胞增殖的抑制作用

目的:构建磷脂酰肌醇蛋白多糖(glypican,GPC)-3 shRNA质粒,观察GPC-3活化干扰对肝癌(HepG2)细胞的抑制作用。方法:设计与合成多条针对GPC-3序列的shRNA,插入pGPU6/GFP/Neo载体,构建、转染HepG2细胞、筛选高效质粒,观察沉默GPC-3表达对肝癌细胞增殖的抑制作用与机制。结果:经BamHⅠ或PstⅠ酶切鉴定,证实插入pGPU6/GFP/Neo载体GPC-3 shRNA序列正确,成功构建GPC-3 shRNA干扰质粒。以脂质体介导,将GPC-3shRNA1～4分别转染HepG2细胞,shRNA1沉默GPC-3 mRNA最高效率达89.3%,可有效抑制HepG2细胞增殖,在72 h达71.1%;shRNA1干扰使HepG2细胞周期阻滞在G1期,促进癌细胞发生凋亡(65.6%)。结论:shRNA可有效干预肝癌细胞GPC-3基因转录,促进凋亡并抑制增殖,GPC-3可望成为肝癌基因治疗的靶目标。     

抑癌基因PTEN真核表达载体的构建及其在人舌鳞癌SCC-4细胞系中的表达

［摘要］ 目的：构建抑癌基因PTEN真核表达载体pEGFP-PTEN,并观察其在人舌鳞癌scc-4细胞系中的表达,为舌鳞癌的基因治疗提供理论依据。方法：提取人HeLa细胞总RNA,采用RT-PCR法获取PTEN全基因,克隆至pMD18-T载体,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后与真核表达载体pEGFP-N1连接,构建pEGFP-PTEN重组质粒。双酶切及测序鉴定后,经脂质体介导转染至体外培养的人舌鳞癌SCC-4细胞系,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在细胞内的表达;Western blotting法检测细胞内PTEN蛋白的表达。结果：pEGFP-PTEN重组质粒双酶切,克隆的目的基因片段约为1 200 bp,测序结果与GenBank上PTEN序列完全一致;荧光显微镜下观察到pEGFP-PTEN在SCC-4细胞系中成功表达;Western blotting结果,转染组PTEN蛋白表达强度为1.07±0.15,与空转染组（0.62±0.11）和未转染组（0.57±0.08）比较差异有统计学意义（P<0.05)。结论：成功构建pEGFP-PTEN重组真核表达载体,该载体能在人舌鳞癌SCC-4细胞系中表达。     

Study on growth cycle and ultrastructure of calmodulin fixed—point yeast mutant

Objective: To study the effects of the fixed-point mutant on growth cycle and ultrastructure of the Calmodulin fixed-point mutant yeast. Methods: Growth cycle and ultrastructure of the Calmodulin fixed-point mutant yeast were studied by using cytometry and scan electron microscope. Results: After culture at 30'C for 36 h, the content of aneuploidy of the temperature-sensitive recombinant yeast monoploid B(F92 ) and E(F89 FH1 ) strains were 63. 87% and 63. 55%, respectively. These were significantly different from control OP<0. 01) ; The content of the non-temperature-sensitive recombinant yeast monoploid A(F89 ) and C(F141 ) strains were 100. 00% and 99. 97% , respectively, which were not significantly different from control value (P>0. 05). Observed by scan electron microscope, the control group, A and C strain's buds were spherical or oval and those bud-necks were fairly shorter; the B and E strain's buds were slender, some cell were abnormal and some buds might show spherical or oval. Conclusion: DN