西生菜中低污染量GⅡ型诺如病毒的富集与定量检测研究

目的优化新鲜西生菜中低污染量的GⅡ型诺如病毒富集方法,比较实时荧光RT-PCR与微滴式数字RT-PCR检测方法,研究适用于新鲜西生菜中低污染量的GⅡ型诺如病毒的定量检测方法。方法选取洗脱液种类、沉淀剂种类、沉淀剂作用温度及沉淀剂作用时间4个因素进行研究,以确定较优的GⅡ型诺如病毒富集条件。结合较优的富集条件,分别采用实时荧光RT-PCR方法和微滴式数字RT-PCR方法进行定量检测。结果病毒富集方法研究表明:洗脱液为牛肉膏-甘氨酸洗脱液、沉淀剂为PEG6000+PEG8000、沉淀剂作用温度为4℃,沉淀剂作用时间为4 h为较优条件,此时富集后的平均病毒浓度最高,平均回收率可达53.43%。实时荧光RT-PCR的检测限为1.44×10~4 copies/g;而微滴式数字RT-PCR的检测限为7.86×10~2 copies/g。结论通过优化西生菜中低污染量的GⅡ诺如病毒富集方法,比较实时荧光RT-PCR方法与微滴式数字RT-PCR方法定量检测病毒的效果,建立了适用于西生菜样品中低污染量GⅡ诺如病毒的定量检测方法。     

GⅡ型诺如病毒微滴式数字RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为了建立快速准确的GⅡ型诺如病毒定量检测方法,本研究将微滴式数字RT-PCR技术应用于GⅡ型诺如病毒检测中,并与实时荧光RT-PCR法进行了比对。微滴式数字RT-PCR反应退火温度的优化实验确定了其最佳退火温度为56℃,实时荧光RT-PCR和微滴式数字RT-PCR两种方法的灵敏度实验对比表明微滴式数字RT-PCR法检测GⅡ型诺如病毒的灵敏度为5.40 copies/μL,其灵敏度高于实时荧光RT-PCR法,重复性实验对比表明两种方法在检测中间浓度的GⅡ型诺如病毒时重复性均较好;人工污染西生菜实验中表明微滴式数字RT-PCR法最低检测限为54.00 copies/μL。本研究建立的GⅡ型诺如病毒的微滴式RT-PCR检测方法,灵敏度高,重复性良好,在人工污染西生菜GⅡ型诺如病毒的检测中表现理想,具有良好的应用前景。     

草莓中诺如病毒和甲肝病毒的多重实时荧光逆转录PCR检测方法的建立

目的建立草莓中诺如病毒GI、诺如病毒GII和甲肝病毒等3种食源性病毒的多重实时荧光RT-PCR检测方法,并应用于实际样品检测。方法对草莓样品进行前处理、病毒富集、病毒RNA提取和纯化后,先采用单重实时荧光RT-PCR进行检测,随后进行多重实时荧光RT-PCR反应条件优化,建立多重实时荧光RT-PCR检测方法并分析其特异性和灵敏度。结果所采用的病毒富集和核酸提取方法可以实现病毒的有效富集和抑制剂的去除,建立的多重实时荧光RT-PCR方法特异性强(100%),对草莓样品中诺如病毒GI、诺如病毒GII和甲肝病毒的检测灵敏度分别为56.2 RT-PCR50/20 g、31.6 RT-PCR50/20 g和31.4 CCID50/20 g。同时对50份样品进行检测,结果均为阴性。结论所建立的检测方法快速、灵敏、特异性强,适用于草莓产品中诺如病毒GI、诺如病毒GII和甲肝病毒的同时检测。     

不同水源中GⅡ型诺如病毒实时荧光逆转录聚合酶链式反应检测方法建立及应用

目的建立不同水源中GⅡ型诺如病毒(NoV GⅡ)实时荧光逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法 ,对某市疾病预防控制中心送检的10份疑似引起诺如病毒中毒的水样进行NoV GⅡ检测。方法以瓶装水、河水和生活污水为研究对象,采用硝酸纤维素膜-聚乙二醇(PEG)沉淀法富集病毒,对取样体积、病毒洗脱条件、PEG终浓度及PEG沉淀条件等进行了优化,提取病毒RNA、建立实时荧光RT-PCR检测方法 ;通过外加MS2计算方法的回收率,评价所建方法对水样中诺如病毒的回收效果。结果建立的方法对瓶装水、河水和生活污水中NoV GⅡ的平均回收率分别为(60.1±8.0)%、(22.0±6.5)%和(35.7±8.1)%,10份送检水样中3份检出NoV GⅡ。结论建立的实时荧光RT-PCR方法适用于瓶装水、河水和生活污水中NoV GⅡ的检测,饮用水被NoV GⅡ是引发某市人员中毒的原因之一。     

秦皇岛市售生菜、草莓中诺如病毒监测分析

目的 调查秦皇岛市诺如病毒污染的高风险食品生菜和草莓中诺如病毒的污染状况。方法 2015年9月至2016年6月采集市售的生菜201份、草莓136份, 利用实时荧光RT-PCR法检测诺如病毒, 在样品中添加Mengo病毒进行过程控制, 并根据Mengo病毒标准曲线计算 诺如病毒回收率。结果 Mengo病毒回收率均达到了ISO/TS 15216-2-2013对 病毒回收率＞1%的要求。同时对201份生菜样品进行检测, 检出诺如病毒阳性标本9份, 总检出率为4.5%, 其中GⅠ型检出率为0.5%(1/201); GⅡ型检出率为3.5%(7/201); GⅠ型和GⅡ型同时检出率为0.5%(1/201)。136份草莓样品中检出阳性标本4份, 总检出率为2.9%, 其中GⅠ型检出率为0.7%(1/136); GⅡ型检出率为2.2%(3/136)。结论 秦皇岛市售蔬菜、浆果中部分存在诺如病毒污染, 诺如病毒检出率在不同采样环节以及时间分布比较差异无统计学意义, 需要进一步加强日常监测。     

实时荧光RT-PCR检测冷冻草莓中诺如病毒

目的：建立冷冻草莓中的GI、GII型诺如病毒实时荧光RT-PCR检测方法,并应用于实际样品的检测。方法：对草莓样品进行前处理、病毒富集、病毒RNA的提取和纯化,然后采用实时荧光RT-PCR进行检测。结果：核酸提取方法能够有效地去除抑制因子,同时对104份送检样品进行检测,结果均为阴性。结论：所建立的核酸提取与实时荧光RT-PCR结合的检测体系适合于草莓样品中诺如病毒GI、GII型的检测。     

微滴式数字PCR检测冷冻草莓中GⅠ、GⅡ型诺如病毒

目的:建立一种检测冷冻草莓中诺如病毒(GⅠ和GⅡ)的逆转录微滴数字PCR (RT-ddPCR)方法。方法:根据ISO标准选定检测引物,优化反应体系,退火温度,进行了方法学实验,建立了一种快速检测冷冻草莓中GⅠ和GⅡ亚型诺如病毒的新方法。结果:确定了数字PCR检测GⅠ型诺如病毒退火温度为56.5℃,GⅡ型诺如病毒退火温度为58.1℃。RT-ddPCR检测GⅠ质粒标准品标准曲线的R²=0.9947,RT-ddPCR检测GⅡ质粒标准品标准曲线的R²=0.9950,说明该方法具有良好的线性关系。与RT-qPCR灵敏度对比,RT-ddPCR法的灵敏度比RT-qPCR法高一个数量级。在检测范围内,最低检测限低至个位拷贝数。RSD最小为3.8%,表明该实验重复性良好。浓度较低100 copies/μL左右时,RT-ddPCR的重复性不佳。结论:本研究建立的诺如病毒数字PCR法具有特异性强、灵敏度高、检测限低等优点,可用于冷冻草莓中诺如病毒的定量检测。     

贝类中诺如病毒SYBR Green I实时定量RT-PCR检测方法研究

将诺如病毒(Norovim8es,NV8)RT-PCR特异产物纯化后与pGEM-T裁体连接并转化至感受态细胞DH5α,经测序鏊定.提取阳性克隆质粒DNA,梯度稀释后作为实时荧光定量PCR的标准质粒.使用SYBRGreen I染料建立检测贝类中NV8的实时荧光定量RT-PCR方法.结果表明,本方法标准曲线线性范围可达6个数量级(108～103拷贝),R2为O.9983,比常规RT-PCR方法敏感100倍,且特异性良好,与贝类中的轮状病毒、甲肝病毒均不反应;批内和批间重复性良好,变异系数(CV)分剐在0.28%～4.03%和1.47%～5.53%范围.该方法具有简便、敏感、高效、稳定等优点,可用于水产品中NV8的定量检测.     

猪胃黏蛋白偶联磁珠和聚乙二醇富集检测青葱和葡萄中诺如病毒的比较研究

目的:以青葱与葡萄为材料,建立以猪胃黏蛋白偶联磁珠(PGM-MB)和聚乙二醇8000(PEG8000)富集检测水果、蔬菜中诺如病毒的方法。方法:确定病毒原液中的相对病毒量,梯度稀释病毒原液并进行实时荧光-聚合酶链式反应检测,以每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数值与病毒量(实时荧光-聚合酶链式反应单位数)的常用对数值绘制标准曲线和线性方程;人工接种诺如病毒于青葱与葡萄表面,洗脱后,分别用PEG8000和PGM-MB富集诺如病毒,实时荧光-聚合酶链式反应扩增,用标准曲线对回收的病毒进行相对定量。结果:基质为青葱时,高接种量条件下,两种富集方法的病毒回收效果相当,低接种量下,PGM-MB法的富集回收率高于PEG8000法,且PGM-MB的检测下限更低;基质为葡萄时,PGM-MB法的富集回收率均高于PEG8000法,且检测下限更低。结论:PGM-MB富集效果良好,快速方便,适合应用于水果和蔬菜中的诺如病毒的富集检测。     

荧光定量PCR与常规PCR法检测GⅡ型札幌样病毒的比较

目的比较荧光定量PCR与常规RT-PCR法检测牡蛎中GⅡ型札幌样病毒的灵敏度与准确性,为该病毒检测提供适用的方法。方法采用荧光定量PCR和RT-PCR方法,分别检测牡蛎样品中的GⅡ型札幌样病毒。结果荧光定量PCR检测的灵敏度可达102拷贝/μl,札幌样病毒呈阳性的牡蛎有6例,阳性率为4.72%(6/127);RT-PCR的灵敏度为103拷贝/μl,札幌样病毒呈阳性的牡蛎有1例,阳性率为0.79%(1/127)。结论与RT-PCR方法比较,荧光定量PCR是更为敏感准确的方法,更适用于牡蛎中GⅡ型札幌样病毒的检测。     

GⅠ/GⅡ型诺如病毒两联装甲RNA标准样品的研制

针对目前缺乏适配多项检测标准、稳定、安全的诺如病毒RNA标准样品的问题,研制基于MS2噬菌体内含常见GⅠ/GⅡ型诺如病毒检测靶标两联装甲RNA标准参考样品。人工合成MS2噬菌体成熟酶基因、衣壳蛋白基因、包装位点及GⅠ/GⅡ型诺如病毒靶标基因,克隆于表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒p ET-MS2-NoV。经大肠杆菌BL21诱导表达,先后利用PEG6000、酶处理和丙烯葡聚糖凝胶层析柱纯化表达产物。SDS-PAGE和透射电镜鉴定产物大小及结构,荧光定量PCR检测有无残留核酸。之后对纯化的病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)开展定值、均匀性和短期稳定性研究。SDS-PAGE结果表明重组质粒在BL21中表达出了目的蛋白,大小在10~15ku之间,与预期一致;纯化后的VLPs无杂蛋白和残留核酸;透射电镜下呈结构完整、大小均一的球状,直径约25 nm。纯化后AR-NoV中GⅠ型和GⅡ型靶标定值结果分别为(4.04±0.62)×10⁷ copies/μL和(6.16±0.30)×10⁷ copies/μL。单因素方差检验证实样品均一性良好,F相似文献   

食品中诺如病毒流行现状及其病毒分离方法的研究进展

食品基质是食源性病毒传播的主要媒介,其中诺如病毒(Norovirus,NoV)的检测也备受国内外关注。食源性NoV暴发和污染给人类健康和食品安全造成了极大的威胁。而基于食品基质成分的复杂程度,其样本前处理过程一直是病毒检测研究中的重点和难点,直接影响NoV的精准检测和结果的可靠性,给食品安全监管及疫情防控带来困难。本文综述了NoV在食品中的流行现状,为食源性NoV的风险评估和监管预警提供基础性研究数据。在查阅文献的基础上,就食品中NoV的分离方法进行了全面论述,比较了各个方法的优缺点,旨在为完善和扩充食品中NoV检测基质范围提供方法,为研究简便、快捷、准确的食源性NoV检测方法提供参考和思路,以防范NoV造成的污染及感染事件发生。     

福建省养殖环节牡蛎中诺如病毒污染状况分析

目的 了解福建省养殖环节牡蛎中诺如病毒(Norovirus)污染状况及基因分型,进一步定量分析诺如病毒污染水平,为食品中诺如病毒污染监测及安全风险评估提供数据支持.方法 2017年8月—2018年9月,于福建省某养殖基地采集牡蛎样品共244份,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法对样品中诺如病毒进行检测,确定其污...     

荧光定量PCR与常规PCR法检测GⅡ型扎幌样病毒的比较

目的 比较荧光定量PCR、常规RT－PCR法检测牡蛎中GⅡ型扎幌样病毒的灵敏度与准确性,为该病毒检测提供适用的方法。方法 采用荧光定量PCR、常规RT－PCR这 2种方法,对牡蛎样品中的GⅡ型扎幌样病毒进行检测。结果 荧光定量PCR检测的灵敏度可达102拷贝/祃,检测扎幌样病毒呈阳性的牡蛎有6例,阳性率为4.72%(6/127),常规RT－PCR的灵敏度为103 拷贝/祃,检测扎幌样病毒呈阳性的牡蛎有1例,阳性率为0.79%(1/127)。结论 荧光定量PCR是2种方法中更为敏感准确的方法,更适用于牡蛎中GⅡ型扎幌样病毒的检测。     

超高压处理对牡蛎中GII.4型诺如病毒的消减控制

诺如病毒（NoVs）是世界范围内引起非细菌性胃肠炎的主要病原体。为研究不同压力条件的超高压处理对牡蛎中NoVs消减控制的影响,将GⅡ.4型NoVs分别置于牡蛎消化腺匀浆和PBS缓冲液中,采用压力分别为200,300,400,500MPa,加压初始温度5℃,保压时间5 min进行处理,并以常压（0.1 MPa）处理为对照组。采用PMAxx-RT-qPCR与透射电子显微镜检测超高压处理后的NoVs,评价不同压力对牡蛎消化腺匀浆和PBS缓冲液中GⅡ.4型NoVs的消减效果;测定超高压处理后牡蛎丙二醛含量和蛋白质巯基含量,评价超高压处理对牡蛎中脂肪和蛋白质的影响。研究结果显示：PMAxx可有效区分感染性NoVs;qPCR检测发现经不同压力的超高压处理后,牡蛎消化腺匀浆和缓冲液中NoVs的RNA拷贝数均显著减少,当压力为500 MPa时,牡蛎和缓冲液中的RNA拷贝数减少量分别>3.49 lg(copies/μL)和>3.61 lg(copies/μL),均降至检测限以下;超高压处理对PBS缓冲液中NoVs的消减效果优于牡蛎消化腺匀浆,还可使牡蛎中脂肪氧化和蛋白质变性,然而,改变程度小...