醛糖还原酶基因敲除促进视神经损伤后巨噬细胞向M2方向极化并促进视神经功能恢复

目的观察小鼠视神经夹伤(ONC)后醛糖还原酶(AR)对视神经损伤后功能恢复的影响及可能机制。方法分别采用C57BL/6-AR+/+(B6野生型)、C57BL/6-AR-/-(AR基因敲除)、Thy1-YFP/AR+/+和Thy1-YFP/AR-/-小鼠,建立ONC模型。行视觉电生理F-VEP检查,观察ONC后AR基因敲除对小鼠视神经转导功能的影响;通过视网膜组织冰冻切片,观察AR基因敲除对Thy1-YFP转基因小鼠ONC后存活视网膜神经节细胞数目的影响;玻璃体内注射Alexa Fluor488标记的霍乱毒素B(CTB)顺行标记,观察AR基因敲除对小鼠ONC后神经纤维生长的影响;Western blot法检测野生型小鼠ONC后AR基因的表达变化,及AR基因敲除对M1、M2型巨噬细胞特异性分子诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶1(Arg1)表达的影响。结果AR基因敲除可促进小鼠ONC后视神经转导功能的恢复,增加存活的视神经节细胞数量;AR基因敲除可促进小鼠ONC后视神经纤维生长;AR基因敲除可促使小鼠ONC后巨噬细胞向M2方向极化。结论 AR可能通过调节视神经损伤后巨噬细胞极化影响视神经功能恢复。     

醛糖还原酶在小鼠损伤脊髓小胶质/巨噬细胞中的表达及其作用

目的:观察小鼠在脊髓损伤(SCI)后,醛糖还原酶(AR)在脊髓损伤后修复过程中的作用及可能的机制。方法:采用C57BL/6-ar+/+(B6野生型小鼠)和C57BL/6-ar-/-(B6-AR基因敲除)小鼠,建立脊髓重度夹伤模型。首先分析了AR分子在损伤脊髓中的细胞表达类型及脊髓损伤后AR分子mRNA的表达水平变化情况;通过BBB运动学分析,比较AR基因敲除小鼠和野生型小鼠脊髓损伤后运动功能恢复情况,对比损伤区面积变化;通过qRT-PCR方法,检测对比M1/M2型巨噬细胞特异分子iNOS和Arg I的表达变化。结果:AR分子在野生型小鼠损伤脊髓中的小胶质/巨噬细胞中高表达;qRT-PCR研究发现:脊髓损伤后AR表达逐渐升高,在损伤后第3天达到高峰。AR敲除小鼠在脊髓损伤后,其运动功能恢复好于野生型小鼠(P<0.05),同时损伤区面积也小于对照组。AR基因缺失后,损伤脊髓中的小胶质/巨噬细胞通过高表达Arg I向M2型巨噬细胞方向极化。结论:AR通过调节脊髓中小胶质/巨噬细胞的极化来影响脊髓损伤后的修复。     

糖尿病早期大鼠视网膜视细胞超微结构改变与醛糖还原酶的相关性及氨基胍的保护作用

目的 :探讨糖尿病早期大鼠视网膜视细胞超微结构改变与醛糖还原酶 (Aldosereductase ,AR)含量变化的相关性及氨基胍 (Aminoguanidine,AG)的保护作用。方法 :选择健康成年雄性SD大鼠 ,随机分成正常对照组、糖尿病组和糖尿病AG治疗组。一次性腹腔注射链脲佐菌素 (Streptozotin ,STZ)诱发糖尿病模型 ,分别于第 3 0天和第 90天测定视网膜组织AR含量 ;并在第 90天时取视网膜行透射电镜观察视细胞超微结构。结果 :糖尿病早期大鼠视网膜AR含量随糖尿病时间的增长而增多 ;糖尿病 90天大鼠视网膜的视细胞外节膜盘排列紊乱 ,间隙扩大 ,内节线粒体水肿 ,有的空泡化 ;AG治疗组大鼠视网膜AR含量明显低于糖尿病未治疗组 ,糖尿病 90天大鼠视网膜视细胞外节膜盘少量排列紊乱 ,内节线粒体正常。结论 :糖尿病早期视网膜视细胞超微结构改变与AR含量变化有关 ,AG可通过抑制AR活性而保护视细胞     

醛糖还原酶AKR1B1对大鼠视网膜神经节细胞损伤的保护作用

目的:检测醛糖还原酶AKR1B1在介导大鼠视神经损伤调控视网膜神经节细胞(RGC)活性中的功能及机制。方法:建立大鼠视神经夹伤(ONC)模型并分离视网膜组织,通过real time RT-PCR实验检测视网膜组织中AKR1B1和E2相关因子(Nrf2) mRNA的表达;原代培养RGC,分别给予AKR1B1-siRNA或抑制剂作用于H₂O₂处理的RGC,通过免疫荧光染色检测RGC中Brn-3a的表达;通过TUNEL染色检测RGC的凋亡;分别通过Western Blot和real time RT-PCR实验检测Nrf2的蛋白和mRNA表达。结果:大鼠视神经夹伤后视网膜组织中AKR1B1表达升高,Nrf2表达降低;抑制AKR1B1可恢复RGC活力并抑制细胞凋亡;抑制AKR1B1后Nrf2表达增加。结论:大鼠在视神经损伤过程中抑制AKR1B1可增加RGC活力并抑制其凋亡,其机制与抑制Nrf2表达有关。     

醛糖还原酶基因敲除对小鼠脊髓损伤的保护作用及机制研究

目的:研究醛糖还原酶(AR)在小鼠脊髓损伤(SCI)的作用及分子机制。方法:利用野生型(WT)小鼠和AR敲除(AR KO)小鼠,制备小鼠脊髓钳夹伤模型,通过BMS评分对比观察损伤后两种小鼠在不同时间点(3、7、14和28 d)的运动功能恢复情况;采用免疫荧光染色观察小胶质细胞活化状态和损伤面积恢复程度;利用试剂盒和Western Blot检测损伤后小鼠脊髓组织中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、磷酸化核因子-κB(NF-κB)家族p65、4-羟基壬烯醛(4-HNE)和活性氧(ROS)的表达。通过体外培养来源于小鼠小胶质细胞系BV2,给予脂多糖(LPS)及4-HNE联合刺激,利用免疫荧光染色观察BV2细胞极化状态,Western Blot检测iNOS和p-p65蛋白表达水平。结果:与WT小鼠相比,AR基因敲除促进小鼠脊髓损伤后的运动功能恢复,损伤区面积显著减小,并且抑制小鼠脊髓损伤区小胶质细胞活化,NF-κB信号通路相关炎性分子iNOS表达水平明显下调。WT小鼠和AR KO小鼠在脊髓损伤后ROS、4-HNE的含量逐渐上升,在损伤后7 d表达较高,并且具有相似的表达变化模式。LPS联合4-H...     

醛糖还原酶的研究进展

醛糖还原酶(AR)是糖代谢多元醇通路中的限速酶,除了将葡萄糖催化还原为山梨醇外,还可以催化还原大量脂质过氧化反应产生的醛及其衍生物。最近的研究显示,AR除在糖尿病并发症中发挥作用外,还在很多炎性疾病中发挥着重要作用,如动脉粥样硬化、脓毒症、哮喘、眼葡萄膜炎等。在发生炎症时,AR的存在可以促进促炎性因子如iNOS、CD86等的表达,进一步集中炎症反应。同时,也调节着组织损伤后,免疫系统的作用发挥。此外,AR在人类的肿瘤中如肺癌、结肠癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌中过度表达,提示在上述癌症的病理过程中,AR可能发挥作用。AR抑制剂(ARI)对糖尿病并发症的临床治疗,已经进入了3期实验,显示AR作为某些炎性疾病的治疗靶点,具有良好的应用前景。因此,本文对近年来AR的功能研究进展进行综述,并对其作为疾病治疗靶点的前景进行了展望。     

醛糖还原酶:心肌缺血损伤干预的新靶点

醛糖还原酶是糖代谢多元醇通路的限速酶。最新研究表明：心肌缺血时醛糖还原酶活性增强，抑制醛糖还原酶可以通过保护糖酵解途径和抑制氧化应激，减轻心肌缺血损伤，改善缺血再灌注后心肌功能。醛糖还原酶抑制剂作为潜在的治疗心肌梗死的有效措施引起了研究者的关注。     

抗醛糖还原酶单克隆抗体的制备与特性鉴定

目的:制备抗醛糖还原酶(AR)的单克隆抗体(mAb),并与本室制备的抗醛糖还原酶相似蛋白(ARL-1)mAb进行比较。方法:经RT-PCR获得AR基因,将基因插入pGEX-4T-1(His)6C中,构建重组质粒pGEX-4T-1(His)6C-AR,以重组质粒转化E.coliRosetta诱导表达GST-AR蛋白。以纯化的GST-AR蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb。应用间接ELISA和Western blot方法对mAb进行筛选和鉴定。使用Clustalx和Antheprot软件,比较AR与ARL-1的同源性,表达GST-dAR[80~142氨基酸(aa)],与ARL-1差异较大;并分析AR的抗原性,表达GST-dA1(1~79aa)、GST-dA2(80~99aa)、GST-dA3(111~142aa)、GST-dA4(143~316aa)。利用AR全长及截短蛋白,采用Western blot分析制备的抗AR mAb识别AR抗原的部位。结果:获得3株稳定分泌抗AR mAb的杂交瘤细胞系ARB3、AR7B3G4和ARF10。3株抗GST-AR的mAb均为IgG1(κ型),腹水mAb效价为1∶4×105,细胞培养上清mAb效价为1∶1×104,3株mAb均可与胎盘组织中的AR蛋白起反应,而与GST-ARL-1和GST蛋白无交叉反应。它们分别为抗GST-dA1、GST-dA3和GST-dA4蛋白的mAb。结论:成功地制备了3株特异性抗AR mAb,可分别识别AR的1~79、111~142、143~316位氨基酸。将它们与抗ARL-1mAb联合应用,将有助于进一步研究AR与ARL-1蛋白的功能,并为深入探讨AR、ARL-1与相关疾病的关系及进行大规模的流行病学调查提供了有力的工具。     

醛糖还原酶在神经系统疾病中的作用研究进展

醛糖还原酶(AR)是多元醇途径中的一种关键酶,其作用为将糖转化成多元醇。此反应过程带来烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的转变对细胞内氧化还原反应以及炎性反应都可产生直接的影响。AR在神经系统疾病中的作用日益受到关注。本文对新近发表的有关文献进行综述,分析归纳了AR在糖尿病相关神经疾病、缺血缺氧性神经疾病、神经退行性疾病以及神经损伤中作用的研究报道,对AR可能成为神经系统疾病的治疗靶点进行分析,为相关神经系统疾病的诊疗提供新的思路。     

外伤性视神经损伤后视神经及视网膜形态的动态观察

目的:了解外伤性视神经损伤后的病理变化、溃变特点与时相间的关系。方法:参照Allen脊髓损伤法,造成视神经眶尖段间接600gcm力冲击、挤压伤。伤后对视神经和视网膜行形态学动态观察。结果:①伤后48h,视神经轻度肿胀和空泡反应;1周时损伤处视神经出现溃变,神经胶质细胞增生,视网膜神经节细胞(retinalganglioncells,RGCs)形态改变不明显;2周时神经纤维轴束间空泡样改变,局灶性坏死,RGCs核固缩和细胞数量减少。术后3月,视神经损伤部位直径缩小,形成胶质疤痕,RGCs数量明显减少,核固缩细胞增多。②RGCs数量于术后48h、1周、2周、1月和3月分别比正常对照组低3.35%、13.23%、19.74%、23.20%、29.28%。③视网膜细胞在48h内出现凋亡。结论:本实验模型可造成明确的视神经和视网膜损伤,神经元的损伤程度从节细胞、中间神经元、感光细胞的次序依次递减。视网膜和视神经损伤的严重程度与时间呈相关性。RGCs数量在48h至1周时下降速率最快。     

醛糖还原酶基因研究进展

醛糖还原酶 (AR)是多元醇通路的限速酶 ,此酶的激活被认为与糖尿病慢性并发症有关。人类AR基因是定位于染色体 7q3 5,其调控区具有一个TATA盒、一个CCAAT盒、三个Sp1结合元件、一个GC富含序列和一个GA富含区。该基因转录起始点上游还存在一个高度多态性的微卫星DNA标记———(AC)n串联重复序列和几个与高渗表达增加直接相关的渗透应答元件。对AR基因及其调控区的研究有助于阐明此酶激活及糖尿病慢性并发症发生的机理。     

醛糖还原酶通过cAMP反应元件结合蛋白通路调控小胶质细胞向M2型极化

目的探讨醛糖还原酶(AR)调控小胶质细胞极化的机制。方法体外培养BV2小胶质细胞,给予醛糖还原酶抑制剂(ARI),通过免疫组织化学染色和酶标仪检测荧光强度的方法检测细胞4-羟基反式-2-壬烯酸(HNE)表达;体外培养N9小胶质细胞,分别用脂多糖(LPS)、HNE、醛糖还原酶抑制剂fidarestat(ARI)及其组合刺激后,利用Western blot法检测在不同刺激条件下N9细胞调控细胞极化和极化相关蛋白的变化;在上述刺激的条件下,联合应用cAMP反应元件结合蛋白(CREB)抑制剂KG-501,利用Western blot法检测极化相关蛋白的变化。结果阻断AR后使HNE在BV2细胞内堆积;Western blot法检测发现ARI通过增加磷酸化CREB的表达来调控N9细胞向M2型极化;应用CREB抑制剂后,能阻断上述过程。结论阻断AR可以使CREB的表达上调进而促进小胶质细胞向M2型极化。     

白藜芦醇对糖尿病肾病大鼠醛糖还原酶的影响

目的:观察白藜芦醇对糖尿病肾病大鼠醛糖还原酶的影响。方法:将48只雄性SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、白藜芦醇低、中、高剂量组和依帕司他组(n=8)。除正常对照组外,其余各组大鼠腹腔注射STZ(55 mg.kg-1),成功造模后白藜芦醇组分别给予5、154、5 mg.kg-1白藜芦醇,依帕司他组给予10 mg.kg-1依帕司他,连续灌胃6 w后,检测大鼠血糖、体重,HE染色检测肾脏病理改变,ELISA法检测醛糖还原酶(AR)活性。结果:与正常对照组相比,糖尿病组血糖与AR活性明显升高(P<0.05),与模型组比较,白藜芦醇各组血糖与AR活性明显降低(P<0.05)。结论:白藜芦醇可降低糖尿病大鼠血糖,其降糖效应可能与抑制AR活性有关。     

TGF-β1对醛糖还原酶在大鼠系膜细胞及Thy-1肾炎中表达的影响

目的　研究转化生长因子β1(TGF- β1)对醛糖还原酶(AR)在大鼠系膜细胞(MsC)及大鼠抗Thy 1肾小球肾炎模型 (ATG)中表达的影响。方法　采用RT PCR和Westernblot技术分别检测TGF β1刺激后体外培养大鼠系膜细胞AR的表达以 及TGF -β1和AR在ATG中的表达;应用免疫组化检测ATG中TGF -β1、AR的表达,并对染色强度进行图像分析。结果　外源 性TGF- β1作用后,大鼠系膜细胞中AR表达升高,并显示出一定的时间与剂量依赖性。ATG中,随着病程的延长,TGF -β1、AR 表达升高,对免疫组化结果进行图像分析显示,二者表达之间具有相关性(r=0.65,P<0.05)。结论　TGF -β1可以上调其相 关反应性基因AR的表达,后者可能参与了肾小球肾炎发生发展的过程。     

醛糖还原酶在非糖尿病疾病发生发展中作用

醛糖还原酶(aldose reductase,AR)属于醛-酮还原酶超家族成员,种类多且组织分布广,具有极广泛的底物[1]。AR是多元醇通路的限速酶,以NADPH为辅酶,将葡萄糖还原为山梨醇,继而在山梨醇脱氢酶(SDH)作用下,进一步将其氧化为果糖。在糖尿病(diabetes mellitus,DM)高血糖条件下,AR以及多元醇通路被激活,引起山梨醇蓄积于多种组织中,如晶状体、血管、神经及肾脏等,可引起相应的症状[2]。基于糖尿病实验动物模型基础上的广泛研究已证实:醛糖还原酶介导的多元醇糖代谢通路与糖尿病慢性并发症的发生和病变发展密切相关[3～5],AR活性增强是其主…     

醛糖还原酶对大鼠肾脏系膜细胞表达纤连蛋白和Ⅳ型胶原蛋白的影响

目的探讨醛糖还原酶(AR)对大鼠肾脏系膜细胞(MsC)表达细胞外基质成分纤连蛋白(FN)和Ⅳ型胶原(ColⅣ)蛋白的影响,以及AR在肾小球硬化病变过程中的可能作用及其机制。方法采用酶切、连接方法构建真核表达质粒pCDNA3-AR,采用脂质体介导以及G418筛选的方法,将pCDNA3-AR稳定转染至MsC中,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western印迹法和免疫荧光检测转染MsC表达AR情况;以Western印迹法检测正常MsC、AR转基因MsC、应用AR抑制剂Sorbinil和Zopolrestat的正常MsC、转化生长因子-β1(TGF-β1)作用后的正常MsC的FN和ColⅣ蛋白表达情况。结果与正常MsC相比,TGFβ1作用后的正常MsCFN和ColⅣ蛋白表达水平分别增高1.6和1.7倍(P<0.01);AR转基因MsC的FN、ColⅣ表达分别增加1.8倍和1.5倍;应用Sorbinil时,FN和ColⅣ分别降低1.8倍和1.4倍(P<0.05);应用Zopolrestat时,FN和ColⅣ分别降低1.7倍和1.4倍(P<0.05)。结论AR高表达或活性受抑制时可以明显影响MsCFN、ColⅣ的蛋白表达,提示AR可能与肾小球硬化的病理过程有关。     

过表达醛酮还原酶AKR7A1对巴豆醛致畸作用的影响

目的:探讨过表达大鼠醛酮还原酶AKR7A1蛋白对巴豆醛致畸作用的影响。方法:使用Western blot法和醛酮还原酶(AKR)酶活性技术检测并鉴定外源性AKR7A1在V79-4细胞中的表达水平和催化活性,使用HGPRT基因突变实验检测在V79-4细胞中过表达AKR7A1对巴豆醛致畸作用的影响。结果:Western blot检测显示V79-4细胞中表达高水平的AKR7A1蛋白;AKR酶活性实验结果显示过表达的AKR7A1蛋白具有催化活性;HGPRT基因突变实验结果显示过表达AKR7A1的V79-4细胞对巴豆醛致畸作用的抵抗力明显高于对照细胞。结论:过表达大鼠AKR7A1能显著提高V79-4细胞对巴豆醛致畸作用的抵抗力。     

血管内皮生长因子和醛糖还原酶对糖尿病大鼠股骨头结构和微血管形态的影响

目的 观察糖尿病大鼠股骨头微血管分布及形态上的变化.探讨糖尿病大鼠股骨头组织血管内皮生长因子(VEGF)mBNA在不同时间表达的差异以及醛糖还原酶(AR)活性变化对股骨头组织结构演变、微血管病变的影响. 方法 建立速发型链脲佐菌素(STZ)糖尿病大鼠模型,随机分为正常5周组(CON1)、10周组(CON2)及15周组(CON3),糖尿病5周组(DM1)、10周组(DM2)及15周组(DM3),每组10只.光镜下观察各组股骨头结构以及凝血因子Ⅷ免疫组织化学表达情况;墨汁灌注行微血管密度测定;观察VEGF mRNA原位杂交表达强度并分析;生化检测各组股骨头组织匀浆的AR活性. 结果 糖尿病大鼠股骨头随病程发展骨小梁变少变薄,骨髓腔增大;凝血因子Ⅷ因子表达上升,微血管密度增大;VEGF mRNA在骨髓腔血管内皮细胞表达上升,AR活性增大(P<0.05). 结论 糖尿病大鼠股骨头出现骨质疏松变化倾向,与VEGF mBNA促进微血管增生、血管通道性增大及AR活性增强密切相关.     

定量大鼠视神经损伤模型的建立

目的：建立大鼠定量视神经损伤模型，介绍其制作方法。 方法： 健康Wistar大鼠90只，15只为正常组，只进行3%荧光金逆行标记视网膜神经节细胞，以对比正常大鼠左、右眼视网膜神经节细胞数量；另75只大鼠，其中左眼为损伤眼，右眼为未损伤眼，作为对照组，按损伤后存活时间不同分为1 d组、3 d组、7 d组、15 d组、30 d组，每组15只。应用40 g力的视神经夹在大鼠眼球后2 mm处夹视神经9 s,于处死前7 d采用双上丘注射3%荧光金标记双眼视网膜神经节细胞。取眼球标本并分离视神经至视交叉。视网膜铺片做荧光照相，并输入计算机图像分析仪计数视网膜神经节细胞。将视神经沿其长轴做切片在光镜下观察。 结果： 手术获取完整的大鼠眼球，并分离视神经至视交叉。视网膜神经节细胞计数，损伤组与对照组进行比较。正常组中，左眼195.76±36.12，右眼197.52±39.25，两者差异无显著（P＞0.05）；伤后1 d左眼165.12±26.36，右眼191.21±35.26，两者差异显著（P<0.01）；伤后3 d左眼152.26±25.12，右眼192.16±32.12, 两者差异显著（P<0.01）；伤后7 d左眼135.19±21.32,右眼189.26±26.16, 两者差异显著（P<0.01）；伤后15 d左眼123.96±27.19,右眼191.76±25.29, 两者差异显著（P<0.01）；伤后30 d左眼105.75±22.26,右眼186.56±23.76, 两者差异显著（P<0.01）。损伤眼视神经损伤后不同时间RGCs计数逐渐下降（P<0.01）；损伤处视神经肿胀、出血,胶质细胞排列紊乱,空泡样变性，随损伤后时间延长而加重。 结论： 应用40 g力视神经夹建立的定量视神经损伤动物模型是可行的,并可应用于视神经损伤修复的研究中,完整标本的获取需要较为熟练的手术技巧。     

PKC信号通路与醛糖还原酶对转化生长因子β1诱导人肾系膜细胞纤连蛋白表达的影响

目的 探讨PKC信号通路与醛糖还原酶在非高糖条件下对转化生长因子(TGF)-β1诱导人肾系膜细胞(HMC)细胞外基质成分纤连蛋白表达的影响.方法 应用醛糖还原酶抑制剂、PKC信号通路抑制剂G(O)6983、转染pcDNA3-醛糖还原酶及siRNA分别作用于人系膜细胞后,再用TGF-β1刺激,观察刺激前后人系膜细胞表达纤连蛋白的情况.Western blot检测系膜细胞内纤连蛋白和醛糖还原酶的变化,即时RT-PCR鉴定转染和干扰效果.结果 系膜细胞在TGF-β1作用后,醛糖还原酶和纤连蛋白表达升高;单独使用醛糖还原酶抑制剂并不能下调纤连蛋白的表达;但预先使用醛糖还原酶抑制剂孵育后,再用TGF-β1刺激,纤连蛋白表达减少为对照组的34%(P<0.05).单独使用PKC信号通路抑制剂并不能下调纤连蛋白的表达;用PKC信号通路抑制剂后,再用TGF-β1刺激,纤连蛋白表达下降为对照组的42%(P<0.05).预先使用醛糖还原酶抑制剂、PKC抑制剂孵育细胞后,再用TGF-β1刺激,纤连蛋白表达下降;转染pcDNA3-醛糖还原酶后,系膜细胞中醛糖还原酶mRNA表达增多超过10倍,纤连蛋白表达增加了2.5倍(P<0.05),再用TGF-β1刺激,纤连蛋白表达增加了3.6倍(P<0.05);转染siRNA后,系膜细胞中醛糖还原酶mRNA表达减少为对照组的20%,纤连蛋白表达减少为对照组的6%(P<0.01),即使再用TGF-β1刺激,纤连蛋白表达仍然下降,为对照组的12%(P<0.01).结论 醛糖还原酶基因参与了系膜细胞中TGF-β1诱导纤连蛋白表达过程的调控,这一过程可能与PKC信号通路的活化有关.