维管特异启动子BSP驱动的基因Chi、Glu双价载体构建

几丁质和β-1,3-葡聚糖是绝大多数真菌细胞壁的主要成份,可分别被几丁质酶(Chitinase,Chi)和β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase,Glu)降解,而且它们具有协同抗真菌的作用,几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶存在于大多数植物细胞中。在正常情况下,植物体内的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶只有低水平的组成型表达,但在病原菌侵染、诱导物刺激及各种伤害下可诱导产生大量的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶。而真菌病害是危害植物的主要病害之一,这些病害主要通过韧皮部运输而进一步扩展到其他部位。如果利用维管特异表达启动子调节目的基因在韧皮部高效特异地表达,就可以更为有效地发挥目的基因的作用。为此,克隆了维管特异BSP启动子和Chi、Glu基因,并构建了以BSP驱动的Chi和Glu基因的双价表达载体pBIBCG。重组质粒pBIBCG经过PCR分析鉴定,结果表明,以维管特异启动子BSP驱动的含有双价抗真菌基因的植物重组表达载体已构建成功,为植物抗真菌基因工程育种奠定了基础,对提高植物的整体抗病性具有重要的作用。     

一个棉花β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA的克隆与特征分析

利用本实验室分离的防卫基因类似物片段,通过5’和3’RACE,从海岛棉海7124中克隆了一个β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA,命名为GbGLU。其全长1 266 bp,含一个编码361个氨基酸残基的开放阅读框。该基因编码产物理论分子量和等电点为MW = 39.66 kD,pI = 9.15,含有糖基水解酶家族17的保守结构域,N端有26个氨基酸残基组成的信号肽。Southern结果显示,GbGLU在棉花基因组中以单拷贝形式存在,研究发现,GbGLU的表达受黄萎病菌的诱导。聚类分析表明,棉花葡聚糖酶基因可分为3类,分别含有糖基水解酶家族3、9、17的保守结构域。无论棉花中的还是本研究中参考的其他作物中,受病菌诱导的葡聚糖酶基因都含有糖基水解酶家族17的保守结构域,故推断其为此类基因参与抗病反应的功能域。     

黄瓜苯丙氨酸解氨酶基因CsPAL的克隆及响应白粉菌侵染的表达分析

为了分析苯丙氨酸解氨酶基因(CsPAL)在黄瓜侵染白粉菌中的转录应答响应,对CsPAL基因(GenBank No.JN 675927)及其启动子进行了克隆与序列分析,再利用qRT-PCR技术分析了该基因在黄瓜高抗白粉病品种‘Jin5-508’接种白粉菌后不同时间的相对表达量。结果表明:CsPAL基因全长2 142 bp,编码713个氨基酸;推测CsPAL蛋白存在于细胞质中;系统发育进化树分析发现与拟南芥基因进化距离较近;启动子克隆及序列分析显示该基因能够响应真菌的侵染;组织特异性表达发现CsPAL在在叶片中的表达量最高;qRTPCR结果表明‘:Jin5-508’叶片在接菌16 h内,CsPAL基因的相对表达量于对照间无显著差异;接菌16 h后,CsPAL基因表达量迅速上升,显著高于对照,并在24 h达到最大值;接菌48 h后,CsPAL基因的表达量逐渐下降,但在96 h内仍显著高于相应对照的表达量。综上所述,黄瓜CsPAL基因为白粉菌侵染响应基因,可能与黄瓜对白粉病的抗性具有一定的相关性。     

甘蔗葡聚糖酶ScBG1基因的电子克隆及序列分析

为了揭示甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的结构特点和功能特性,从而为该基因的研究和应用提供基础。本研究以水稻β-1,3-葡聚糖酶基因(U72255.1)为搜寻探针,运用电子克隆技术,获得一条甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA,命名为ScBG1,并对其进行生物信息学分析。结果表明：该基因的cDNA序列全长为1842 bp,包含一个1488 bp完整的开放读码框,编码495个氨基酸残基,属于糖基水解酶第十七家族,为疏水性蛋白,含有信号肽。将ScBG1与其他植物种的β-1,3-葡聚糖酶基因进行序列比对,发现该基因具有保守和典型的葡聚糖酶结构域,碱基序列的保守性为45%~73%。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础,也为甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的分子功能研究提供参考。     

苹果树腐烂病菌β-葡萄糖苷酶基因的克隆及表达分析

为探究苹果树腐烂病菌β-葡萄糖苷酶基因VmGluI的序列特征及其在病菌侵染致病过程中的表达,以强致病力菌株LXS080601为材料,利用RT-PCR技术克隆基因c DNA序列,通过生物信息学软件对VmGluI编码蛋白的系统进化关系、理化性质和二级结构进行分析,采用实时荧光定量PCR技术测定VmGluI的表达量。结果显示,苹果树腐烂病菌VmGluI的开放阅读框为1 689 bp(GenBank登录号KY646110),编码562个氨基酸,蛋白分子量62.7 k Da。VmGluI编码的蛋白具有糖基水解酶1家族的保守功能域,其二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,β-转角较少。VmGluI编码氨基酸序列与苹果和梨树腐烂病菌β-葡萄糖苷酶基因(KUI68239.1和KUI56905.1)同源性最高,分别为98.7%和87.8%,而与非植物病原真菌β-葡萄糖苷酶基因亲缘关系较远。接种苹果树腐烂病菌的富士枝条中,VmGluI显著上调表达,推测其在腐烂病菌侵染致病过程中起重要作用。离体枝条接种48 h后基因表达量开始显著升高,72 h时表达量最高为对照6.3倍;活体枝条接种12 h后,基因表达量已为对照的11.2倍,接种后48 h基因表达出现低谷,但96 h时表达量为对照的16.8倍,表明苹果树腐烂病菌在侵染离体和活体枝条过程中,VmGluI表达水平和时序变化存在明显差异。     

小麦抗白粉病SSH-cDNA文库中差异基因的表达模式

为了解白粉菌诱导下抗白粉病小麦的抗病机制,构建了白粉菌接种初期的抑制性消减杂交cDNA(SSH-cDNA)文库。从中随机挑取140个阳性克隆进行测序,去除冗余序列和重复序列后,得到94条EST,利用NCBI的BLAST在线序列比对工具对GenBank的蛋白质数据库进行同源性比对及功能分类。结果表明,49个EST与已知功能蛋白同源性较高,主要涉及初级代谢(2%)、能量代谢(24%)、细胞结构(2%)、转录(2%)、蛋白质合成加工与储藏(16%)、转运(4%)、信号转导(4%)和抗病与防御(30%)。经文库比较,筛选出与病程相关蛋白基因同源的EST(Z25-1)和与谷胱甘肽硫转移酶同源的EST(Z440-1),GenBank登录号为EX567369和EX567360。以其EST序列为依据设计引物,通过RT-PCR分析它们在白粉菌诱导下的表达模式,结果该2基因表达存在明显差异。其中,Z25-1在未接种白粉菌时具有一定的表达量,白粉菌侵染后表达量开始上升,侵染72 h时表达量最高,然后下降;Z440-1在未接种时也具有一定的表达量,但在接种初期表达微弱,甚至不表达,24 h后表达开始上升,到72 h时达最高,然后下降。本研究表明,病程相关蛋白和谷胱甘肽硫转移酶属于诱导型表达基因,且参与白粉病抗病反应,在白粉菌诱导72 h时表达量最高。     

白粉菌侵染Pm21近等基因系的早期蛋白组差异研究

分析接种小麦白粉菌E09后Pm21近等基因系及其亲本叶片的总蛋白质差异,从蛋白质组调控角度揭示Pm21基因抗白粉病的抗病机理。以Pm21近等基因系及其亲本百农3217为试材,显微观察接种后5 d内的叶片表面细胞与白粉菌孢子表型差异;采用非离子去污剂提取总蛋白质,运用双向电泳、质谱分析与数据库检索技术,比较Pm21近等基因系及其亲本接菌第4天后的叶片总蛋白质差异。超显微和显微观察结果表明,12 h后百农3217叶细胞表面与Pm21近等基因系相比褶皱明显;在接菌第2天后,在Pm21近等基因系白粉菌孢子生长明显慢于其亲本表面孢子,且孢子侵入个数较少,不萌发现象较多;在第4天后Pm21近等基因系被侵染叶片细胞出现过敏性反应;通过MALDI-TOF-MS/MS质谱测序和MASCOT软件序列分析,注释了15个表达上调蛋白点;功能分类表明,差异蛋白质分别参与叶绿体光合呼吸作用(40%)、放氧作用(13%)、代谢物合成(20%)、抗病、动力蛋白、运输等生理功能。蛋白质组水平发现,光合呼吸蛋白和叶谷氨酰胺合成酶在Pm21近等基因系感病3～4 h后就大量表达,可能是导致叶片明显变绿原因;叶谷氨酰胺合成酶的增加与光合呼吸蛋白的增加密不可分;光合呼吸蛋白和抗坏血酸过氧化物酶的上调表达为植物体在高H2O2浓度下正常生长提供了保障。另外,β-1,3-葡聚糖苷酶的过量表达也是Pm21基因前期抵御白粉菌侵染有效物质。钾离子通道蛋白可能在抗病防御过程中起到了信号转导的作用。     

小麦自噬相关基因ATG10的克隆及白粉菌侵染诱导的ATG10的表达

细胞自噬是一种保守的真核生物细胞内物质分解和循环利用机制, 在植物生长、发育和逆境响应等过程中均扮演了重要角色。自噬相关蛋白ATG10是参与自噬小体形成的关键因子之一。利用同源克隆方法, 从经白粉病菌诱导48 h的小麦材料92R137/扬麦158⁷中克隆了ATG10基因家族3个成员(TaATG10a、TaATG10b和TaATG10c)。序列特征分析、物种间的比较和进化分析, 以及酵母功能互补实验结果证实, 这3个基因均为酵母ATG10的功能性同源基因。TaATG10a和TaATG10b的基因组序列具有相似的6外显子-5内含子基因结构。RT-PCR分析还发现这2个基因都具有2种可变剪接产物。TaATG10a和TaATG10b的GFP融合蛋白被定位于洋葱表皮细胞的细胞质中。白粉菌侵染能够诱导TaATG10a和TaATG10b表达, 因此推测, 小麦针对白粉菌侵染的免疫反应涉及对TaATG10及其参与的自噬过程的调控, 其调控模式因小麦抗、感白粉病反应、不同类型抗病基因介导的免疫反应和不同遗传背景下的感病反应而差异明显, 说明TaATG10及其参与的自噬过程与小麦-白粉菌互作反应关系的复杂性。从外源激素处理诱导的表达情况还发现, 抗、感白粉病的表型差异可能涉及抗、感材料TaATG10基因对同种激素(SA、乙烯或ABA)信号的不同响应模式。     

毛竹β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆及序列分析(英文)

β-1,3-葡聚糖酶是一种植物病程相关蛋白,在植物抵御病害中有重要作用。本研究以毛竹为实验材料,利用RACE技术,克隆毛竹β-1,3-葡聚糖酶基因的外显子序列,并在β-1,3-葡聚糖酶基因的编码区两端设计引物,以毛竹基因组DNA为模版扩增该基因的内含子序列。序列结果表明,该基因全长1693bp,包含两个外显子和一个内含子,命名为PheGLU(GenBank登录号GU238236)。该基因包含1个996bp的开放阅读框,编码332个氨基酸,相对分子质量为3.541×104Da,其等电点pI为6.389,是一个酸性蛋白且分泌到胞外;其中,该蛋白的二级结构中包含35.15%的α-螺旋,21.82%的β-转角,43.03%的延伸链和无规则卷曲等;三级结构同源建模预测显示,它与大麦β-1,3-葡聚糖酶(PDB number:1ghsA)具有80.4%的同源性;聚类分析显示,该基因序列与已报道的其它植物具有较的高氨基酸序列同源性。本研究为进一步鉴定毛竹β-1,3-葡聚糖酶基因的抗真菌病害能力奠定了基础。     

苯并噻二唑(BTH)诱导苹果抗斑点落叶病研究

研究苯并噻二唑（BTH）诱导苹果抗斑点落叶病的组织病理学特征,及其诱导抗病性与苯丙氨酸解氨酶活性（PAL）、几丁质酶活性和β-1,3-葡聚糖酶活性的关系。用整叶组织透明染色法进行组织病理学观察,用比色法测定PAL、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活的变化。结果表明：BTH能诱导苹果提高对斑点落叶病的抗性,接种前6d处理时可引起苹果斑点落叶病病情指数由对照的21.3下降到9.3。组织病理学观察发现,BTH诱导抑制病菌侵染钉的形成,限制病菌向细胞内扩展;酶活测定发现,BTH诱导能提高苹果叶片PAL、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性。处理的果苗比对照果苗防卫反应启动的要早。     

Inheritance of field resistance to Septoria tritici blotch in the wheat doubled-haploid population Solitär × Mazurka

Breeding for field resistance to Septoria tritici blotch (STB), caused by Mycosphaerella graminicola (anamorph: Septoria tritici), is the most suitable strategy for controlling this important disease of wheat. Although many Stb genes for resistance to single pathogen isolates have been identified in wheat, knowledge of their efficiency against natural fungal populations is lacking. In a quantitative-trait-locus (QTL) mapping approach in six environments and four locations, field resistance to STB was studied in a doubled-haploid population derived from a cross between the field-resistant cultivar Solitär and the susceptible cultivar Mazurka. After plant height as a disease escape trait was accounted for, five QTL with effects on STB response on chromosomes 5A, 6D and 7D explained 20 % of the genotypic variance; QTL × environment interactions were minor. Field resistance was conferred exclusively by alleles from Solitär, which was previously shown to carry the isolate-specific genes Stb6 and Stb11 as well as minor QTL detected with seven fungal isolates. Surprisingly, neither the Stb6 nor Stb11 isolate-specific genes nor minor QTL previously detected in Solitär were found to be involved in its field resistance. The study suggests that resistance breeding for STB should not rest solely on the deployment of Stb genes. Field tests are indispensable to show their efficacy and durability and to identify genes conferring partial field resistance to STB.     

小麦铝胁迫相关基因的研究进展

铝胁迫是世界范围内酸性土壤中抑制作物生长的主要因素。铝胁迫能够抑制细胞伸长和细胞分裂,导致根部发育迟缓并伴随着水分和营养吸收的降低。目前,铝胁迫对谷物尤其是小麦、黑麦等的影响进行了一系列遗传分析研究。在铝胁迫处理的Warigal小麦（Al敏感品种）中发现了7个wali基因,分别为wali1,wali2,wali3,wali4,wali5,wali6和wali7。wali1编码植物类金属硫蛋白,与拟南芥、大豆、豌豆、野生猴面花、玉米和大麦等植物金属硫蛋白同源;wali2编码的蛋白与数据库中的其他序列没有明显的同源性;wali3,wali5和wali6编码的蛋白是丝氨酸蛋白酶抑制剂Bowman-Birk家族的成员,具有该家族的保守结构域;wali4编码的蛋白与苯丙氨酸解氨酶（PAL）同源;wali7与玉米、水稻的茎部特异性基因具有较高同源性,编码的蛋白是Gn_AT_II家族的一个成员。随后,在Victory小麦（Al敏感品种）分离出β-1,3-葡聚糖酶和fimbrin-like细胞骨架蛋白基因;在Atlas 66小麦（Al敏感品种）筛选出4个铝调控基因war4.2、war5.2、war7.2和war13.2,序列比对显示四个基因分别与过氧化物酶、半胱氨酸酶、苯丙氨酸解氨酶和草酸氧化酶同源。铝胁迫影响了植物生命活动的方方面面,植物也进化出了许多措施来对抗铝胁迫。此文主要就小麦铝胁迫相关蛋白的基本结构特征、生物学功能、表达调控以及最新研究进展进行综述。     

辣椒品种对疫病的抗性研究（I）不同互作中的水解酶活性及其与抗性的关系

研究了不同抗性的辣椒对疫霉菌侵染反应中的抗性表现及水解酶活性的变化。结果表明：辣椒对疫病的抗性表现为抗病菌扩展,β-1,3-葡聚糖酶对抗病菌在植物体内扩展起到积极作用,抗、感品种在接种疫霉菌后,β-1,3-葡聚糖酶活性均显著增加,抗、感品种增强的速度和数量差异很大。几丁质酶活性虽有所增加,抗、感品种差异不大,其在抗疫病扩展上的作用甚微。     

寄主诱导的基因沉默提高植物真菌病害抗性研究进展

寄主诱导的基因沉默(host-induced gene silencing,HIGS)以病原菌生长发育、产孢繁殖、侵染或致病过程中的关键基因作为靶点,在寄主植物中表达针对靶基因的RNAi构建体,在病原菌侵染植物的过程中,摄入相应的ds RNA或si RNA分子,通过识别、结合特异核苷酸序列,干扰病菌靶基因表达,从而抑制病菌侵染和扩展,使植物表现抗病。这项技术为培育基于病原菌特异序列的植物抗病性奠定了基础,显示了巨大的应用潜力。本文综述了利用HIGS技术提高植物真菌病抗性的最新研究进展,总结了国内外利用这项技术改良植物真菌病害抗性的主要策略、技术路线,展望了发展应用前景。     

铝胁迫条件下小麦根系特异表达基因的研究

利用尼龙膜点阵杂交技术,由耐铝胁迫小麦品系OK91G106根系构建的cDNA差减杂交文库中,鉴定出29个铝胁迫特异诱导基因,包括20个已知生物学功能的基因和9个功能未知基因。这20个已知功能基因归属于植物体内细胞信号转导、活性氧清除、维持膜结构稳定、苹果酸分泌和细胞保护等等类别。表明在铝胁迫下,植株体内在短时间内发生了感受铝胁迫逆境信号并进行了信号转导,调控了植株对铝胁迫逆境响应的复杂分子生物学过程。Northern印迹对5个铝诱导基因转录本的检测结果与尼龙膜点阵技术获得的结果相一致。本研究鉴定出的铝诱导基因中含有1个苹果酸转运蛋白基因,表明苹果酸分泌量的增加可能是供试小麦响应和抵御铝胁迫逆境的重要机制之一。