TCR T细胞疗法的研究挑战和审评考虑

随着生物技术的发展,细胞基因疗法已成为生物制药领域的新热点。2017和2018年,Kymriah(Novartis公司)和Yescarta(Kite Pharma)两款嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞治疗产品在美国和欧盟相继上市,推动了CAR T细胞疗法的研发热潮。与此同时,国内外多家企业已在研发与CAR T细胞疗法同属于细胞基因疗法的T细胞受体(T cell receptor,TCR)T细胞疗法。     

用于癌症免疫疗法的慢病毒载体的研究进展

近年来,得益于对癌症免疫监视和逃逸机制理解的不断深入及基因转运载体的发展,免疫疗法在临床上取得了一系列的成功。本文将介绍包括慢病毒载体(lentivirus,LV)的基本结构和生活史在内的发展历程。LV应用中的最主要安全性风险来源于具有复制能力的慢病毒载体(replication competent LV,RCL),针对这一问题发展出了一系列新的LV和相应的辅助手段。目前作为癌症免疫疗法主流的过继细胞传输法包括T细胞受体(T cell receptor,TCR)-T细胞和嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)-T细胞疗法,其中LV已被广泛应用。此外本文还针对LV应用中的一些监管方面的问题及LV的未来发展方向进行探讨。     

6Ckine修饰的树突状细胞促进T淋巴细胞增殖和分化的作用

目的研究次级淋巴组织趋化因子(6Ckine)修饰的树突状细胞(DC)对T淋巴细胞增殖和分化的影响。方法用携带人6Ckine基因的重组复制缺陷型腺病毒(Ad-6Ckine)感染人外周血单个核细胞来源的DC,检测Ad-6Ckine-DC对6Ckine的表达及细胞因子分泌的影响,并观察其吞噬功能和表型的变化及对自身T淋巴细胞的趋化作用。用结肠癌LoVo细胞抗原致敏Ad-6Ckine-DC,将该DC与自身T淋巴细胞共同培养,分别用3H掺入法、RT-PCR和ELISA检测Ad-6Ckine-DC对T淋巴细胞增殖和分化的影响。结果在Ad-6Ckine转染后24h内,DC的吞噬功能几乎不受影响。转染的6Ckine基因能在DC中表达,表达的6Ckine能促进其表达CD83和CCR7,上调RANTES的表达。Ad-6Ckine-DC对自身T淋巴细胞有明显的趋化作用,抗原致敏的Ad-6Ckine-DC能显著促进T淋巴细胞的增殖,并增强其表达T-bet和IL-2的能力。结论6Ckine基因的修饰能在一定程度上促进DC的成熟,并募集T淋巴细胞于DC周围,有利于DC向T淋巴细胞传递抗原和第二信息,增强DC促进T淋巴细胞增殖的作用并使其向Th1分化,诱导细胞免疫,将成为制备肿瘤疫苗的一种良好选择。     

人细胞内Ca2+对CD4+T细胞免疫功能调控作用的研究进展

CD4⁺T淋巴细胞是人体免疫系统中重要的免疫细胞之一,主要分为Th1、Th2、Th17、滤泡辅助T细胞(T f ollicular helper cells,Tfh)及调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)。CD4⁺T淋巴细胞功能取决于T细胞受体(T cell receptor,TCR),TCR的激活触发了内质网释放Ca²⁺,Ca²⁺作为细胞的第二信使,通过改变其在细胞内外的浓度来参与细胞周期进展和增殖等多个生物活动过程,以维持免疫细胞的正常功能。CD4⁺T淋巴细胞与脂肪肝、肝脂沉积、肝炎、肿瘤等多种疾病的发生发展有关。因此,本文就细胞内Ca²⁺对CD4⁺T细胞免疫功能调控作用的研究进展作一综述,以期为某些疾病新临床治疗方案的研发提供参考。     

记忆性T细胞亚类的研究进展

T细胞免疫对于调节抗体的生成及清除受感染的细胞均发挥相当重要的作用。记忆性T细胞的特点是在初次免疫反应完成后仍能长期存活,并形成不同的亚类,每一亚类细胞又分为中枢记忆性T细胞和效应记忆性T细胞。这些记忆性T细胞在宿主体内长期存在,当宿主受到再次感染时可提供有效的保护作用。本文结合最新研究进展,对主要的记忆性T细胞(如CD8+和CD4+记忆性细胞)类型及其功能作一综述。     

慢性粒细胞白血病树突状细胞对T细胞增殖作用的研究

目的　体外诱导慢性粒细胞白血病 (CML)患者外周血单个核细胞 (PBMCs)为树突状细胞 (DCs) ,并对其形态、表型及对T细胞刺激增殖作用进行研究。方法　利用GM CSF、IL 4、TNF α体外定向诱导生成树突状细胞 ,对所诱生的细胞进行细胞表型及形态检测 ,用D FISH方法检测所诱生DCs的白血病源性 ,应用MTT法检测所诱生的DCs刺激T细胞增殖的能力。结果　CML患者PBMCs在体外可诱导生成bcr/abl融合基因阳性的DCs(CMLDCs)。CMLDCs对自体T细胞有明显刺激增殖作用 ,而CML细胞无此作用。CMLDCs刺激同一异体T细胞增殖能力弱于正常DCs,但当培养体系中加入 30 0U/ml干扰素 α(IFN α)时可使其刺激能力接近正常DCs。结论　CMLDCs具有刺激自体及异体T细胞增殖的能力 ,但对异体T细胞的刺激作用弱于正常DCs,IFN α可提高CMLDCs刺激T细胞增殖能力     

循环应用低剂量环磷酰胺对黑色素瘤荷瘤小鼠调节性T细胞的影响及抗瘤作用

目的观察循环应用低剂量环磷酰胺(CTX)对黑色素瘤荷瘤小鼠调节性T细胞(Treg)的影响及抗瘤作用。方法通过皮下接种黑色素瘤细胞B16制备黑色素瘤荷瘤小鼠模型;对荷瘤小鼠分别经腹腔单次或循环注射CTX,每隔7d给药1次,共3次,应用流式细胞术检测小鼠脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg的含量;培养小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC),将DC与脾T淋巴细胞混合培养,应用ELISA法检测脾T淋巴细胞干扰素γ(IFNγ)的分泌量;同时测量肿瘤的大小,绘制肿瘤生长曲线,并观察各组荷瘤小鼠自身免疫病的发生情况。结果CTX的最佳应用剂量为100mg/kg。随着荷瘤时间的延长,荷瘤小鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+/CD4+的比值呈逐渐升高趋势。单次应用CTX抑制Treg的时间较短,而循环应用CTX能够延长对Treg的抑制,使其维持在相对较低的水平;循环应用CTX显著提高了荷瘤小鼠脾T淋巴细胞IFNγ的分泌水平。单次和循环应用CTX均未能延缓肿瘤的生长,两组小鼠均未见免疫性白斑及明显的化疗毒副反应。结论循环应用CTX能更加有效地调控Treg,从而促进DC对T淋巴细胞的抗原特异性激活,这将会提高DC疫苗的抗瘤效果。     

调节性树突状细胞在免疫相关性疾病中的研究进展

树突状细胞(Dendritic cell,DC)是机体免疫系统中一组形态和功能异质性的专职抗原提呈细胞,其既能启动初始免疫应答,也能负向调节免疫反应。具有负向调节免疫应答功能的树突状细胞称为调节性DC(Regulatory DC,DCreg)。DCreg在某些感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等的发生发展过程中起重要作用,也有望在临床中成为重要的治疗工具。DCreg的分化与细胞所处的微环境有关,结合微环境研究DCreg才能客观地反应机体免疫功能的真实状态。本文就DCreg分化的微环境、血管活性肠肽(Vasoactive intestinal peptide,VIP)诱导的DCreg(DCVIP)以及部分DCreg在免疫相关性疾病中的临床意义等方面的最新研究进展作一综述。     

细胞膜表面异位表达热休克蛋白70的CD4~+T细胞诱导EAE小鼠保护性免疫作用

目的探讨细胞膜表面异位表达热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)在T细胞疫苗(T cell vaccine,TCV)诱导保护性免疫中的作用。方法建立髓鞘少突胶质细胞糖蛋白多肽35-55(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG35-55)诱发的C57BL/6小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental auto-immune encephalomyelitis,EAE)模型,以MOG35-55肽特异性CD4~+T细胞为疫苗,经尾静脉免疫小鼠。对EAE小鼠的临床神经功能进行评分,流式细胞术检测小鼠脾脏中CD4~+CD25~+Foxp3~+调节T细胞(Treg)百分比、ELISA法检测脾细胞培养上清中细胞因子IFNγ、IL-4、IL-10和IL-17含量。结果射线照射可诱导活化CD4~+T细胞表面异位表达HSP70;HSP70~+T组小鼠症状显著轻于HSP70-T封闭组(P 0. 01);HSP70~+T组小鼠脾脏中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞百分比、脾细胞上清中IL-4、IL-10含量均显著高于HSP70-T组(P 0. 01),而IFNγ、IL-17含量均显著低于HSP70-T组(P 0. 01)。结论细胞膜表面异位表达HSP70在活化T细胞诱导的保护性免疫中发挥重要作用。     

重组靶向毒素hIL6(T22)-PE38在大肠杆菌中的表达及其细胞毒性

目的 在大肠杆菌中表达、纯化重组靶向毒素hIL6(T22)-PE38,并检测其细胞毒性。方法以PHis-hIL6(T22)-PE38质粒为模板,PCR扩增hIL6(T22)-PE38基因,插入表达载体pET-28a(+)的NcoⅠ和XhoⅠ多克隆位点,构建重组表达质粒,分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)、Rosettablue(DE3)和BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达,并对表达条件进行优化。表达产物经亲和层析纯化后,检测其细胞毒性。结果重组表达质粒pET-28a-hIL6(T22)-PE38经双酶切和测序证明构建正确。表达的重组毒素相对分子质量约56 000,在大肠杆菌Rosettablue(DE3)中表达量最高。最适诱导表达条件为:1 mmol/L IPTG 28℃诱导4 h。重组毒素能选择性地杀伤人骨髓瘤细胞U266和鼠骨髓瘤细胞SP2/0,体外对U266和SP2/0细胞的IC50分别为0.5～1.0和1.0～1.5μg/ml。结论重组靶向毒素hIL6(T22)-PE38在大肠杆菌中成功获得可溶性表达,纯化的蛋白可明显选择性杀伤U266和SP2/0细胞。     

卡介苗与结核分枝杆菌早期分泌靶抗原刺激人γδT细胞分泌细胞因子能力的比较

目的比较卡介苗(bacillus Calmette-Guerin vaccine,BCG)与结核分枝杆菌早期分泌靶抗原(early secreted antigenic target-6,ESAT-6)刺激人外周血γδT细胞分泌细胞因子的能力。方法采用Ficoll密度梯度离心法分离健康人外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),加入Anti-human gamma-delta TCR-FITC抗体标记γδT细胞,上流式细胞仪进行分离纯化;分别用BCG和ESAT-6刺激γδT细胞,同时,以不加任何刺激因子的γδT细胞作为空白对照,分别于刺激培养后第1、3、6、9和12天取上清,采用ELISA试剂盒检测IL-17、TNF-α及IFNγ的分泌水平;上流式细胞仪检测γδT细胞的增殖水平。结果γδT细胞占PBMC的4.83%,其纯度为88.90%;与空白对照组比较,BCG和ESAT-6刺激的γδT细胞分泌的IL-17、TNF-α及IFNγ水平均明显升高,且ESAT-6组明显高于BCG组(P均<0.05);与空白对照组相比,BCG组和ESAT-6组γδT细胞数量明显增加,且ESAT-6组较BCG组增加明显(P均<0.05)。结论 BCG和ESAT-6均可刺激γδT细胞增殖,并大量分泌IL-17、TNF-α及IFNγ,且ESTA-6的刺激作用强于BCG。     

树突状细胞疫苗的研究进展

树突状细胞（dendritic cell,DC）是一类强大的抗原提呈细胞,也是适应性免疫应答的关键步骤,对于诱导T、B细胞介导的细胞免疫和体液免疫是必需的。由于其特殊的免疫学功能,在DC疫苗的研究中备受关注。目前已有一种基于DC的疫苗Sipuleucel-T获批上市,还有多项DC疫苗正在临床试验阶段。本文对DC的生物学特征和功能、DC疫苗的类型以及DC疫苗面临的挑战和前景作一综述。     

1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗诱导CD8~+T细胞对病理性CD4~+T细胞的抑制作用

目的观察1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗诱导CD8+T细胞对病理性CD4+T细胞的抑制作用。方法用1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗免疫非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠,并同时设立噬菌体空载体免疫组和未免疫空白对照组。于初次免疫后第20周,检测各组小鼠血糖;磁珠法分离免疫小鼠CD8+T细胞,并用合成反义肽及IL-2诱导刺激作为效应细胞;分离噬菌体空载体免疫组和空白对照组小鼠CD4+T细胞,用合成正义肽及IL-2诱导刺激作为靶细胞。将效应细胞与靶细胞按不同比例混合,以乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CTL的杀伤活性。结果初次免疫后第20周,1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗免疫组小鼠血糖水平保持正常,而另外2组小鼠血糖均高于正常水平。1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗免疫组诱导的CD8+T细胞作效应细胞,当效靶比为100∶1时,对噬菌体空载体免疫组CD4+T细胞的杀伤效率最高,达47.95%±11.30%,而噬菌体空载体免疫组诱导的小鼠CD8+T细胞对空白对照组的CD4+T细胞无杀伤作用。结论1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗能够诱导CD8+T细胞抑制病理性CD4+T细胞。     

γδT细胞及其治疗癌症的研究进展

γδT细胞属T细胞亚群,为一类不受组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)限制的先天淋巴细胞。γδT细胞能分泌大量细胞因子,参与体内多种生理及病理过程,在免疫监视及免疫防御等方面具有重要作用,可对癌细胞产生有效的细胞毒性反应。目前临床试验结果表明,γδT细胞在抗肿瘤方面展现出了良好的应用前景。本文就γδT细胞的分类、结构特征、作用机制、分离和活化方法及临床应用等方面作一综述。     

抗人T细胞猪免疫球蛋白的有效期研究

目的研究低温乙醇法工艺生产的抗人T细胞猪免疫球蛋白的有效期。方法将3批经全面检定合格的抗人T细胞猪免疫球蛋白置(6±2)℃贮存36个月,分别于0、3、6、9、12、18、24、30、36个月取样,参考《中国药典》三部(2005版)中抗人T细胞猪免疫球蛋白检测方法和标准,对制品外观、pH值、纯度、蛋白含量、分子大小分布以及效价进行检定。将E玫瑰花环形成抑制试验及淋巴细胞毒试验的标示量与贮存时间结果导入Excel,使用6SQ统计加载项,进行一元线性回归,选择时间和预测区间的上或下限作散点图,在散点图中选择添加趋势线,如可观察到预测区间的上限值呈线性,可在趋势预测/回归分析类型中选择线性,获得拟合方程,将标示量带入方程中,计算获得有效期。结果根据E玫瑰花环形成抑制试验效价测定结果,理论推算在(6±2)℃条件下保存时,有效期可达41~100个月;根据淋巴细胞毒试验效价测定结果,理论推算在(6±2)℃条件下保存时,有效期可达47.9~64.3个月。结论初步确定抗人T细胞猪免疫球蛋白制品有效期为30个月。     

选择性去除表达CD25 、CD69 的同种异体反应T细胞的实验研究

目的 探讨体外选择性去除表达CD25 、CD69 的同种异体反应T细胞协调移植物抗宿主病和移植物抗肿瘤的可能性.方法 流式细胞仪检测初次单向混合淋巴细胞反应CD25 、CD69 表达情况,磁性细胞分离系统在细胞表达高峰去除CD25 、CD69 同种异体反应rr细胞.MTT法在各时间点检测不同抗原组再次混合淋巴细胞反应的细胞增殖情况.结果 再次单向混合淋巴细胞反应显示明显降低了对相同刺激原的反应性(48.82±13.71)%,保留大部分对无关刺激原的反应性(65.47±9.84)%和肿瘤刺激原的反应性(84.83±3.65)%.结论 体外选择性去除表达CD25 、CD69 的同种异体反应T细胞可以协调移植物抗宿主病和移植物抗肿瘤.     

转基因树突状细胞激活细胞毒性T细胞特异性杀伤淋巴瘤的体外实验

目的 探讨转基因树突状细胞激活细胞毒性T细胞产生抗淋巴瘤的特异性细胞免疫反应。方法 采用人骨髓来源的髓系前体细胞,在人细胞因子IL-4、GM-CSF和INF-α诱导下,在体外生成大量树突状细胞。将制备好的含有IgVH1核酸质粒,用脂质体法转染树突状细胞。转染成功的树突状细胞与外周血T淋巴细胞共培养,激活特异性CTL细胞,与阳性表达IgVH1的人淋巴瘤Namalwa细胞反应,用3H-TdR掺入法观察CLLs对瘤细胞的特异性杀伤效应。结果 树突状细胞能够用脂质体方法转染IgVH1核酸质粒,并且有效递呈给外周血T细胞,对表达IgVH1的人淋巴瘤Namalwa细胞产生特异性免疫杀伤活性,与对照组相比差异有显著意义（P<0.01）。结论 体外诱导扩增的 DC能够转染 IgVH1核酸质粒,体外激活T淋巴细胞,产生特异性细胞毒效应。     

免疫原性细胞死亡及其在肿瘤治疗应用中的研究进展

免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death,ICD)是细胞死亡的一种形式,通过释放肿瘤相关抗原(tumor asso-ciated antigen,TAA)和肿瘤特异性抗原(tumor specific antigen,TSA),暴露"危险信号"以刺激机体免疫系统产生免疫应答,其特点是释放和/或增加...     

辅助性T细胞17与相关疾病发生的研究进展

辅助性T细胞17(T helper cells 17,Th17)是新近发现的一种辅助性T细胞,该类细胞在机体的抗微生物免疫中起非常重要的作用,也与很多自身免疫性疾病的发生有一定的关系,如过敏、糖尿病、类风湿性关节炎等。Th17细胞是与Th1及Th2细胞不同的T细胞亚类,可分泌IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22等细胞因子。本文就Th17细胞的基本生物学功能、与感染性疾病及自身免疫性疾病发生的相关性作一综述。     

肿节风注射液对荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖活力及NK细胞活性的影响

目的研究肿节风注射液(ZJF)对荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖活力及NK细胞活性的影响,探讨其抗肿瘤作用的机制。方法无菌取C57BL/6纯系小鼠脾脏,制成5×106个/ml的单个脾细胞悬液,MTT法检测不同浓度(50、25、12.5、6.25和3.13 mg/ml,以生药量计)的ZJF对正常小鼠T淋巴细胞增殖的影响。将近交系615小鼠经左腋皮下注射小鼠前胃癌Fc细胞(1×106个/ml,0.2 ml/只),复制荷瘤小鼠模型,并随机分成5组:ZJF低、中、高剂量组(给药剂量分别为2、10、20 mg/kg,以生药量计)、CTX组[0.3 g/(kg·3 d)]及阴性对照组(生理盐水0.1 ml/10 g),MTT法检测ZJF对荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖及NK细胞活性的影响。结果 ZJF可显著促进正常小鼠T淋巴细胞的增殖(P<0.05),且呈剂量依赖性;ZJF低、中、高剂量组荷瘤小鼠T淋巴细胞的增殖活力明显高于阴性对照组(P<0.05),且呈剂量依赖性,ZJF中、高剂量组荷瘤小鼠NK细胞的活性明显高于阴性对照组(P<0.05)。结论 ZJF可促进正常小鼠与荷瘤小鼠T淋巴细胞的增殖活力,增强NK细胞活性,为其抗肿瘤作用机制的研究提供了实验依据。