伪狂犬病病毒gE／gI双基因缺失株的生物学特性

为了解gE和gI双基因缺失株伪狂犬病病毒gE-／gI—PRVSA738和野毒株PRV—SA的生物学特性,对该病毒进行了理化特性和体外增殖曲线的研究。结果显示：该缺失株对氯仿、酸、热及冻融次数敏感,从双基因缺失毒株与野毒株在BHK-21细胞上的增殖曲线来看,在病毒培养50h之前野毒株的毒价均高于缺失株,而在50h以后缺失株的毒价又高于野毒株,并且在36h时2株病毒的毒价均达到最高峰。     

马立克氏病病毒６４８株囊膜糖蛋白gI基因的克隆和表达的研究

根据马立克氏病病毒（ＭＤＶ）强毒株ＧＡ的基因序列，设计和合成一对引物，以特超强毒６４８株基因组ＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ技术，扩增其囊膜糖蛋白gI基因阅读框（ＯＲＦ）中，除去其Ｎ－端编码疏水区的１６５个碱基对（bp)以外的蓁部分；将ＰＣＲ产物按正确的阅读框架定向克隆到表性载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）基因的下游，将重组质粒转化进大肠杆菌ＢＬ２１株，在１．０mMIPTG浓度和３０℃的条件下诱导，gI-GST基因融合蛋白获得了理想的表达；经聚丙烯酰胺凝脉电泳，West-ern-blot试验，通信班下其表达的融合蛋白产物大小为预期的６３ＫＤ。将表达产物回收后免疫小鼠，所得抗血清可与ＭＤＶ感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）在免疫荧光试验（ＦＡ）中呈细胞膜阳性染色。试验结果表明，在大肠杆菌中表达的６４８株ＭＤＶgI基因的融合蛋白产物保留了天然蛋白的某些抗原性。     

马立克氏病病毒广西株G2囊膜糖蛋白gI基因的克隆和表达

根据马立克氏病病毒（MDV）强毒株GA的基因序列，设计并合成了1对引物，以强毒株G2基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增其囊膜糖蛋白gI基因阅读（ORF）中，除去其N－端编码水区165个碱基对（bps)以外的部分，将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆到表性载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶（GST）基因的下游，将重组质粒转化入大肠杆菌BL21株，在1.0mmol/LIPTG浓度和30℃的条件下诱导，gI-GST基因融合蛋白获了理想的表达，经聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western-blotting试验，验证其表达的融合蛋白产物大小为预期的63000，将表达产物回收后免疫小鼠，所得抗血清可与MDV感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）在免疫光试验（FA）中，呈细胞膜阳性染色，试验结果表明，在大肠杆菌中表达的G2株MDVgI基因的融合蛋白至少保留了天然蛋白的部分抗原性。     

鸭瘟强毒与疫苗毒的囊膜糖蛋白序列比较

2011年,2个免疫过鸭瘟疫苗的樱桃谷北京鸭种鸭群发生鸭瘟。为了解该病发生是否与鸭瘟病毒(Anatid herpes-virus 1,AnHV1)变异有关,从发病场采集4份病死鸭的肝脏样品,用PCR检测和病毒分离进行了鉴定,并经UL2测序和序列分析确定1株AnHV1分离株(W1)具有强毒株的分子特征。在此基础上,测定并比较了W1株和3株AnHV1弱毒疫苗的囊膜糖蛋白序列。结果显示,分离株W1株与3株弱毒疫苗株之间gB、gC、gD、gG、gH、gM、gN和gL蛋白的氨基酸序列完全相同,gE、gI和gK蛋白的氨基酸序列同源性为99%。结果表明,相对于我国养鸭生产中常用的弱毒疫苗株,分离株W1株的囊膜糖蛋白序列未发生明显的变异。     

伪狂犬病病毒上海株gE和gI基因的克隆及序列分析

参考Genebank发表的伪犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）的gI和gE基因序列，自行设计并合成了两对引物，对PRV上海株（PRV－SH）进行PCR扩增，产物经琼脂糖电泳分析，均呈现一条约960bp和1740bp的条带，将其克隆入pGEM-T-easy载体中，进行了序旬测定，将PRV－SH株的gI基因与Rice株gI基因比较发现,核苷酸的同源性为94.7%，氨基酸的同源性为91.3%，证实为gI基因，将PRV－SH gE基因序列与Ea株、Ruce株gE基因序列进行比较，结果显示，该序列与PRV Ea株、Rice株gE基因的同源性分别为98.5%、97.5%；的氨基酸序列与Ea株，Rice株和I型单纯疱疹病毒（HSV－1）17株gE的同源性分别为97.2%、94.8%和15.6%。     

伪狂犬病病毒上海株的gI基因的克隆和序列分析

参考Genebank发表的伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV)的gI糖蛋白基因序列，自行设计合成一对引物，对PRV上海株（PRV－SH）进行PCR扩增，产物经琼脂糖电泳分析，呈现一条约960bp的条带，将其克隆入pGEM-T-easy载体中，并进行序列测定，与PRV Rice株gI基因比较发现，核苷酸的同源性为94．7％，氨基酸的同源性为91．3％，证实为gI基因。     

PCR检测鸭瘟病毒的研究

根据鸭瘟病毒DNA聚合酶基因序列，设计、合成了1对引物，以1株鸭瘟病毒疫苗株DNA为模板，进行：PCR扩增，扩增出预期563bp的目的DNA片段。将扩增出的DNA片段克隆到pMDl8—T载体，经Amp／IPTG／X-gal平板筛选，HindⅢ、XbaⅠ双酶切鉴定，获得阳性重组质粒。对重组质粒进行序列测定，与参考序列比较，二者同源性为99．3％。小鹩瘟病毒、鸭肝炎病毒、鹅副黏病毒：PCR扩增均为阴性。用此方法检测人工感染和自然感染鸭瘟的组织(脑、肝、脾)，均能检测到鸭瘟病毒DNA。PCR检测鸭瘟病毒具有高度的特异性、敏感性，能够用于鸭瘟急性及亚临床感染的检测与诊断。     

伪狂犬病病毒gE/gI基因在昆虫细胞中的表达及鉴定

为获得具有生物活性的伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)gE/gI蛋白,建立PRV抗体快速检测方法。将含有PRV gE、gI基因的质粒pFastBacdual-GP67-gE/gI转化至宿主菌,经位点特异性重组和蓝白斑筛选后获得重组杆粒rBacmid-gE/gI,转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒。采用悬浮的Sf9细胞进行发酵并纯化产物,SDS-PAGE和Western blot分析镍柱纯化后的重组蛋白。结果显示,重组杆粒在4800 bp处克隆出预期大小的条带,表示重组杆粒构建成功。SDS-PAGE和Western blot表明,在50 ku和65 ku处出现预期大小的条带,能与PRV标准阳性血清特异性反应,不与PRV gE/gI缺失疫苗免疫血清反应。结果表明gE/gI重组蛋白具有良好的反应原性,为PRV抗体快速检测及区分PRV野毒感染和疫苗免疫奠定了基础。     

猪伪狂犬病病毒流行株gE/gI双基因缺失突变株的构建及纯化

根据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)US区基因序列(KJ789182),设计2对特异性引物,扩增PRV NY株gE/gI基因两侧序列,克隆至pUC-19载体,构建转移质粒pUC-gE/gILR,同时插入绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因,构建转移质粒pUC-gE/gILRE,作为重组同源臂。以PRV NY流行株为亲本株,将其基因组与转移质粒pUC-gE/gILRE共转染ST细胞,通过筛选绿色荧光蚀斑,获得含有荧光蛋白的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~--EGFP~+。再以该毒株基因组与转移质粒pUC-gE/gILR进行同源重组,通过筛选无荧光蚀斑,纯化重组病毒,经PCR扩增、测序,证实获得了去除EGFP基因的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~-。该重组病毒在ST细胞上培养时,与亲本株PRV NY具有相似的生长曲线,但该重组病毒的体外生长动力学比亲本株弱。本研究成功构建了1株针对目前PRV流行株的gE/gI双基因缺失病毒,为我国根除PR提供技术支持。     

含LacZ表达盒的鸭瘟病毒TK基因缺失转移载体的构建

根据GenBank已发表的鸭瘟病毒活疫苗C-KCE株基因组序列设计一对引物,扩增出含TK基因完整ORF的2.7 kb的片段,克隆至pMD18T simple载体。利用该片段内的两个酶切位点Xho I和EcoR V,切除TK基因内的244 bp,用T4 DNA聚合酶补平末端;pVAX1-LacZ用Nru I和Nar I双酶切,回收含LacZ表达盒的4.1 kb片段,通过平末端连接将LacZ表达盒插入到TK基因中,从而获得了转移载体pTK-LacZ,为构建重组鸭瘟病毒奠定了基础。     

狂犬病病毒囊膜糖蛋白基因DNA免疫研究

狂犬病病毒(RV)囊膜糖蛋白(G)是该病毒诱导保护性免疫反应的主要抗原.为研究G蛋白基因的DNA免疫效果,本研究构建了表达哺乳动物密码子优化的RVG基因的重组真核表达质粒pCAGG-RVG,间接免疫荧光试验及westem blot结果表明,重组RV G基因在pCAGG-RVG转染的BHK-21细胞中获得正确表达.将pCAGG-RVG按500 μg剂量经肌肉注射途径免疫比格犬,间隔4周以相同剂量、途径加强免疫一次,并于初次免疫前、后不同时间检测血清RV的中和抗体.结果显示,pCAGG-RVG一次免疫即可诱导产生显著的中和抗体反应,二次免疫中和抗体滴度表现出显著地增强效果.二次免疫后,中和抗体滴度缓慢下降,保持持续平稳,至初次免疫后第54周,7只免疫犬病毒中和抗体滴度平均为2.88 IU/mL,并且全部高于0.5 IU/mL,即全部高于对强毒攻击保护的最低中和抗体滴度要求.因此,本研究构建的pCAGG-RVG具有预防狂犬病的潜力,是一种有希望的狂犬病候选疫苗.     

猪伪狂犬病病毒NP株gE、gI基因的克隆及序列分析

根据GenBank中已发表的猪伪狂犬病病毒(PRV) gE、gI基因的序列设计了2对引物,对PRV NP株的gE、gI基因进行了PCR扩增、回收、克隆、测序,测序结果与预期的PRV gE、gI基因片段相符。同源性比对分析结果显示,PRV NP株gE、gI基因推导的氨基酸序列与国内分离的PRV毒株的同源性分别为95.7%~99.8%、89.9%~99.5%。遗传进化树分析和氨基酸序列比对结果发现PRV NP株的gE氨基酸序列发生变化的位点与2012年国内分离到的PRV流行株相同,从而推测NP株为PRV变异毒株,本研究为PRV的流行病学调查分析奠定了基础,也为开发科学、有效的新型猪伪狂犬病(PR)疫苗提供科学依据。     

鸭瘟病毒CHv株UL34基因的克隆及分子特性分析

通过生物信息学分析、斑点杂交实验、克隆和测序证实了本实验室构建鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)CHv株基因文库时新分离的基因(GenBank登录号EF643562)为DPV UL34基因,进一步运用有关分子生物学软件对该基因进行了分子特性分析。结果表明,该基因大小为831bp,编码276个氨基酸的多肽,含有疱疹病毒UL34类似蛋白家族保守区。系统进化树分析显示,其与α疱疹病毒亚科中马立克病毒属的GaHV-2,GaHV-3,MeHV-1,EHV-1和水痘病毒属的CeHV-9,HHV-3的亲缘关系最近,揭示DPV-CHv株应该被划为α疱疹病毒亚科中的单独一类。该编码蛋白在252～274位氨基酸有一个明显的跨膜区,C末端有一微体靶向序列(ARL),但无信号肽;含有4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,3个蛋白激酶C磷酸化位点,5个N-豆蔻酰化位点和1个N-糖基化位点;亚细胞定位主要位于细胞核;密码子偏爱性分析显示其偏爱的密码子第3位碱基多以A和T结尾,属于低表达基因;不同密码子使用频率与酵母、大肠杆菌和人的密码子使用频率比较表明,其与大肠杆菌和酵母较接近,与人差异较大。该分析结果揭示DPV UL34基因为一C端锚定的Ⅱ型膜蛋白基因,体外表达选择大肠杆菌和酵母表达系统较为合适,同时该结果也为进一步开展DPV UL34基因的生物学功能研究具有一定的参考作用。     

表达Ⅰ型鸭甲肝病毒VP1基因的重组鸭瘟病毒的构建

扩增鸭瘟病毒(DPV)生长非必需区的TK基因,并在其中间引入Bgl II酶切位点,再之克隆到pUC19载体,获得载体pTK。用限制性内切酶从已有质粒pcDNA-LacZ上切下CMV启动子、多克隆位点、SV40及LacZ的完整的基因表达盒,插入到pTK的TK基因中,获得质粒pTCL。用质粒T-VP1做模板,扩增出I型鸭甲肝病毒(以前称为血清I型鸭肝炎病毒)VP1基因,克隆到质粒pTCL表达盒的多克隆位点KpnI与XbaI之间,构建含LacZ及VP1基因的转移载体质粒pT-CL-VP1。将此转移载体与鸭瘟病毒C-KCE毒株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经蓝斑克隆筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的表达I型鸭甲肝病毒VP1基因的重组鸭瘟病毒。     

表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭瘟病毒的构建

利用PCR技术扩增出鸭瘟病毒(DPV)生长非必需区的TK基因(约2.5kb),将其克隆入pUC19载体获得载体puDTK。根据已知载体pcDNA-LacZ的序列设计了一对引物,PCR扩增出pcDNA-LacZ上含CMV启动子、多克隆位点、SV40及LacZ的完整的基因表达盒插入puDTK的TK上,获得质粒puDTCL。根据Genbank已发表的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(HA)基因序列,设计引物从T-HA质粒上扩增出HA基因,克隆到puDTCL的表达盒的多克隆位点NheI与ApaI之间,成功构建含LacZ及HA基因的转移载体质粒puDTCL-HA。将这载体质粒与DPV34F2疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经蓝斑克隆筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的表达HA基因的重组鸭瘟病毒。     

鸭瘟病毒TK基因缺失转移表达载体的构建

根据Gen Bank发表的鸭瘟病毒基因组序列设计1对引物,扩增出含完整TK基因及其上下游序列的长约2.0 kb片段。利用该片段5'端和3'端部分序列作为左右同源臂,其内构建有Pcmv-MCS-BGH pA及同向Psv40-lac Z-SV40 pA表达盒,同时在lacZ基因表达盒两侧设计有loxP序列,从而获得鸭瘟病毒TK基因缺失转移表达载体p DTK-lacZ。将p DTK-lacZ转染鸡胚成纤维(CEF)细胞,原位染色后镜下可见多处着染蓝色的细胞,结果表明本试验构建出适用于重组鸭瘟病毒制备平台的转移表达载体。     

鸭瘟病毒DNA的快速诊断研究

根据文献报道的鸭瘟病毒基因序列，设计合成了一对引物，其扩增跨幅为498bp。用这对引物，以采用纯水直接研磨临床病料组织再按常规酚一氟仿抽提DNA的方法制备模板，对2株鸭瘟病毒进行扩增，均获得了与设计大小相符的明亮条带，为阳性；而对其他7株非鸭瘟病毒病料的基因扩增不出任何条带，为阴性；以该PCR方法检测14份DPV临床病料，均为阳性，与病毒分离和血清中和试验的结果一致。敏感性试验表明可检测到10fg的鸭瘟病毒DNA模板。研究建立的直接从临床样品微量检测DPV的PCR方法，能达到鸭瘟病毒基因的快速诊断要求。     

伪狂犬病病毒Fa株gI和gp63基因缺失株的构建

用限制性核酸内切酶ＮｃｏＩ消化含有伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）Ｆａ侏ＢａｍＨＩ－７片段的质粒ＰＰＢ７，以低融点琼脂糖回收目的片段，经连接并转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ｄ，获得缺失３ｇＩ和部分ｇｐ６３基因的重组质粒ＰＰＢ７－１。将ＰＲＶ Ｆａ与ＰＰＢ７－１ ＤＮＡ共同转染ＰＫ１５单层细胞，待出现５０％以上细胞病变时收获病毒，并以蚀斑法得到纯化重组病毒株，命名为ＰＦＤＩ／Ｄ６３。小鼠试验证实缺失株对小鼠具有一定     

猪瘟病毒囊膜糖蛋白DNA疫苗的研制

构建了含有猪瘟病毒石门株囊膜糖蛋白（Ｅ２）基因的重组真核表达质粒ｐＲＣＳＥ２。将ｐＲＣＳＥ２和空载体ｐＲＣ分别免疫小鼠,ＥＬＩＳＡ检测结果表明：仅ｐＲＣＳＥ２免疫鼠可以产生猪瘟病毒的特异抗体。ＤＮＡ疫苗在许多传染病研究中已取得可喜成果,因此猪瘟病毒ＤＮＡ疫苗可能会成为防制猪瘟的一条新的途径。     

犬瘟热病毒OP株囊膜糖蛋白H基因的克隆与表达

根据发表的犬瘟热病毒OP－CDV毒株序列设计两对引物，以犬瘟热病毒OP－CDV株感染Vero细胞收获病毒提取的RNA为模板，做RT－PCR扩增出H基因的5'端和3' 端大小为945bp、904bp的两个片段，两片段部分重叠，覆盖了H基因的全部编码序列。将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进pGEX-6P-1载体中谷胱甘肽－S－转移酶（GST）基因的下游，将重组质粒转化进宿主菌BL21中，在37℃ 1.0mM IRTG诱导下，H基因分段获得了良好的表达，表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，确定其表达的融合蛋白质大小分别为59kDa、58kDa，将表达产物回收后混合免疫小鼠。IFA显示免疫小鼠血清能与病毒感染细胞呈现特异反应，表明体外表达H基因保留了天然蛋白部分抗原性。