大鼠脑皮质微血管内皮细胞的分离和培养

目的： 本研究旨在探索1种有效分离、培养和获取较高纯度大鼠脑微血管内皮细胞（BMECs）的方法。方法: 自12 d SD大鼠脑分离出皮质，采用二次酶消化、BSA和Percoll非连续梯度离心获得较纯的脑微血管段后，接种于涂布有明胶的培养皿进行原代培养；相差显微镜观察细胞的形态学特性，进行血管内皮细胞特异性标志物Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测。结果: 培养24 h即可见细胞从贴壁的脑微血管段周围爬出，细胞呈短梭形，集落呈典型的“鹅卵石样”，区域性单层生长，6-7 d内皮细胞开始融合，血管内皮细胞特异性标志物Ⅷ因子相关抗原表达阳性，纯度达92.6%。结论: 成功地自大鼠脑皮质分离并培养出纯度较高的BMECs，为进一步开展脑微血管内皮细胞的生物学特性的相关研究提供有用的方法。     

大鼠脑微血管内皮细胞的培养

目的:探索一种简便易行、可培养出高纯度大鼠脑微血管内皮细胞的方法。方法:1月龄SD大鼠,解剖得到大脑皮质,密度离心法获得较纯的脑微血管段后进行原代培养,传代采用差速消化和贴壁方法进行纯化。通过形态学观察及第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测对培养细胞进行鉴定。结果:密度离心法分离出的大量微血管段呈"串珠样"结构,培养24h可见短梭形、多角形细胞,8～10天基本融合。第2代细胞经免疫荧光染色,第Ⅷ因子相关抗原呈阳性,阳性率达90%。结论:原代细胞采用低分子量葡聚糖加Percoll密度离心法、传代细胞采用差速消化和差速贴壁法纯化可成功培养高纯度的脑微血管内皮细胞。     

大鼠脑动脉内皮细胞培养

目的:探讨获取高纯度的原代SD大鼠脑动脉内皮细胞(cerebral artery endothelial cell,CAEC)的培养方法。方法:选取5~6周SD雄性大鼠6只,体重110~140 g,取大脑,取脑动脉,剪碎,接种于明胶包被的直径35 mm培养皿中,内皮细胞培养基培养;采用倒置显微镜观察内皮细胞生长状况及其形态;免疫荧光法检测动脉内皮标志物Ⅷ因子相关抗原的表达。结果:培养60 h后可见细胞从贴壁的血管片段周围长出,细胞呈梭形;培养7 d后细胞可融合成片,融合后的脑动脉细胞呈典型的"鹅卵石"样外观;免疫荧光法检测显示动脉内皮标志物Ⅷ因子相关抗原表达阳性,内皮细胞纯度90%以上。结论:该方法能够成功获得纯度较高的原代SD大鼠脑动脉内皮细胞。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的分离、培养原代脑微血管内皮细胞,建立体外血脑屏障模型。同时探索高纯度、活性好的脑微血管内皮细胞的分离培养方法。方法取3周大鼠大脑,分离皮质,经过匀浆、葡聚糖离心以及消化后,取纯度较高的脑微血管段种植于胶原蛋白包被过的塑料培养瓶中进行培养。显微镜观察及检测Ⅷ因子相关抗原。结果镜下细胞呈长梭形。7d左右细胞可融合,Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测为阳性．且阳性细胞占绝大部分。结论本实验成功分离大鼠脑微血管内皮细胞,并进行原代培养,为脑微血管内皮细胞的进一步研究提供了模型．也为构建更高级的大鼠体外血脑屏障奠定基础。     

大鼠肺微血管内皮细胞的培养

目的建立简单有效地获取大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)的培养方法。方法从实验动物、培养基、植块方法、胎牛血清浓度等方面对植块培养法进行改进,应用W istar雄性大鼠的肺组织,进行PMVEC的原代培养并传代培养;通过倒置显微镜、扫描、透射电镜观察其形态,并进行免疫组织化学鉴定。结果体外培养的大鼠PMVEC呈梭形或多角形,形成单层后呈典型的鹅卵石样或铺路石样排列,获得的血管内皮细胞纯度较高,抗Ⅷ因子阳性反应,成功建立了PMVEC的原代培养方法。结论改进的植块培养法简便、可靠,获得的PMVEC纯度高,生长状态良好,保持了内皮细胞的结构和功能,可用于其功能特性的进一步研究。     

大鼠肺微血管内皮细胞培养及其粘弹性研究

为了建立肺微血管内皮细胞培养方法 ,研究肺微血管内皮细胞粘弹性。我们取大鼠肺周边组织 (宽度不应大于 1.5 mm) ,将组织剪成 1.5 mm× 1mm× 1mm的组织块 ,贴入无菌的 2 5 cm3培养瓶 ,每瓶 10～ 15块 ,同时加入含 2 0胎牛血清、肝素 90 U/ml、L-谷氨酰胺 4mmol、青霉素 10 0 U/ml和链霉素 10 0 μg/ml的 DMEM培养基 3ml,放入 37℃二氧化碳培养箱中静置培养 ;8h后翻转培养瓶 ,6 0 h后取出肺组织块 ,接着继续培养 2～ 4d后进行传代。最后消化分离肺微血管内皮细胞 ,用微管吸吮系统研究肺微血管内皮细胞粘弹性。结果显示 :肺微血管内皮细胞通过倒置相差显微镜观察 ,细胞呈鹅卵石镶嵌状排列 ,状如梭形或多角形 ,大小均匀 ,胞核清晰 ,呈卵圆形 ,胞浆丰富 ; 因子相关抗原免疫荧光染色呈阳性 ;肺微血管内皮细胞弹性模量 K1 =49.3± 9.2 Pa、K2 =73.2±2 4.8Pa、粘性系数 μ=19.2± 7.2 Pa.s。这些结果表明用组织块法培养肺微血管内皮细胞是可行的 ,肺微血管内皮细胞表现出较大的刚性     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养及缓激肽的作用靶细胞探讨

目的建立稳定的原代大鼠脑微血管内皮细胞培养方法,并在体外探讨不同剂量缓激肽的作用靶细胞,进一步阐释缓激肽开放血脑和血肿瘤屏障的机理。方法运用免疫荧光测定原代培养的脑血管内皮细胞、星形胶质细胞及C6胶质瘤细胞在不同剂量缓激肽作用前后的细胞内钙离子变化,根据给药前后的荧光改变来确定不同剂量缓激肽的作用靶点细胞。结果小剂量缓激肽(终浓度:1μmol/L)可以引起C6胶质瘤细胞内的钙离子水平升高,而只有大剂量(终浓度:10μmol/L~1mmol/L)缓激肽才能触发星形胶质细胞内的钙离子水平升高,脑微血管内皮细胞对大、小剂量缓激肽均无任何反应。结论缓激肽的直接作用靶点是胶质细胞及C6胶质瘤细胞,缓激肽调节脑血管内皮细胞通透性的作用可能需要某些细胞间信使的参与。     

大鼠胰岛微血管内皮细胞分离、纯化与培养的改进

目的：建立稳定可靠的大鼠胰岛微血管内皮细胞分离培养方法。方法：分离纯化大鼠胰岛后进行内皮细胞选择性培养，使用UEA-1包被的免疫磁珠对胰岛微血管内皮细胞进行纯化。免疫荧光法检测经典的内皮细胞标志物第Ⅷ因子相关抗原（vWF）和CD34的表达和吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-Ac-LDL）能力。结果：胰岛培养4-5 d后，可见内皮细胞从贴壁的胰岛内爬出，通过UEA-1包被的免疫磁珠筛选出胰岛微血管内皮细胞接种后24 h细胞开始贴壁。该细胞具有单层生长、接触抑制的特性。大鼠胰岛微血管内皮细胞表达vWF和CD34，可摄取Dil-Ac-LDL。结论：本研究方法是一种较为高效的分离、纯化和培养大鼠胰岛微血管内皮细胞的方法。     

小鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与纯化

目的:探讨纯度较高的小鼠脑微血管内皮细胞的分离与原代培养。方法:取8～14周龄BALB/c或C57/BL6小鼠,无菌分离脑组织,采用改进的两种方法即2次酶消化和1次密度梯度离心法及1次酶消化和1次密度梯度离心法分离小鼠脑微血管段,接种于涂布有Ⅳ型胶原的培养皿上进行原代培养,相差显微镜下观察细胞形态,并以免疫荧光法鉴定Ⅷ因子相关抗原。结果:改进的两种方法均可见内皮细胞在接种后12～16 h从微血管段周围爬出,5～7 d时细胞呈"漩涡状"生长,并可见细胞汇合,90%以上培养的细胞Ⅷ因子相关抗原表达阳性。结论:改进后的两种方法均能进行较高纯度的小鼠腑微血管内皮细胞的分离和原代培养。     

改良原代大鼠脑微血管内皮细胞的培养方法及鉴定

目的 改良原代大鼠脑微血管内皮细胞分离培养方法。方法 选取4～6周龄SD大鼠6只,经开颅取脑、漂洗剪碎、过筛、牛血清白蛋白密度梯度离心、Ⅱ型胶原酶及胶原酶-分散酶两次连续酶消化后进行原代培养。通过细胞形态学观察和第Ⅷ因子免疫细胞化学染色鉴定所培养的目的细胞。结果 体外培养12～24 h后,细胞以贴壁的脑微血管段为中心,放射状向外周移行,并逐渐扩大成团簇状;细胞融合后则呈典型的单层、扁平、“铺路石样”镶嵌式排列。第Ⅷ因子免疫细胞化学染色检测,胞质呈棕红色,表达为阳性,阳性细胞率达99％以上。结论 改良方法能够成功高效分离培养出原代大鼠脑微血管内皮细胞。     

凝集素受体在正常及损伤大鼠脑微血管内皮细胞的表达

为明确脑微血管内皮细胞表面糖蛋白的变化，应用凝集素亲和组织化学的方法在石蜡切片上显示荆豆凝集素（ＵＥＡ－１）、麦胚凝集素（ＷＧＡ）和花生凝集素（ＰＮＡ）受体在正常和损伤大鼠脑微血管内皮细胞的表达。结果表明，正常大鼠、失血休克和失血再灌注大鼠脑微血管均无ＵＥＡ－１受体的表达，与文献报道的种属差异性一致，而ＷＧＡ和ＰＮＡ受体在正常和损伤时均主要存在于软脑膜血管内皮细胞，仅少数浅层皮质毛细血管阳性，显示了同一器官内不同区域血管的差异性。ＰＮＡ受体在正常软脑膜血管内皮细胞的表达为２５％，失血休克时增加到７５％，短暂的失血再灌注后基本恢复正常。用三种莨菪类药物（解痉灵、樟柳碱和６５４－２）防治后，除解痉灵外，ＰＮＡ受体的表达基本恢复正常。ＷＧＡ受体在正常软脑膜的表达为７５％，失血和失血再灌注后表达稍增强为１００％，解痉灵和６５４－２预防未显示明显作用，樟柳碱使其表达下降至５０％。上述结果明确显示了（１）脑软膜微血管与脑实质微血管内皮细胞表面糖蛋白存在差异，推测与血管的功能、代谢有密切关系；（２）微血管内皮细胞损伤后脑软膜微血管内皮细胞的ＰＮＡ和ＷＧＡ受体表达呈不同程度的上调；（３）部分莨菪类药物对内皮损伤时ＰＮＡ和Ｗ?     

改良的大鼠心肌微血管内皮细胞培养方法

目的:改良大鼠心肌微血管内皮细胞(MMVECs)培养方法,提高细胞收获量和细胞纯度。方法:选择6～8周龄Wistar雄性大鼠,腹腔内注射200U肝素,摘取左心室剪成若干2mm3小块接种于培养皿中,待其贴壁后,加入含有肝素的DMEM高糖培养液,换液、去除组织块、消化、传代,取第二代MMVECs进行细胞形态学和免疫组化、免疫荧光染色鉴定。结果:贴块法培养48h可见组织块周围有细胞长出,70h长出较多,去组织块后再培养36h,细胞生长至80%～90%融合,呈典型铺路石样。免疫组化和免疫荧光染色证实培养细胞CD31、CD34和Ⅷ因子相关抗原染色均呈阳性,且纯度较高。结论:采用心肌组织贴块及培养液中加入肝素培养的方法可获得高纯度的MMVECs,方法简单,结果可靠。     

药物对C反应蛋白诱导脑微血管内皮细胞黏附分子表达的作用

目的探讨一些药物对C反应蛋白（CRP）诱导脑微血管内皮细胞黏附分子表达的作用，为缺血性脑损伤机制及防治策略的进一步研究提供理论依据。方法培养脑微血管内皮细胞（bEnd．3），经辛伐他汀、吡格列酮、Heroin和AG490预处理后与CRP共孵育，采用免疫蛋白印迹（Westernblot-ting）检测细胞黏附分子表达。结果CRP能显著诱导bEnd．3细胞表达细胞间黏附分子（ICAM-1）、血管细胞黏附分子（VCAM-1），信号转导子及转录激活子-3（STA33）酪氨酸残基快速磷酸化。辛伐他汀、吡格列酮和AG490均能显著减少ICAM-1、VCAM-1的表达。结论CRP上调黏附分子表达的作用可能与JAK／STAT信号转导通路有关。辛伐他汀、吡格列酮均能抑制CRP诱导的脑内皮细胞ICAM-1、VCAM-1表达，可能是它们对缺血性脑损伤的保护机制之一。     

压力、剪应力和川芎嗪对大鼠脑微血管内皮细胞血管生成的影响

为探讨剪应力、压力和川芎嗪对血管生成的影响,采用体外培养的大鼠脑微血管内皮细胞(rCMEC),用自制的可独自调节压力和剪应力的平板剪切装置预处理,再进行Matrigel体外三维培养.结果表明,在两个组合条件(分别为20dyn/cm2剪应力、0 mmHg压力、63μg/ml川芎嗪与10dyn/cm2剪应力、40mmHg压力、126μg/ml川芎嗪)与对照之间,内皮细胞血管生成有显著差异(P＜0.01),不同实验条件下不同时间血管生成亦有显著差异(P＜0.01).结果提示,适当水平的剪应力、压力和川芎嗪联合作用可能明显改变内皮细胞的血管生成.     

压力、剪应力和川芎嗪对大鼠脑微血管内皮细胞凋亡和细胞周期的影响

为探讨剪应力、压力和川芎嗪对血管内皮细胞的细胞周期和凋亡的影响,以自制的可独自调节压力和剪应力的平板剪切装置提供剪应力和压力,与川芎嗪三者共同作用于大鼠脑微血管内皮细胞(rCMEC),采用流式细胞术检测剪应力、压力和川芎嗪对rCMEC细胞周期和凋亡的影响.结果表明,在两个组合条件(分别为20 dyn/cm2剪应力、0 mmHg压力、63μg/ml川芎嗪与10 dyn/cm2剪应力、40 mmHg压力、126μg/ml川芎嗪)下,内皮细胞的细胞周期与对照组无显著差异(P＞0.05),而凋亡率则明显低于对照组(P＜0.01).结果提示,适当水平的剪应力、压力和川芎嗪联合作用可能明显抑制rCMEC凋亡.     

凝血酶对大鼠脑微血管内皮细胞的影响

目的 :探讨凝血酶 (Thrombin ,TM )对脑微血管内皮的影响。方法 :将大鼠脑微血管内皮细胞进行培养 ,培养液中加入 10U的TM或10U的TM + 0 .4mU的组织蛋白酶G(CaspethsinG ,CATG ) ,相差显微镜动态观察内皮细胞形态的变化 ,免疫组织化学技术检测基质金属蛋白酶 2 (MatrixMetalloproteinase 2 ,MMP 2 )表达的改变。 结果 :TM使内皮细胞发生收缩 ,细胞收缩程度具有时间依赖性 ,使内皮细胞MMP 2表达水平明显增加。TM +CATG加入培养液后 ,细胞形态、MMP 2表达与对照组比较均无明显统计学差异 (P >0 .0 5 )。结论 :TM通过激活蛋白酶激活受体 1(proteaseactivatedreceptor 1,PAR 1) ,使内皮细胞发生收缩 ,促进MMP 2表达 ,是TM增加血脑屏障 (BloodBrainBarrier,BBB)通透性的可能机制。