PEI2k-SPIO纳米颗粒标记大鼠骨髓间充质干细胞的体外磁共振成像

目的明确经修饰的多聚乙烯-超顺磁性氧化铁(PEI2k-SPIO)纳米颗粒体外标记大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的最佳浓度,以及标记后BMSCs的磁共振成像(MRI)特征、可成像的最低标记细胞量和最佳成像细胞量。方法取第二代大鼠BMSCs接种于投放有盖玻片的6孔板内,分别加入浓度为5μg/mL、7μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL铁浓度的PEI2k-SPIO液,而后行普鲁士兰染色,观察不同标记浓度对细胞生物学活性的影响;采用四唑盐(MTT)比色法,分析不同浓度的PEI2k-SPIO液对大鼠BMSCs生长活性的影响,并确定PEI2k-SPIO纳米复合颗粒标记干细胞的最佳阈值;取最佳阈值的PEI2k-SPIO标记BMCSs,经磁共振成像,确定成像所需最低细胞量及最佳成像细胞量。结果 PEI2k-SPIO标记BMSCs的最佳浓度是7μg/mL,该标记浓度下细胞生物活性不受影响;在7μg/mL PEI2k-SPIO培养液标记浓度下,MRI的最低细胞量为1×104,最佳成像细胞量为1×106。结论适当浓度的PEI2k-SPIO标记BMSCs对其生物学活性没有影响,MRI可敏感显像PEI2k-SPIO标记的BMSCs。     

SPIO标记下大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性及多向分化潜能及体外MR成像

【目的】探讨超顺磁氧化铁纳米颗粒（SPIO）标记对骨髓间充质干细胞生物学特性和多向分化潜能的影响以及体外磁共振（MRI）成像的可行性,为移植干细胞活体MRI成像提供实验基础。【方法】采用梯度密度离心法和贴壁法获取大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）,采用25μg/mLSPIO联合0.75μg/mL多聚赖氨酸（PLL）标记BMSC,比较标记和未标记MSC细胞活力、增值、细胞周期、凋亡和成骨、成脂多向分化能力;应用1.5TMR对不同数量级细胞分别进行T1WI、T2WI和T2＊WI序列扫描。【结果】普鲁士兰染色显示SPIO（25μgFe/mL,48h）对细胞的标记率接近100%,细胞活力、增殖、周期和凋亡检测,均显示SPIO标记细胞与未标记细胞间无统计学差异（P〉0.05）;成骨、成脂诱导显示,BMSC和标记BMSC均具备成骨、成脂分化能力;对不同数量级的SPIO标记BMSC行MR扫描,T1WI、T2WI和T2＊WI能检测到的最小数量级细胞分别为2×10^4,1×10^4,0.5×10^4,呈低信号。【结论】25μg/mLSPIO联合0.75μg/mLPLL能有效标记BMSC,不影响BMSC的活力、增值、细胞周期、凋亡和多向分化能力,1.5TMR示踪标记细胞可行,与T1WI和T2WI序列相比,T2＊WI最敏感。     

SPIO 标记下大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性及 多向分化潜能及体外MR成像

 【目的】 探讨超顺磁氧化铁纳米颗粒(SPIO)标记对骨髓间充质干细胞生物学特性和多向分化潜能的影响以及体外磁共振(MRI)成像的可行性,为移植干细胞活体MRI成像提供实验基础｡ 【方法】 采用梯度密度离心法和贴壁法获取大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC),采用25 μg/mL SPIO联合0.75 μg/mL多聚赖氨酸(PLL)标记BMSC,比较标记和未标记MSC细胞活力､增值､细胞周期､凋亡和成骨､成脂多向分化能力;应用1.5T MR对不同数量级细胞分别进行T1WI､ T2WI和T2*WI序列扫描｡ 【结果】 普鲁士兰染色显示SPIO(25 μg Fe/mL, 48 h)对细胞的标记率接近100%,细胞活力､增殖､周期和凋亡检测,均显示SPIO标记细胞与未标记细胞间无统计学差异(P > 0.05);成骨､成脂诱导显示,BMSC和标记BMSC均具备成骨､成脂分化能力;对不同数量级的SPIO标记BMSC行MR扫描,T1WI､ T2WI和T2*WI能检测到的最小数量级细胞分别为2 × 104, 1 × 104, 0.5 × 104, 呈低信号｡ 【结论】 25 μg/mL SPIO联合0.75 μg/mL PLL能有效标记BMSC,不影响BMSC的活力､增值､细胞周期､凋亡和多向分化能力,1.5T MR示踪标记细胞可行,与T1WI和T2WI序列相比,T2*WI最敏感｡     

超顺磁性氧化铁颗粒标记对大鼠骨髓间充质干细胞活力的影响

目的:探讨利用超顺磁性氧化铁颗粒(SHU555A)体外标记大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)对细胞活力的影响.方法:分别使用不同铁浓度(35、70、140和210 mg/L)的SHU555A标记大鼠BMSCs,分别于标记后1 d及1、2、3周行普鲁士蓝染色观察铁纳米颗粒进入细胞情况,台盼蓝排除试验检测细胞活力.结果:普鲁士蓝染色显示标记的大鼠BMSCs胞质内存在细小蓝色铁颗粒,标记率100%;台盼蓝染色显示标记时间对BMSCs活力无影响.铁浓度为35 mg/L时对标记的细胞活力无影响,大于该浓度则细胞活力下降.结论:35 ms/L的铁纳米颗粒可用于大鼠BMSOs标记.     

体外纳米磁标记骨髓间充质干细胞生物学特性及其MR成像

目的 研究超顺磁性氧化铁粒子(superparamagnetic iron oxide particles,SPIO)体外标记兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)及MR细胞成像示踪可行性.方法 从兔骨髓中分离培养MSCs,体外不同浓度SPIO联合硫酸鱼精蛋白标记,未标记细胞设为对照组.普鲁士蓝染色和电镜检查鉴定细胞内铁颗粒,台盼蓝染色检测细胞存活,MTF法测定细胞生长曲线的变化,磁标记MSCs转入成骨、成脂肪培养基中进行诱导培养后进行鉴定,应用1.5T MR梯度回波T2加权(GRE T2 *WI)扫描序列和自旋回波T2加权(SE T2WI)扫描序列对磁标记细胞成像示踪.结果 普鲁士蓝染色和电镜检查显示细胞质内含致密铁颗粒,磁标记对MSCs活性和增殖无统计学差异(P<0.05),标记细胞可正常成骨、成脂肪分化.GRE T2*WI序列和SE T2WI序列提示与未标记细胞信号强度(sI)相比,1×106(标记细胞)、5×105(标记细胞)SI均显著性下降(P<0.05),其中GRE T2*WI的信号强度衰减率(△SI)显著高于T2WI序列(P<0.05).在2个序列中1×106(标记细胞)△SI均高于5×105(标记细胞)△SI,但不具有显著性差异(P>0.05).结论 SPIO联合硫酸鱼精蛋白转染剂能成功标记MSCs,磁标记对细胞存活、增殖及潜在多向分化能力无影响.磁标记细胞在MR上产生特征性的低信号改变.应用1.5T MR成像示踪标记细胞可行,以GRE T2*WI序列成像最为敏感.     

超顺磁性氧化铁标记大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的探讨应用超顺磁性氧化铁（superparamagnetic iron oxid,SPIO）标记间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSCs）的有效性、安全性及可靠性。方法分离、培养SD大鼠MSCs,通过流式细胞仪分析鉴定表面抗原CD34、CD44。选取第4代MSCs,在铁（Fe）浓度为25、50、75μg.ml-1和多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine,PLL,0.75μg.ml-1）的DMEM/F12培养液中,孵育48h,作为3个实验组。通过普鲁士蓝染色、流式细胞仪检测、台盼蓝染色及MTT细胞增殖活性检测SPIO,探讨不同SPIO浓度对MSCs标记效率、免疫学表型、细胞活性及增殖的影响。结果经Fe浓度为25、50、75μg.ml-1SPIO标记后,普鲁士蓝染色标记效率均在99%以上;3个实验组细胞表面均表达CD44,阳性细胞率为超过98%。与对照组相比,Fe浓度为25、50μg.ml-1的SPIO标记的MSCs活细胞比率均在96%左右,细胞增殖活性差异无统计学意义,而Fe浓度为75μg.ml-1时,活细胞比率约为93%,对细胞的增殖有明显的抑制作用（P〈0.05）。培养4周,细胞内检测不到SPIO。结论全骨髓直接贴壁法可以成功分离、培养MSCs。超顺磁性氧化铁在PLL介导下,能高效地标记MSC,且在合适的浓度范围不会影响MSCs的免疫学表型、细胞活性及增殖能力等生物学特性。细胞内的SPIO,大约在4周左右,即可被完全降解。     

骨髓间充质干细胞的体内示踪及其修复椎间盘退变的实验研究

目的: 探讨骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stromal cells,MSCs)的标记与体内示踪方法,及其治疗椎间盘退变的可行性.方法:取兔MSCs行体外培养,并在体外纯化扩增,用超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO)磁粒子标记后分别于1、3、5、7 d用MTT法检测细胞活性.将标记后的细胞植入退变的椎间盘内.分别于2、4、6、8周用间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖含量的变化,免疫组化法测定Ⅱ型胶原含量的变化,用MR扫描对标记干细胞在椎间盘内分布进行示踪.所得数据进行统计学处理.结果:MTT法结果显示,SPIO对MSCs的生物活性无影响,MSCs能被SPIO有效标记.运用MR扫描可观察到其在体内的分布,并发现干细胞向周边发生了迁徙.8周内实验组髓核蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量高于模型组,差异有统计学意义.结论:SPIO可有效地标记MSCs并行体内活体示踪,且不影响细胞活性,是理想的示踪剂.SPIO标记后的MSCs移植能增加髓核中细胞外基质的含量,从而延缓椎间盘退变.     

磁标记骨髓间充质干细胞对不同转移潜能肝癌细胞作用的研究

目的探讨磁标记骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)对具有不同转移潜能肝癌细胞的作用。方法采用全骨髓培养法分离培养BMSCs,流式细胞仪测定BMSCs表面分子CD29、CD44、CD45。对BMSCs进行超顺磁性氧化铁(SPIO)标记。对SPIO标记BMSCs分别与高低转移性肝癌细胞MHCC97-H和MHCC97-L的共培养及流式细胞仪鉴定。结果普鲁士蓝染色显示BMSCs的磁标记率近95%,CD29、CD44呈阳性表达。SPIO标记BMSCs对高低转移性肝癌细胞的生长均有抑制作用,组间和组内比较均有明显差异,P<0.05。结论 SPIO标记BMSCs对高低转移性肝癌细胞具有抑制作用,其机制有待于进一步研究。     

超顺磁性氧化铁标记大鼠骨髓间充质干细胞的磁共振成像研究

目的:探讨超顺磁性氧化铁纳米粒子(Superparamagnetic iron oxide,SPIO)体外标记大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的适当浓度和不同标记浓度对细胞的生物学活性影响,以及经MR成像的特征等.方法:选取第5代细胞进行不同浓度SPIO标记,运用光学显微镜观察铁颗粒在细胞内的位置、分布及标记率;选取适当浓度标记量,使用1.5T磁共振进行T1wI、T2WI、T2*WI扫描,测量不同扫描序列标记细胞管的信号强度改变,并进行统计学分析.结果:标记后的铁颗粒均位于细胞质内;含量在25～50μg Fe/ml的培养液是SPIO标记干细胞的安全浓度,在此浓度阈值标记后孵育24 h即可有效标记细胞97%～100%;SPIO标记的MSCs在T1WI,T2WI及T2*WI序列信号均降低.结论:SPIO可以简便标记MSCs.并且在适当浓度下对MSCs的生物学活性没有影响,MR T2WI和T2*WI序列可有效显像磁性标记的干细胞,为下一步活体试验奠定基础.     

影像学对骨髓间质干细胞治疗脑卒中实验效果的评价

T1、短T2信号,14 d及28 d低信号向梗死病灶方向弥散,强度减低.结论 CTPI和MRI影像技术可以从形态学及血流动力学方面观察MSCs治疗缺血性脑卒中的疗效,磁标记MSCs的MRI检查实现了活体追踪标记细胞在脑内的存活、迁移及分化.     

Distribution and differentiation of mesenchymal stem cells in tumor tissue

Background Tumor has an ability to become enriched in mesenchymal stem cells （MSCs） and of guiding MSCs to migrate to tumor tissue. But there are lack of relevant reports on the distribution and differentiation of MSCs in tumor tissue and the effect on tumor growth after MSCs engrafted in tumor tissue. In this study, we observed the distribution of bone marrow MSCs in tumor tissue and the possibility of MSCs differentiating into myofibroblast under the induction of local tumor microenvironment.
Methods Twenty-four New Zealand rabbits were randomly classified into the control group and the test group. MSCs were isolated and cultured for each animal, vx-2 tumor tissue was transplanted under the bladder mucosa of each animal One week after the transplantation, the self F2 passage MSCs marked by 4＇,6-diamidino-2-phenylindole were transplanted into tumor tissue in the test group while only Dulbecco＇s modified Eagle＇s medium-low glucose was infused into the control group. Ultrasonography was performed for each animal 1, 2, 3 and 4 week（s） after the vx-2 tumor mass was transplanted. The maximum bladder tumor diameter of each animal was recorded and the mean value of each group was calculated. One animal from each group was sacrificed in the third week and the remaining animals in the fourth week to observe the tumor development. Another animal treated the same as the test group was sacrificed to observe the distribution of MSCs in tumor tissue one week after self MSCs transplantation. Immunofluorescence was used to trace MSCs in tumor tissue. The double labeling immunofluorescence for α-smooth muscle actin （α-SMA） and vimentin was performed to identify whether the MSCs can differentiate into myofibroblast.
Results The ultrasonography showed no tumor mass one week after the vx-2 tumor mass transplantation. The mean maximum tumor diameter of the control group and test group was （0.70±0.14） cm and （0.78±0.14） cm, respectively, and there was no significant difference （t=1.308, P=0.204）. The tumor growth rate of the test group increased gradually in the third and fourth weeks, and the difference of the mean maximum tumor diameter between the two groups also increased gradually and was statistically significant （P 〈0.05）. MSCs distributed uniformly in tumor tissue one week after transplantation while most were distributed in the tumor stroma three weeks after transplantation. The double labeling immunofluorescence showed that the expression of α-SMA as well as Vimentin increased significantly three weeks after mesenchymal stem cells engrafted into tumor, indicating that MSCs had differentiated into myofibroblasts under the induction of the tumor microenvironment.
Conclusion MSCs can accelerate the tumor development and can differentiate into myofibroblast under the induction of tumor microenvironment.     

人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞诱导分化的实验研究

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（hMSCs）向血管内皮细胞（ECs）诱导分化的可行性。方法：用贴壁法从成人骨髓中分离出间充质干细胞,培养扩增后,加入10ng／ml的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和人血管内皮生长因子（hVEGF）向ECs诱导分化,分别于0、24d流式细胞术检测细胞表型及荧光染色鉴定细胞。结果：hMSCs向ECs诱导分化24d,细胞CD34、KDR转为阳性,CD54、CD106、vWF表达增加。可摄取ac—LDL,并可结合UEA。结论：hMSCs经bFGF和VEGF作用,分化为具有ECs的表型和部分功能的细胞。     

DMOG促进骨髓间充质干细胞血管新生作用的研究

目的探讨在缺氧缺血清环境下,脯氨酸羟化酶抑制剂———二甲基乙二酰甘氨酸（DMOG）促进骨髓间充质干细胞（MSCs）血管新生的作用及其机制。方法MSCs从大鼠骨髓中分离得到,分为：常氧条件下溶剂对照组（N-DMSO）、缺氧条件下溶剂对照组（H-DMSO）、20μMDMOG加药组（D-20滋M）、100滋MDMOG加药组（D-100滋M）及500μMDMOG加药组（D-500滋M）,观察以下指标：（1）通过缺氧条件下CCK-8检测DMOG在20μM、100μM及500滋M剂量下对MSCs的保护作用,确定DMOG的最佳剂量;（2）通过Matrigel实验观察DMOG促进MSCs血管新生的作用;（3）通过Westernblot法检测血管新生通路相关蛋白表达。结果（1）不同浓度组DMOG对缺氧损伤MSCs的影响：N-DMSO组OD值3.25±0.05,H-DMSO组2.23±0.14,D-20滋M组2.68±0.43,D-100滋M组3.11±0.25,D-500滋M组3.23±0.04。与N-DMSO组比较,H-DMSO组OD值降低（P＜0.01）,与H-DMSO组比较,D-20滋M组、D-100滋M组、D-500滋MOD值均升高（P＜0.05或0.01）。（2）不同浓度组DMOG对正常MSCs的影响：D-20滋M组3.19±0.02,D-100滋M组3.15±0.06,D-500滋M组2.51±0.08。与N-DMSO组比较,D-500滋M组OD值降低（P＜0.01）,D-20滋M组、D-100滋M组与N-DMSO组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）,提示DMOG在20滋M及100滋M对细胞无毒性。（3）血管新生相关蛋白的表达：与H-DMSO组相比,D-100μM组缺氧3、6及24hHIF-1α均增加（1.44±0.32vs7.79±0.23,2.4±0.28vs3.51±0.79,0.93±0.37vs2.46±0.07,P＜0.05或0.01）,pAKT则在缺氧6h增加（0.47±0.15vs0.71±0.03,P＜0.05）,VEGF在缺氧6、24h均增加（0.63±0.10vs0.87±0.14,0.42±0.06vs0.70±0.06,P＜0.05或0.01）,以缺氧24h最为显著。pmTOR/mTOR及pERK/ERK蛋白两组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论DMOG通过抑制HIF-1α降解及促进AKT磷酸化提高缺氧环境下MSCs的血管新生能力。     

间充质干细胞对肿瘤的影响及其应用于肿瘤治疗的前景

间充质干细胞（MSCs）在肿瘤的发生中扮演着重要角色,但它对肿瘤生长的影响存在争议,不同的研究表明MSCs可以促进或抑制肿瘤生长。同时,因MSCs对肿瘤的趋向性及低免疫原性,使其具备了应用于肿瘤治疗的潜力。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养和鉴定

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养方法及其生物学特性。方法采用全骨髓贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞,通过成骨、成脂肪诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记（CD29、CD34、CD45、CD90）等鉴定BMSCs特征。结果全骨髓贴壁培养法获得的BMSCs,原代和传代培养具有活跃的增殖能力;BMSCs经诱导后可分别向成骨、成脂转化;流式分析表面标志分子高表达CD90（96.5%）、CD29（92.3%）,低表达CD34（0.89%）、CD45（1.41%）。结论全骨髓贴壁培养法可有效地分离和扩增BMSCs,分离培养的BMSCs具有潜在的多向分化能力。     

诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的 明确大鼠骨髓间充质干细胞(bone mensenchymal stem cells,BMSCs)在体外全骨髓培养条件下的生物学特性及其向成骨细胞分化的能力,探索更为简便有效的BMSCs体外培养方法.方法 提取大鼠原代BMSCs,用酠EM完全培养基和成骨诱导条件培养基体外培养,倒置相差显微镜和HE染色观察细胞形态;台盼蓝活细胞计数绘制细胞生长曲线;ALP检测试剂盒检测ALP含量变化和von Kossa染色检测细胞矿化结节,以判断细胞是否向成骨细胞分化.结果 全骨髓培养法在体外培养的大鼠原代BMSCs贴壁生长,呈梭形或多角形;使用Dex-SaMEM向成骨诱导后的BMSCs具有与成骨细胞在体外培养时相似的特征,倍增时间延长;合成ALP能力显著增强(P<0.05),von Kossa染色出现阳性的棕褐色或棕黑色团块的钙化结节.结论 全骨髓培养法取材方便,经成骨诱导培养的BMSCs表现出成骨细胞的形态特征和生物学特性,该方法可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法.     

小鼠胚胎干细胞磁标记共振成像的研究

目的 应用超顺磁氧化铁（SPIO）标记小鼠胚胎干细胞（ESC）,并行磁共振成像,为心肌细胞移植体内示踪作初步准备。方法 小鼠ESC及其分化的心肌细胞与SPIO孵育后行电镜分析、细胞内铁含量测定、[Ca^2＋]共聚焦测定和MR成像。结果 铁颗粒分布在胞质吞饮小泡内;使用转染技术的铁摄取高于未使用组;T2WI和T2^＊ WI扫描序列均见标记细胞呈信号下降,程度随标记浓度的增加而增强;T2^＊ WI图像信号强度变化更大。标记心肌细胞在T2^＊ WI序列也呈显著的低信号改变。结论 SPIO可有效标记ESC及其分化的心肌细胞,对细胞活性和分化能力无明显影响。常规1．5TMR仪可进行标记细胞成像。     

小鼠骨髓间充质干细胞的体外培养和鉴定

目的采用全骨髓贴壁培养法分离和体外培养小鼠骨髓间充质干细胞,并通过形态学观察和排除鉴定法进行初步鉴定。方法无菌分离小鼠胫骨和股骨,剪开骨干骺端,用RPMI1640培养基反复液冲洗骨髓腔,收集并过滤离心。DMEM—LG培养基重悬细胞,将细胞悬液转入0．1％明胶包被的培养瓶中,37℃,5％CO2常规进行原代培养并传代。在培养过程中,取不同代数的细胞做CD45流式标记鉴定。结果采用全骨髓贴壁培养法获得的骨髓间充质干细胞贴壁时间短,增殖快,经传代后能够纯化。第4-5代骨髓间充质干细胞形态单一均匀,呈典型的极性漩涡状生长,并不表达白细胞标志抗原CD45。结论本实验可稳定获得均质性良好的小鼠骨髓问充质干细胞,并初步通过鉴定。     

兔骨髓间充质干细胞的制备及诱导成骨的实验研究

目的:在体外原代培养兔骨髓间充质干细胞,观察兔骨髓间充质干细胞的体外生长特性,为用于组织工程学的种子细胞培养提供实验基础。方法:自兔股骨、胫骨取骨髓,分离骨髓间充质干细胞,分别采用常规培养液及含矿化液的培养液两组进行培养,对第3代细胞进行酶动力学法碱性磷酸酶(ALP)活性检测及钙结节茜素红染色,观察细胞在体外长期培养时钙结节形成情况。结果:两组细胞其培养液中的ALP含量不断升高,经过两独立样本t检验,矿化液诱导组第2,6,10天的ALP水平较正常对照组均明显升高(P<0.05)。细胞表现出成骨细胞特性,在体外长期不传代培养时可形成钙结节。结论:兔骨髓间充质干细胞在体外适当的培养条件下,增殖能力很强,可以向成骨细胞方向分化,可作为组织工程学的种子细胞。