人类Survivin基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达

 目的　构建带有绿色荧光蛋白的Survivin基因真核表达载体pIRES2-EGFP／Survivin,并转染K562细胞。方法　以 pDNR／Survivin质粒为模板,PCR扩增Survivin基因,T-A 克隆,亚克隆至pIRES2-EGFP上,并对重组表达载体进行酶切、测序鉴定。采用Superfect转染试剂转染K562细胞。提取细胞RNA,RT-PCR检测Survivin基因mRNA表达。结果　经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP／Survivin载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的K562细胞有绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR证实转染细胞中存在Survivin基因mRNA的表达。结论　pIRES2-EGFP／Survivin表达载体构建成功,并在K562细胞内成功表达。     

基因CGI-100真核表达载体的构建及其对K562细胞增殖的影响

目的 构建CGI-100基因的真核表达载体并初步探讨其功能.方法 采用DNA重组技术,将CGI-100基因亚克隆至pIRES2-EGFP真核表达质粒中,重组为pIRES2-EGFP- CGI-100,脂质体转染K562细胞,RT-PCR检测目的 基因CGI-100的表达,采用体外培养技术,通过pIRES2EGFP- CGI-100质粒转染K562细胞前后的生长曲线.结果 pIRES2-EGFP- CGI-100在K562细胞中获得表达,对细胞增殖速度有明显影响.结论 CGI-100表达产物可能是1个与K562细胞增殖有关的功能蛋白质,CGI-100基因可能是1个具有生物学功能的白血病未知基因.     

共表达p53、p16基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达

[目的]构建p53、p16基因真核表达载体,观察其在K562细胞中的表达。[方法]设计并构建包含野生型p53cDNA、p16cDNA的真核双表达载体pBudCE4．1-53—16,脂质体法转染K562白血病细胞,用间接免疫细胞化学法、Western blot等方法鉴定外源性p53及p16的表达情况。[结果]构建成功p53、p16基因双表达真核载体,体外成功转染入K562细胞,检测到K562细胞外源性p53、p16蛋白的表达。[结论]重组质粒pBudCE4．1-53-16体外转染K562细胞后．目的基因能够在细胞中同时表达,为进一步研究两种基因用于肿瘤治疗奠定基础。     

S100A13 基因真核表达载体的构建及其在COS-7 细胞中的表达

 目的 构建以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的重组表达质粒pcDNA3.1/NT-GFP-S100A13,观察S100A13基因在COS-7细胞中的表达及定位。方法 采用克隆和亚克隆技术构建S100A13基因真核表达载体,脂质体介导转染COS-7细胞,RT-PCR和western-blot验证其mRNA和蛋白的表达,荧光显微镜观察该基因亚细胞定位。结果 酶切和测序结果证实重组质粒含有S100A13编码区序列且插入方向正确,转染后观察该基因亚细胞定位于全胞浆。结论 成功构建了S100A13基因真核表达载体,该基因在COS-7细胞中成功表达,S100A13基因表达定位于全胞浆。     

三氧化二砷诱导K562细胞凋亡过程中Par-4及WT1基因表达的变化

 目的　探讨三氧化二砷（As2O3）诱导K562细胞凋亡过程中前列腺凋亡反应因子-4（Par-4）和WT1基因表达的变化。方法　用不同浓度As2O3（2～10 μmol／L）处理K562细胞24～72 h,MTT法测定细胞增生活力,流式细胞术检测细胞凋亡,采用荧光定量RT-PCR检测Par-4和WT1基因 mRNA表达变化,Western blotting检测Par-4和WT1蛋白表达的变化。结果　不同浓度As2O3作用于K562细胞,随浓度增加能明显抑制细胞的生长,诱导细胞发生凋亡。同时Par-4基因mRNA和蛋白表达逐渐增加;而WT1基因mRNA及蛋白表达逐渐下降。结论　As2O3可抑制K562细胞生长,诱导细胞凋亡,Par-4与WT1基因可能参与As2O3诱导K562细胞凋亡的调控。     

人MUC1/Y基因真核表达载体的构建及其在COS/7细胞中的表达

MUCl/Y是1994年发现的新基因,其蛋白锚定于细胞膜.研究表明, MUCl/Y具有膜受体的特征,可能作为一种膜表面的重要分子通过ras信号传导通路参与细胞的恶性转化过程;进一步的动物实验表明,MUCl/Y的表达具有肿瘤特异性.由此推测,MUCl/Y可能是一种肿瘤主动特异性免疫治疗的理想靶分子[1],但迄今为止,MUCl/Y基因及其编码蛋白的功能尚未明确,因此,构建人MUCl/Y全长cDNA的真核表达载体,将对进一步研究该基因的功能以及以MUCl/Y为靶点的肿瘤核酸疫苗的制备,具有重要意义.     

Twist基因真核表达载体的构建和表达检测

[目的]构建Twist基因读码框架至真核表达载体pCDNA3．1，为进一步研究Twist蛋白的功能做材料准备。[方法]采用RT-PCR方法，以正常人子宫体组织cDNA为模板，扩增Twist基因全长读码框架，并构建到真核表达载体pCDNA3．1中。[结果]经过克隆测序结果证实，成功将Twist基因读码框架插入真核表达载体pCDNA3．1的相应位置：将pCDNA-Twist载体转染细胞系后，发现Twist蛋白在细胞中得到高水平的表达。[结论]Twist真核表达载体的成功构建，为深入研究Twist蛋白对肿瘤转移的作用提供了理想的材料。     

Fas siRNA真核表达载体构建及其抑制Jurkat细胞凋亡的作用

 目的 构建Fas（CD95）特异性siRNA真核表达载体psilencircle-FasSi,转染Fas-FasL凋亡敏感细胞株Jurkat,研究其抗凋亡作用。方法 通过聚合酶链式反应（PCR）制备siRNA表达框架(SECs),转染Jurkat细胞,实时荧光定量PCR检测Fas mRNA抑制率,筛选出高效抑制Fas mRNA表达的siRNA;把筛选出的siRNA序列插入siRNA真核表达质粒psilencircle,构建psilencircle-FasSi;psilecircle FasSi转染Jurkat细胞,实时荧光定量PCR检测Fas mRNA、Western blot检测Fas蛋白;anti-Fas mAb刺激Jurkat细胞凋亡,流式细胞术检测Jurkat细胞凋亡率。结果 酶切、测序证明成功构建了psilecircle-FasSi,实时荧光定量PCR及Western blot表明psilencircle-FasSi可抑制Fas mRNA和蛋白表达,流式细胞术检测证实psilencircle-FasSi可抑制Jurkat凋亡率。结论 我们成功构建了Fas特异性siRNA真核表达载体psilencircle-FasSi,它不仅可以下调Jurkat细胞的Fas表达而且可以显著抑制Fas-FasL途径诱导的凋亡。     

CtBP1基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效果的初步鉴定

目的：构建C-末端结合蛋白-1（CtBP1）基因RNA干扰（RNAi）的真核表达载体,转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1（ADR＋/＋）,初步鉴定其干扰效果。方法：以人CtBP1基因为靶基因,以pGenesil-1质粒为载体,根据GenBank数据库提供的CtBP1基因核苷酸序列,选择设计两条siRNA干扰序列,将带9个碱基茎环结构的干扰序列插入带有绿色荧光蛋白（EGFP）基因、卡那霉素（Kanr）抗性基因及U6启动子的真核表达载体pGenesil-1中,构建针对CtBP1基因的shRNA真核表达载体,转化大肠杆菌DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析。确认载体构建成功后,用脂质体LipofectamineTM2000将重组质粒瞬时转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1（ADR＋/＋）,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计数转染细胞数,计算转染效率,RT-PCR法检测载体对CtBP1基因的表达抑制效果。结果：构建针对CtBP1基因的pGenesil-1-CtBP1小发夹RNA（pGenesil-1-CtBP1-shRNA）,经限制性内切酶酶切、PCR和DNA测序证实与设计完全一致;在荧光显微镜下观察到B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞表达绿色荧光蛋白（EGFP）,证实重组质粒己转染入细胞,转染效率达到60%-70%;RT-PCR结果显示B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞中CtBP1基因被特异抑制,基因表达抑制率达40%以上,与转染试剂对照组、空白对照组和阴性序列对照组间的差异均具有统计学意义（P均〈0.05）。结论：成功构建CtBP1基因的shRNA表达载体,可以有效抑制B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞上CtBP1基因表达。为进一步研究CtBP1基因功能进而逆转肿瘤的多药耐药奠定基础。     

人MUCI/Y基因真核表达载体的构建及其在COS/7细胞中的表达

MUCl/Y是1994年发现的新基因,其蛋白锚定于细胞膜。研究表明,MUCl/Y具有膜受体的特征,可能作为一种膜表面的重要分子通过ras信号传导通路参与细胞的恶性转化过程;进一步的动物实验表明,MUCl/Y的表达具有肿瘤特异性。由此推测,MUCl/Y可能是一种肿瘤主动特异性免疫治疗的理想靶分子,但迄今为止,MUCl/Y基因及其编码蛋白的功能尚未明确,因此,构建人MUCl/Y全长cDNA的真核表达载体,将对进一步研究该基因的功能以及以MUCl/Y为靶点的肿瘤核酸疫苗的制备,具有重要意义。     

MDR1基因短发卡样RNA表达载体逆转K562/A02人白血病细胞多药耐药的研究

目的构建MDR1基因短发卡样RNA(shRNA)真核表达载体,观察对K562/A02人白血病细胞株MDR1基因的沉默作用以及对P-糖蛋白(P-gp)表达及功能的影响。方法以基因重组技术构建表达质粒,转染重组质粒pEGFP-C1/U6/MDR1-A和pEGFP-C1/U6/MDR1-B至K562/A02细胞株,通过半定量RT-PCR和蛋白质印迹法,检测MDR1基因表达及P-gp表达水平的变化;以MTT法检测阿霉素(ADM)对K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC_(50));高效液相色谱(HPLC)法检测细胞内ADM含量。结果构建的2种重组质粒pEGFP-C1/U6/MDR1-A和pEGFP-C1/U6/MDR1-B均明显抑制K562/A02细胞株MDR1基因表达,抑制率最高为48．2%±2．5%;同时抑制P-gp蛋白的表达,抑制率最高为50．67%。对ADM药物敏感性的相对逆转效率分别为40．8%和62．4%;同时使K562/ A02细胞内ADM含量增加。结论shRNA表达载体可明显抑制K562/A02细胞MDR1 mRNA的转录和P-gp蛋白的表达,增加K562/A02细胞内ADM含量,恢复K562/A02细胞对化疗药物的敏感性,逆转MDR1基因编码蛋白P-gp介导的多药耐药。     

人微管不稳定蛋白基因真核表达载体的构建与表达及对食管癌细胞的作用

目的 构建人微管不稳定蛋白基因(stathmin)真核表达载体,研究其对食管癌细胞EC9706的作用.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增stathmin cDNA,克隆至pMDl8-T载体并酶切鉴定后,亚克隆至pEGFP-C2真核表达载体.将测序鉴定正确的重组载体和空载体经脂质体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察转染细胞荧光蛋白的表达,采用Western blot检测转染细胞中增强型荧光蛋白(EGFP)和stathmin融合蛋白的表达.选取稳定转染的细胞株,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪分析细胞的增殖状态,平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性.结果 RT-PCR扩增获得450 bp的cDNA编码序列;克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定后获反向插入质粒;亚克隆至pEGFP-C2载体后,经酶切与测序鉴定,重组载体pEGFP-stathmin构建成功.重组载体和空载体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察到,转染细胞中呈现绿色荧光;经Western blot证实,重组载体表达46 000的融合蛋白.与空载体转染细胞相比,转染重组载体的EC9706细胞形态变大,增殖速度减慢,细胞分裂阻滞于G2/M期,细胞克隆形成数减少,裸鼠体内成瘤性降低(P＜0.05).结论 构建的真核表达载体pEGFP-stathmin在食管癌EC9706细胞中能够稳定表达,并抑制肿瘤细胞的增殖和成瘤性.