简易经济的肝星状细胞的分离培养方法

为建立一种简易、经济的肝星状细胞(hepatic Stellate Cell,HSC)分离方法,为肝纤维化研究提供一种细胞模型。采用胶原酶、链霉蛋白酶灌注肝脏,单层密度梯度离心方法分离HSC。Desmin免疫组化染色鉴定。HSC的得率为1×107~3×107,纯度为90%以上。该方法简化了HSC的分离过程,简单、经济,适合广泛开展。     

脂质体转染人肝星状细胞和肝细胞条件优化

利用Lipofectamine 2000(Lipo)介导LacZ及EGFP基因转染人肝星状细胞系LX-2和人肝细胞系Chang Liver,探讨Lipo用量、质粒用量、转染时间、细胞初始接种密度及不同启动子驱动对转染效率的影响.结果显示,两种细胞均能得到高效转染,Chang Liver细胞转染效率(80%)高于LX-2细胞(60%).Lipo用量为每孔2μL,转染后6 h换液,LX-2细胞应用质粒DNA为每孔0.45μg,Chang Liver细胞应用质粒DNA为每孔0.30~0.45μg,此时转染效率最高.巨细胞病毒(CMV)启动子驱动LacZ转染效率与CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子驱动增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染效率无显著差异;细胞初始接种密度对转染效率无显著影响.     

HA纳米颗粒对HepG2细胞冷冻干燥效果的影响

针对纳米颗粒对细胞冷冻干燥的影响进行研究。将不同质量浓度的羟基磷灰石(HA)纳米颗粒(质量浓度分别为0,0.1,0.3,0.5,0.7,1,5 g/L)添加到冻干保护剂中,研究其对HepG2细胞冷冻干燥效果的影响,结果显示:当保护剂中纳米颗粒质量浓度为0.5 g/L时,细胞的冻干效果最好,复水后细胞的回收率为37.39%,存活率为62.02%(P0.05);但是当纳米颗粒质量浓度高于0.5 g/L,对细胞具有较大损伤,显著降低细胞的24 h贴壁率。研究表明:添加适当浓度的纳米颗粒可以保护细胞,若纳米颗粒浓度过高,则会起到相反的作用;HA纳米颗粒冻干保护剂作用于冷冻、升华过程,在复水过程不起作用。     

广西地不容种质离体保存技术研究

以广西地不容(Stephanie kwangsiensis H.S.Lo))试管苗为材料,研究室温(25±2)℃光照2000lx(12h/d)条件下,培养基中不同无机盐水平(MS、1/2MS、1/4MS)、蔗糖浓度(0、20、40、60g/L)和植物生长抑制剂CCC(0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.5mg/L)、PP333(0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mg/L)、ABA(0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mg/L)、MH(0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mg/L)对广西地不容试管苗保存存活率的影响。结果表明,MS添加蔗糖20～40g/L适合作为广西地不容离体保存的基本培养基,附加一定浓度的CCC、PP333、ABA和MH能有效抑制试管苗的旺盛生长,长时间保存后的存活率高;ABA易引起试管苗早衰,保存效果不佳。对广西地不容试管苗保存效果较好的两个培养基配方为:MS CCC0.4～2.5mg/L 蔗糖30g/L和MS PP3330.2～0.5mg/L 蔗糖30g/L,这两个配方可以不继代连续保存360～380d,存活率60%～80%。     

假单胞菌B5生物合成邻苯二酚的研究

以假单胞菌B5菌株(实验室筛选)为实验菌株 ,完成了游离细胞发酵条件优化和发酵保护剂甘油最适用量的研究。在 6g/L的苯甲酸钠和 1.1g/L培养基上30℃培养 24h ,邻苯二酚(catechol)产量达到 2.5g/L ,分子水平转化率为 52.3%;同时进行细胞固定化材料、固定化条件和固定化发酵条件的实验。以 1.5%壳聚糖和 0.1%的海藻酸钙为固定化介质 ,0. 1%的戊二醛交联制备得到的固定化细胞成球形 ,直径约为 2.5mm ,在苯甲酸钠 (6g/L)培养基中可连续批次发酵 12次 ,邻苯二酚平均产量约为每批次 1.5g/L。     

卡拉胶固定化Nocardia sp.生产L(+)酒石酸

采用卡拉胶包埋具有环氧琥珀酸水解酶活性的诺卡氏菌菌体用于生产酒石酸。固定化的最适卡拉胶浓度为20 g/L,菌体浓度为200 g/L,交联剂戊二醛浓度为5 g/L,固定化后的酶活回收率可以达到70%。高浓度的环氧琥珀酸对水解反应产生抑制作用,游离细胞的米氏常数(Km)为0.234 m o l/L,抑制常数(KI)为0.22 m o l/L,固定化细胞则分别为0.31 m o l/L和0.21 m o l/L。游离细胞和固定化细胞反应的最适pH分别为8.0和8.5。细胞固定化以后,耐热稳定性增强。30°C 0.2m o l/L的底物浓度下,摇瓶中连续转化25批,L( )酒石酸的转化率接近100%。     

胶原酶灌注部分肝脏方法分离肝主质细胞

本文报导一种分离哺乳类正常肝细胞的新方法,其要点是精确安排操作的程序,在灌注前结扎肝脏的左叶和正中叶,使灌注液只在余下的1/3肝脏内流动。本方法快速、稳定,能在2小时内从大鼠的1/3肝脏(2—3克肝组织)分离出1—1.5×10~7个和肝主质细胞,存活率在95%以上。酶液(0.05%胶原酶)的用量为20～25ml,在同类实验中是最少的。     

利用固定化酵母细胞生产ATP

利用明胶戊二醛制备的固定化啤酒酵母细胞,由腺苷酸(AMP)生产腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)。在含有15 mmol/L AMP,75 mmol/L葡萄糖,5mmol/L硫酸镁(MgSO_4·7 H_2O)的0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)中,在34℃振荡反应1h,ATP转化率可达100%,分批连续反应10次,ATP转化率保持在90%以上。     

真养产碱杆菌H16合成聚-β-羟基丁酸酯的培养基优化

对真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha)H16累积聚-β-羟基丁酸酯(PHB)的发酵培养基组成进行了优化.在单因素实验的基础上,采用Plackett-Burman设计确定了碳源浓度和碳氮质量比两个显著影响真养产碱杆菌生长和累积PHB的因素.通过响应面设计法获得最优发酵培养基组成为:葡萄糖28.8 g/L,酵母粉0.2 g/L,碳氮质量比5,KH2PO4 1.0 g/L,Na2HPO4 0.3 g/L,MgSO4 1.0 g/L,CaCl2 0.1 g/L,ZnSO4 0.65 mg/L,FeSO4 0.1 mg/L,(NH4)6Mo7O240.3 mg/L,H3BO30.3 mg/L,pH 7.0.在此最优发酵条件下,细胞干质量浓度达到16.1 g/L,PHB的质量浓度达到7.9 g/L,糖对细胞的转化率为64%,对PHB的转化率为32%.     

肝癌细胞对三氧化二砷诱导凋亡的敏感性与细胞内谷胱甘肽含量的关系

目的:比较肝癌BEL-7402和SMMC-7721细胞对三氧化二砷(As2O3)诱导凋亡的敏感性差异,探讨细胞内谷胱甘肽(GSH)含量与其作用的关系。方法:不同浓度As2O3作用BEL-7402和SMMC-7721细胞24~96 h,流式细胞仪检测细胞DNA含量,计算细胞凋亡百分率;GSH检测试剂盒检测细胞内GSH含量。结果:0.25μmol/L As2O3作用24 h,有效地诱导BEL-7402细胞凋亡;对SMMC-7721细胞来说,需要用1.0μmol/L As2O3作用24 h才能达到相同的抑制效果。1.0μmol/LAs2O3作用72 h时,BEL-7402细胞的凋亡率为(43.8±0.2)%,SMMC-7721细胞的凋亡率为(12.8±0.2)%,检测BEL-7402细胞内GSH为(18.7±1.4)nmol/mg;SMMC-7721细胞内GSH为(50.8±5.2)nmol/mg,两者比较均有显著差异。结论:肝癌BEL-7402和SMMC-7721细胞对As2O3诱导细胞凋亡的敏感性不同,可能与细胞内GSH含量有关。     

“Anti-UV Clone”柴胡细胞提取物对HaCaT和HepG2细胞生长的影响研究

实验利用噻唑蓝比色分析法(MTT法)研究"Anti-UV Clone"柴胡细胞株不同溶剂提取物对人角质上皮细胞(HaCaT细胞)和人肝癌细胞(HepG2细胞)生长的影响.实验表明,75%乙醇提取剩余物在低浓度时对HaCaT细胞的生长具有显著的促进作用,其中以加入质量浓度为2.50mg/L时效果最好,添加后HaCaT细胞的生长速率比空白对照高(43.71±1.23)%.表明该提取物中存在促进HaCaT细胞生长的活性物质.而"Anti-UVClone"柴胡细胞株石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯提取物则都会抑制HaCaT细胞和HepG2细胞的生长.其中石油醚和乙酸乙酯提取物对HaCaT细胞生长的抑制作用最强,在加入质量浓度为7.50mg/L时对HaCaT细胞的抑制率分别达(39.70±0.61)%和(40.20±0.95)%;而石油醚提取物对HepG2细胞生长的抑制作用最强,在加入质量浓度为7.50mg/L时对HepG2细胞生长的抑制率达(44.97±1.01)%.     

琐琐葡萄多糖对PC12细胞损伤的神经保护作用

 体外培养PC12细胞,采用20μmol/L β淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)作用24h诱导细胞损伤,建立阿尔茨海默病(AD)细胞模型,研究琐琐葡萄多糖(VTP)对PC12细胞损伤的神经保护作用。设立对照组、模型组和VTP保护组(20,40,80μg/mL),CCK-8法检测各组细胞的存活率,乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞膜通透性及完整性,化学比色法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果显示,20,40,80μg/mL VTP可提高PC12细胞存活率,减少LDH渗漏,增加SOD活力,减少MDA含量,降低细胞凋亡率,与模型组比较有显著差异(P<0.01)。由此推论,VTP对Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡和氧化损伤具有明显的保护作用。     

Caveolin-1 在肝纤维化中作用的研究

摘要:目的 通过 10%四氯化碳( CCl₄ )橄榄油溶液,分别诱导野生型小鼠和小窝蛋白-1( Caveolin-1) 敲除小鼠建立肝纤维化模型,比较分析敲除 Caveolin-1 对肝损伤和胶原沉积的影响,揭示其在肝纤维化中的作用。 方法 按剂量 1 μL / g,腹腔注射野生型小鼠和 Caveolin-1 敲除小鼠 10% CCl₄ 橄榄油溶液,2 次 / 周。 注射后,1、3、7、14 和 28 d,分 别处死 5 只小鼠,取血清和肝脏,通过苏木素-伊红( HE) 染色、血清谷丙转氨酶( ALT) 和谷草转氨酶( AST) 水平检测,分析肝脏损伤程度;利用天狼猩红染色、Real-time PCR 及 Western blot 方法,观察肝脏胶原沉积及肝纤维化标志物 α 平滑肌肌动蛋白( α-SMA) 、Ⅰ 型胶原蛋白( collagen-Ⅰ )和Ⅲ 型胶原蛋白( collagen-Ⅲ ) mRNA 及蛋白表达水平, 分析肝纤维化程度。 结果 与野生型小鼠相比,造模后 3 d,敲除小鼠的血清 ALT 和 AST 含量显著升高( P<0. 01) ;3、7 和 14 d,敲除小鼠肝脏坏死面积显著增大( P<0. 01 或 P<0. 05) ;7、14 及 28 d 时,敲除小鼠胶原染色面积明显增多( P<0. 01 或 P<0. 05) ;肝星状细胞活化标志物 α-SMA mRNA 水平在 3 d 和 14 d 时显著升高(P<0. 05),collagen-Ⅰ和collagen-Ⅲ mRNA 在 14 d 时显著上调(P<0. 01);14 d 时,敲除小鼠肝脏 α-SMA、collagen-Ⅰ及 collagen-Ⅲ 蛋白表达水平均显著升高( P<0. 01 或 P<0. 05) 。 结论 Caveolin-1 抑制 CCl₄ 诱导的小鼠肝脏炎性损伤及纤维化。     

镉致PC12细胞的神经毒性

镉是环境中常见的重金属,为了研究镉暴露可能会对神经系统造成的损伤,文章以PC12细胞为模型,观察不同浓度氯化镉暴露对PC12细胞的损伤。实验用0.1、0.5、2.5μmol/L镉处理PC12细胞24 h, MTT比色法检测细胞存活率,并检测0.1、0.5μmol/L镉处理后PC12细胞分化和活性氧变化。MTT结果显示,0.5μmol/L的镉处理显著降低了PC12细胞的存活率,镉暴露对PC12细胞存活率的降低呈剂量依赖性;细胞分化实验结果表明,镉暴露后细胞突起总长度、一级分支和二级分支数目显著降低,且镉对神经发生的抑制作用呈剂量依赖性;细胞内活性氧检测实验表明,镉暴露后细胞内的活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)荧光信号显著增加。上述结果表明,镉可能是通过增加细胞内ROS影响细胞的存活率和分化,进而引起神经毒性。     

固定化啤酒酵母细胞合成5’-三磷酸腺苷

用K-卡拉胶包埋啤酒酵母制成固定化细胞,在0.05mol/L葡萄糖,0.022mol/L腺苷酸,0.012mol/LMgSO_4·7H_2O,0.2mol/L氯化钾,0.2mol/L磷酸钾缓冲溶液(pH7.0)中,35℃反应4小时,5′-三磷酸腺苷转化率可达42%,在50ml三角烧瓶中分批反应,连续使用5次,5′-三磷酸腺苷转化率仍维持在37%以上。     

骨髓间充质干细胞与内皮祖细胞对大鼠大部分肝切除合并缺血再灌注后损伤影响

目的通过制造大鼠肝脏缺血再灌注损伤合并大范围肝切除模型,探讨将骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)与骨髓内皮前体细胞(BM-EPCs)分别经门静脉移植入模型肝内,观察其对于鼠肝脏缺血再灌注肝损伤修复和肝脏再生中的作用,以及将两种细胞联合移植观察两种细胞是否存在协同作用促进肝脏缺血再灌注损伤修复和肝脏再生。方法通过细胞贴壁法从骨髓液中获得BM-MSCs和BM-EPCs。利用慢病毒携带绿色荧光蛋白(GFP)及红色荧光蛋白(RFP)分别对BM-MSCs及BM-EPCs进行细胞标记,为下一步将细胞移植入动物体内观察细胞的分布情况做准备。制作SD大鼠70%肝缺血再灌注损伤合并大范围肝切除手术模型,将SD大鼠随机分为四组:单独注射BMMSCs(n=12)、单独BM-EPCs(n=12)、联合注射BM-MSCs+BM-EPCs组(n=12)、单独注射PBS空白对照组(n=12),按不同分组进行细胞移植,分别经大鼠门静脉注射GFP标记的BM-MSCs/200μL、RFP标记的BM-EPCs/200μL、BM-MSCs+BM-EPCs(BM-MSCs∶BM-EPCs=1∶1)/200μL、对照组注射PBS/200μL。以上四组分别在不同的时间段:术后第1天(n=4),第2天(n=4),第3天(n=4)各取腔静脉血检测血清AST、ALT及TNF-ɑ水平指标。肝脏组织做冰冻切片后利用免疫荧光方法动态观察BM-MSCs和BM-EPCs在肝脏内的分布。各组肝脏组织行常规病理切片观察肝脏病理损害及恢复的程度。最后各组取第3天的肝组织使用Tunnel法检测肝内细胞凋亡情况。结果与对照组比较,BM-MSCs组、BM-EPCs组、BM-MSCs+BM-EPCs组在肝缺血再灌注损伤合并大部分肝切除术后第1天、第2天、第3天大鼠血清AST及ALT、TNF-ɑ水平均明显下降(P0. 05),其中BM-MSCs组大鼠血清AST及ALT、TNF-ɑ水平均最低(P0. 05)。通过免疫荧光方法观察BM-MSCs及BM-EPCs可以特异性分布至肝脏损伤部位促进肝脏组织修复再生。肝组织HE染色病理及评分显示与对照组比较,BM-MSCs组、BM-EPCs组及BMMSCs+BM-EPCs组肝内细胞损伤程度明显降低,然而与BM-MSCs+BM-EPCs组相比较,BM-MSCs组和BM-EPCs组肝内细胞损伤程度明显降低(P0. 05),BM-MSCs组与BM-EPCs组相比较肝内细胞损伤程度无统计学意义。与对照组比较BM-MSCs组、BM-EPCs组及BM-MSCs+BM-EPCs混合组均能降低肝内细胞的凋亡数量,但BM-MSCs组肝内凋亡细胞数量最少(P0. 05)。结论单独细胞移植组与联合移植组均对肝脏大部分切除合并缺血再灌注损伤起保护作用。但在本实验中联合移植组对肝功能以及肝内细胞的保护并未体现出协同作用。BM-MSCs和BM-EPCs可能通过降低血清TNF-ɑ水平抑制炎症反应从而在大部分肝切除合并肝缺血再灌注损伤后保护肝内细胞。     

一株产氢光合细菌的筛选及培养条件的优化

通过平板划线法从猪粪废水中分离纯化得到一株产氢光合细菌PSB-ZF1,对其菌体进行染色观察、生理生化试验以及活细胞吸收光谱的测定,初步鉴定菌属于红螺菌科红螺菌属(Rhodospirillum)光合细菌;对菌培养过程中的营养条件实验分析后获得的最优培养基配方为:乙酸钠2.0 g,氯化铵1.0 g,碳酸氢钠0.5 g,氯化钠1.0 g,磷酸二氢钾0.2 g,六水氯化镁0.2 g,T.M储液1 m L,酵母膏0.8 g,蒸馏水1 000 m L;考察环境因素对菌种生长的影响,发现光合细菌PSB-ZF1在搅拌状态下,接种量为10%,光照强度为3 000lux,溶解氧量为2.02 mg/L,初始pH为7.0时生长状态最佳;获得高浓度的PSB-ZF1菌液有利于后续产氢实验。     

大鼠胆管上皮细胞的分离、鉴定及纯度、活性分析

按Higgins等方法制作大鼠2/3肝切除(parital hepatectomy,PH)模型,用两步灌流法分散肝脏细胞,在32%～90%Perco11密度梯度离心法的基础上进一步用免疫磁珠分离胆管上皮细胞(biliary epithelial cell,BEC),用γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transferase,GGT)和角蛋白19(cyto-keratin19,CK19)免疫组织化学定性、定位再生肝(regenerating liver,RL)、分散的肝脏细胞及分离的胆管上皮细胞,用RT-PCR定量胆管上皮细胞的GGT和CK18mRNA,用蛋白免疫印迹定量胆管上皮细胞的GGT、角蛋白18(cytokeratin 18,CK18).初步证实分离的细胞中GGT和CK19阳性细胞占96%以上,从PH后各时间点分离的胆管上皮细胞的GGT和CK18mRNA量稳定,相应的蛋白量亦稳定.表明改进的分离胆管上皮细胞方法具有收率和纯度高、活性好等特点,方便适用.     

高速逆流色谱分离制备大黄化学成分

采用pH-区带精制逆流色谱(pH-ZRCCC)与常规高速逆流色谱(HSCCC)结合技术分离制备大黄粗提物中的化学成分。首先采用pH-ZRCCC分离大黄粗提物,溶剂体系为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(3:7:4:6,V/V),上相加TFA(10 mmol/L)作为固定相,下相加Na OH(15 mmol/L)作为流动相。从1.3 g粗提物中得到140 mg桂皮酸(纯度为96.1%)、130 mg大黄酸(纯度为92.5%)和560 mg尾吹物。称取260 mg该尾吹物采用常规HSCCC的方法进一步分离,溶剂体系为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(7:3:7:4,V/V),得到约98 mg大黄素(纯度为96.5%)和60 mg芦荟大黄素(纯度为94.6%)。用HPLC检测纯度,用ESI-MS和1HNMR鉴定结构。研究结果表明pH-ZRCCC与HSCCC结合是分离大黄中化合物的一种有效方法。     

大鼠正常肝和再生肝的肝细胞分离、鉴定及纯度、活性分析

按Higgins等方法制作大鼠2/3肝切除(parital hepatectomy,PH)模型,用两步灌流法分散肝脏细胞,用60%Percoll密度梯度离心分离肝细胞,用免疫组织化学方法定性、定位再生肝(regenerating liver,RL)、分散的肝脏细胞及分离的肝细胞中白蛋白(albumin,ALB)和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G-6-P),用蛋白免疫印迹方法定量肝细胞的ALB和G-6-P,用RT-PCR定量肝细胞的ALB和G-6-P mRNA.初步证实纯化的细胞中,ALB和G-6-P阳性细胞占96%以上;PH后各时间点纯化的肝细胞的ALB和G-6-P mRNA量稳定,相应的蛋白量亦稳定.表明改进后的分离肝细胞方法具有收率高、纯度高、活性好等特点.