三叶半夏凝集素C端结构域的可溶表达及其活性研究

利用pET-32-SUMO表达载体在大肠杆菌中可溶表达三叶半夏凝集素C端结构域(P-D2),并研究其凝血活性、糖结合特异性以及肿瘤抑制活性。实验结果表明,P-D2蛋白的产量为5mg/L。该蛋白具有凝集小鼠红细胞的活性,可以被D-甘露聚糖抑制,但不能被D-乳糖、D-葡萄糖、D-麦芽糖抑制。P-D2蛋白的体外抗肿瘤活性实验表明其对肝癌细胞Bel-7404以及结肠癌细胞SW-620都有良好的抑制作用。凋亡现象观察实验发现P-D2蛋白可以诱导癌细胞Bel-7404的凋亡。这是首次在大肠杆菌表达系统中表达了可溶的半夏凝集素C端结构域,为其他凝集素的可溶表达提供了新的选择。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA联合ZD55-TRAIL溶瘤腺病毒对肝癌细胞杀伤作用的研究

研究组蛋白去乙酰化抑制剂SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid)联合ZD55-TRAIL对人肝癌细胞株的体外杀伤效果,实验采用MTT法检测SAHA、ZD55-TRAIL以及二者联合对肝癌细胞株Huh-7、Bel-7404、Hep3B以及人正常肝细胞株QSG-7701增殖的抑制作用;利用Hoechst33342染色对联合处理的细胞进行凋亡形态学观察;通过结晶紫实验进一步检测联合用药对肿瘤细胞的杀伤情况;通过Western blot实验在蛋白水平上检测一些凋亡相关蛋白表达情况的变化.实验结果表明:SAHA联合ZD55-TRAIL处理3d后对肝癌细胞株Huh-7的增殖抑制率达到50％,对Hep3B、Bel-7404也达到近40％的杀伤效率,并且联合治疗后对人正常细胞株QSG-7701未见明显的毒副作用.同时结晶紫实验也证明联合治疗对肿瘤细胞的杀伤力强于用SAHA或ZD55-TRAIL单独使用.Western blot实验证明了药物和病毒的联合作用使促凋亡蛋白Bcl-2,Bcl-xL的表达量明显减少,caspase-8和caspase-9蛋白也有相应剪切现象的发生.流式细胞仪同样检测出SAHA和ZD55-TRAIL联合作用对肝癌细胞有很好的杀伤作用.     

过表达Akt1细胞株的构建及鉴定

Akt1是细胞信号传导通路中的关键信号分子,具有促进细胞增殖、生长、迁移、侵袭,以及抑制细胞凋亡,抵抗化疗和放疗等重要作用。文章通过构建pLJM1-Akt1重组质粒,利用慢病毒侵染的方法将重组质粒转染至K562、Bel-7404细胞,用嘌呤霉素筛选得到Akt1稳定过表达的Bel-7404/Akt1、K562/Akt1细胞株,通过Western bloting分析细胞株中Akt1的表达情况。结果显示：Bel-7404/Akt1与K562/Akt1细胞中Akt1表达量明显高于野生型Bel-7404细胞与K562细胞,成功构建过表达Akt1的K562/Akt1、Bel-7404/Akt1稳转细胞株。Akt1过表达细胞株的成功构建为寻找和筛选高效、低毒、强特异性的Akt1抑制剂以及逆转细胞多药耐药（multidrug resistance,MDR）的研究提供了实验模型。     

过表达Akt1细胞株的构建及鉴定

Akt1是细胞信号传导通路中的关键信号分子,具有促进细胞增殖、生长、迁移、侵袭,以及抑制细胞凋亡,抵抗化疗和放疗等重要作用。文章通过构建pLJM1-Akt1重组质粒,利用慢病毒侵染的方法将重组质粒转染至K562、Bel-7404细胞,用嘌呤霉素筛选得到Akt1稳定过表达的Bel-7404/Akt1、K562/Akt1细胞株,通过Western bloting分析细胞株中Akt1的表达情况。结果显示:Bel-7404/Akt1与K562/Akt1细胞中Akt1表达量明显高于野生型Bel-7404细胞与K562细胞,成功构建过表达Akt1的K562/Akt1、Bel-7404/Akt1稳转细胞株。Akt1过表达细胞株的成功构建为寻找和筛选高效、低毒、强特异性的Akt1抑制剂以及逆转细胞多药耐药(multidrug resistance,MDR)的研究提供了实验模型。     

融合蛋白EGFP-PPA原核表达及标记肿瘤细胞研究

肿瘤细胞糖基化改变是非常普遍的现象,与恶性肿瘤的发生发展有着密切的关系。掌叶半夏凝集素(Pinellia pedatisecta agglutinin,PPA)是一种甘露糖特异性结合凝集素,与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein EGFP),通过基因工程技术形成融合基因,并在大肠杆菌中表达纯化了EGFP-PPA融合蛋白。实验结果表明,此融合蛋白可以识别实体肿瘤细胞表面的一部分标志,如Hep3B、Hu7、PLC、BEL-7404以及A549,而不能识别肝正常细胞L02,提示实体瘤细胞表面显露的甘露糖残基被此融合蛋白所识别,说明PPA识别具有甘露糖表型的实体瘤细胞表面的一部分,这些实验结果为进一步阐明甘露糖显露细胞在肿瘤发生发展中的作用提供了新的研究手段。     

PHA-767491联合IL-24基因对肝癌细胞的杀伤研究

利用最新发现的抗癌新药PHA-767491联合肿瘤基因治疗中最常用的杀伤基因IL-24共同处理肝癌细胞Bel-7404,采用20MOI携带IL-24基因的非复制型病毒Ad-IL-24联合不同浓度的PHA-767491对肝癌细胞Bel-7404进行治疗研究。western blot实验结果表明:PHA-767491对IL-24的表达无明显抑制作用;MTT和Ho-ceast33342染色实验表明二者联合对Bel-7404细胞表现出了较高协同杀伤作用。     

转录因子AP-2α与TES蛋白相互作用分析

为研究转录因子AP-2α与TES蛋白的相互作用机制,分别构建AP-2α与GST的融合蛋白原核表达载体及TES与His的融合蛋白原核表达载体,在大肠杆菌E.coli BL 21中诱导表达,表达产物经纯化后用GST Pull-down及免疫印迹技术分析其相互作用关系.实验结果表明,AP-2α与TES之间存在相互作用是由于AP-2αC端能与TES C端的首个LIM结构域结合,酵母双杂交实验也证实了该结果;同时根据AP-2α只能与TES C端而不能与TES全长蛋白结合的实验事实提出了TES蛋白存在自身相互作用的可能,这种自身折叠封闭了位于TES C端首个LIM结构域上的AP-2α结合位点.     

棉酚在肝癌细胞中作用机制的研究

棉酚是棉花中倍半萜（十五碳）的法尼基焦磷酸环化后合成的次生代谢产物。近来有研究显示棉酚具有抗肿瘤效果。本研究通过MTT、Hoechst染色、Westernblot等生化技术开展棉酚对肝癌细胞系Bek7404的增殖抑制及促凋亡作用研究。MTT实验结果表明5retool棉酚即对肝癌细胞增殖具有强烈抑制作用,Hoechst染色表明5mmol／L棉酚即可对肝癌细胞具有促凋亡作用,Westernblot结果表明棉酚能下调Bcl-2基因的表达。棉酚对肝癌细胞系Eel-7404具有很好的抑制增殖和促凋亡的效果。     

SHP-2酪氨酸磷酸酶C—SH2结构域的表达纯化和NMR研究

SHP-2是一种非跨膜型蛋白酪氨酸磷酸酶.将其N末端结构域C-SH2克隆至原核表达载体pGEX-2T中,命名为pGEX-2T-C-SH2.该融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达于菌体上清液中,经GST亲和层析柱和FPLC分子筛柱纯化后,目的蛋白纯度可达98%.质谱分析表明,目的蛋白相对分子量与理论值基本相同.在最适表达条件下,1 L的M9培养基能够高效表达并获得12 mg C-SH2蛋白,NMR结构和活性位点的分析表明,目的蛋白能正确折叠并呈规则的空间结构.     

SHP-2蛋白NSH2结构域的原核表达和同位素标记

SHP-2蛋白是一种含有两个SH2结构域的磷酸酶。SHP-2的N端SH2结构域是细胞因子或病毒因子激活该蛋白的分子内靶点。对shp2基因进行信息学分析,设计引物通过PCR克隆出人SHP-2蛋白N端SH2结构域(NSH2)的DNA序列。重组到原核表达载体pGEX-2T中,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功高效率表达了可溶性NSH2蛋白。对蛋白进行15N同位素标记和纯化,并浓缩获得达到进行核磁滴定法结构研究的蛋白样品。     

sCAR—PPAb基因的原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化

为获得腺病毒受体sCAR与掌叶半夏蛋白（PPA）的亚基B（PPAb）的融合蛋白,将PPA6基因克隆入已构建的原核表达载体pQE30-sCAR中,经PCR和测序鉴定正确的重组质粒pQE30-sCAR-PPAb,转化大肠杆菌M15后荻得工程茵。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-PPAb。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,在42kD左右有一条明显的特异性蛋白条带。N时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-PPAb能提高Ad—EGFP对Kasumi-1的感染效率。     

半夏凝集素的分离纯化及其对HeLa细胞生长的影响

利用甘露糖-Sepharose4B亲和柱从半夏总蛋白中分离纯化得到一种12kD的半夏凝集素,经质谱分析明确其为半夏凝集素单体。将该12kD凝集素单体作用于体外培养的HeLa细胞,MTT法检测细胞活性并用倒置相差显微镜观察凝集素对HeLa细胞生长状态的影响。结果显示：低浓度（O．004、0．02、0．1mg／mL）半夏凝集素具有一定促进HeLa细胞增殖的作用;高浓度（0．5、1mg／mL）半夏凝集素有一定抑制Hela细胞增殖的作用。     

Selective Anti-Hepatoma Treated with Titanium Oxide Nanoparticles in vitro

1　ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎＳｏｍｅｉｎｏｒｇａｎｉｃｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｅｘｈｉｂｉｔａｎａｎｏｂｉｏｌｏｇｉ ｃａｌｅｆｆｅｃｔ[1,2 ] ,ｆｏｒｅｘａｍｐｌｅ ,ｗｉｔｈｉｎａｃｅｒｔａｉｎｓｉｚｅ ,ｐａｒｔｉｃｌｅｓｃａｎａｆｆｅｃｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌ’ｓｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｓｕｃｈａｓｇｒｏｗｔｈａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ[3] .Ｓｏｆａｒ ,ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＴｉＯ2ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｏｎｈｅｐａｔｏｍａｃｅｌｌｓｈａｓｎｏｔｂｅｅｎｒｅｐｏｒ…     

Selective anti-hepatoma treated with titanium oxide nanoparticles in vitro

Effects of titanium oxide (TiO₂) nanoparticles on Bel-7402 human hepatoma hepatoma cells and L-02 human hepatocytes at different times were observed. Using cell culture, cell growth curves of Bel-7402 cells and L-02 cells treated with TiO₂ nanoparticles were examined by MTT assay, and the cellular ultrastructure was observed by an analytical transmission electron microscope (ATEM). It is found that OD value of Bel-7402 cell treated with TiO₂ nanoparticles for 48–144h is obviously lower than that of control group (p<0.01). However the growth curve of L-02 cells is almost not affected by TiO₂ nanoparticles. ATEM and energy dispersive X-ray (EDX) analyses show that there are obvious vacuoles increased heterolysosome, and particles with high electron density which are confirmed to be TiO₂ nanoparticles in Bel-7402 cytoplasm. More interestingly, it is alse found that TiO₂ nanoparticle obviously inhibits the proliferation of hepatoma cells by altering lysosome activity and destroying cytoplasm structure. The inhibition on proliferation of hepatocytes by TiO₂ nanoparticles is much slighter. The results demonstrate that TiO₂ nanoparticle has different killing effects on cancer cell and normal cell. CAO Xian-ying: Born in 1962 Funded by the National Natural Science Foundation of China (No:39770225)     

凋亡因子（TRAIL）对癌细胞凋亡的机制研究

凋亡因子TRAIL（Tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand）能诱导肿瘤和转化细胞凋亡而不伤害正常细胞.TRAIL与细胞膜上死亡受体（death receptors,DR）结合,引发受体蛋白构象变化,经胞膜内受体死亡域（death domain,DD）募集接头蛋白FADD（Fas associateddeath domain）,再经过FADD的死亡效应域（death effector domain,DED）与凋亡蛋白解酶原-8/10（procaspase-8/10）的DED相互结合,形成DISC（death-inducing signaling complex）,引起凋亡蛋白解酶（caspase）级联反应,促使癌细胞凋亡.目前,可溶性重组人性化TRAIL（rhTRAIL）和抗DR4/5单克隆抗体已进入临床Ⅰ/Ⅱ期实验阶段.但绝大部分癌细胞对TRAIL有耐受或引起耐受,耐受机制主要是由于IAP（Inhibitor of Apoptosis Protein）,Bcl-2（B-cell lymphoma-2）及cFLIP（cellular FLICE/caspase 8-like inhibitory protein,胞质凋亡抑制蛋白）家族蛋白的过表达而产生.因此,为了克服TRAIL的耐受,已有多种小分子IAP和Bcl-2拮抗剂在研发并进行临床实验.至今尚无cFLIP拮抗剂的报导.     

羟基磷灰石纳米粒子对肝癌细胞PCNA表达的影响

为了研究羟基磷灰石(HAP)纳米粒子对肝癌细胞增殖细胞核抗原表达的影响,采用均匀沉淀法制备了均匀分散的纳米尺度的HAP纳米粒子。以0.56 mmol/L的HAP纳米粒子与Bel-7402肝癌细胞作用后,采用流式细胞技术检测细胞周期时相的变化,行免疫细胞化学法PCNA染色,形态学观察和定量分析细胞的PCNA表达。结果显示HAP纳米粒子能使Bel-7402细胞的细胞增殖周期阻滞于G1期,PCNA表达降低,与对照组比较有显著性差异(P<0.01)。HAP纳米粒子可能通过抑制PCNA的表达,起到抑制肝癌细胞增殖的作用。     

半夏软腐病内生拮抗放线菌的分离与鉴定

针对半夏生产过程中软腐病废水普遍和危害严重的现状,从7个半夏主产区的半夏植株上分离到47个内生放线菌,通过平板和组培苗拮抗活性筛选获得两个具有较强活性的菌株07JX3-2和07JX3-7,经形态、培养特征和生理生化实验鉴定,初步确定两个分离物均属于链霉菌属(streptomyces),至于其所在种有待进一步鉴定。两个拮抗菌株的获得为半夏软腐病的生物防治研究和应用奠定了基础。